鱼腥草黄酮对运动疲劳大鼠骨骼肌能量代谢的影响_任盼红.pdf

第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:新乡医学院三全学院骨干教师培养计划项目(SQ2022GGJS10)、河南师范大学教育科学基金项目(2021JK04)、河南省哲学社会科学规划项目(2021CTY031)Fund:Supported by the Sanquan College of Xinxiang Medical University Teacher Training Program(SQ2022GGJS10),the Henan Normal University Education Science Foundation(2021JK04),and the Philosophy and Social Science Program of Henan Province(2021CTY031)*通信作者:任盼红,硕士,讲师,主要研究方向为体育教育学和运动营养学。E-mail:*Corresponding author:REN Pan-Hong,Master,Lecturer,Sanquan College of Xinxiang Medical University,Unit 4,Building 1,Family College,Henan Normal University,Jianshe East Road,Muye District,Xinxiang 453003,China.E-mail: 鱼腥草黄酮对运动疲劳大鼠骨骼肌 能量代谢的影响 任盼红1*,聂梦俭2(1.新乡医学院三全学院,新乡 453003;2.河南师范大学体育学院,新乡 453007)摘摘 要要:目的目的 探究鱼腥草黄酮(Houttuynia cordata flavonoids,HCF)的抗疲劳作用及对运动疲劳大鼠骨骼肌能量代谢的影响。方法方法 通过灌胃低、中、高剂量 HCF,测定大鼠疲劳相关生化指标和骨骼肌线粒体能量代谢酶活性及相关基因表达水平。结果结果 与运动对照组相比,低、中、高剂量组大鼠游泳时间得到显著提高(P0.05),分别提高了 19.21%、38.41%、58.27%,肝糖原、肌糖原含量分别提高了 21.01%(P0.01)、42.79%(P0.01)、57.58%(P0.01)和 4.85%、36.43%(P0.01)、62.17%(P0.01),并显著降低了血乳酸、血尿素氮含量和肌酸激酶、乳酸脱氢酶活性(P0.05 或 P0.01);另外,显著提高了骨骼肌线粒体中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量以及 Ca2+-ATP 水解酶、H+-ATP 酶活性(P0.05 或 P0.01),显著降低了骨骼肌的氧化应激水平,同时激活了腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor-1,PGC-1)信号通路,提高了 AMPK、PGC-1、过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)、葡萄糖转运蛋白(recombinant glucose transporter,GLUT)的 mRNA 的表达水平。结论结论 HCF 可以显著提高大鼠的运动耐力,且呈剂量依赖关系,其作用机制可能与骨骼肌线粒体的能量代谢和 AMPK/PGC-1 信号通路有关。关键词关键词:鱼腥草;黄酮;运动疲劳;骨骼肌;线粒体;能量代谢 Effects of Houttuynia cordata flavonoids on energy metabolism of skeletal muscle in exercise-induced fatigue rats REN Pan-Hong1*,NIE Meng-Jian2(1.Sanquan College of Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China;2.School of Physical Education,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)ABSTRACT:Objective To investigate the anti-fatigue effect of Houttuynia cordata flavonoids(HCF)and its effects on energy metabolism in skeletal muscle mitochondria in exercise-induced fatigue rats.Methods Low,middle and high doses of HCF were given to rats by gavage to determine the fatigue-related biochemical indexes,the activity of energy metabolism enzymes in skeletal muscle mitochondria and the expression levels of related genes.Results Compared with the exercise control group,the swimming time of the low,medium,and high dose groups of rats was significantly DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.037第 11 期 任盼红,等:鱼腥草黄酮对运动疲劳大鼠骨骼肌能量代谢的影响 303 improved(P0.05),with increases of 19.21%,38.41%,and 58.27%,respectively.The content of liver glycogen and muscle glycogen were increased by 21.01%(P0.01),42.79%(P0.01),57.58%(P0.01),and 4.85%,36.43%(P0.01),and 62.17%(P0.01),respectively,and blood lactate,blood urea nitrogen content,creatine kinase,and lactate dehydrogenase activity were significantly reduced(P0.05 or P0.01);in addition,it also increased the content of ATP and the activities of Ca2+-ATPase and H+-ATPase in skeletal muscle mitochondria(P0.05 or P0.01),decreased the oxidative stress of skeletal muscle,and activated the amp-activated protein kinase(AMPK)/peroxisome proliferator-activated receptor-1(PGC-1)signaling pathway,the mRNA expression levels of AMPK,PGC-1,peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)and recombinant glucose transporter(GLUT)were increased.Conclusion HCF can significantly improve the exercise endurance of rats in a dose-dependent manner,and its mechanism may be related to the energy metabolism of skeletal muscle mitochondria and AMPK/PGC-1 signaling pathway.KEY WORDS:Houttuynia cordata;flavone;exercise-induced fatigue;skeletal muscle;mitochondrion;energy metabolism 0 引 言 运动性疲劳主要是由骨骼肌肌肉疲劳和机体能量失衡而引起,以致机体在特定水平上难以维持正常运动强度的一种生理现象1。运动性疲劳的产生机制较为复杂,大部分研究认为在一定时间内机体能源耗竭和代谢产物的短时堆积是造成运动疲劳最主要的因素,而身体的运动绝大部分都是由骨骼肌来完成,骨骼肌的能量代谢与机体的运动能力和运动耐力具有密切关系。在能量代谢过程中,葡萄糖主要在骨骼肌、肝脏等组织完成分解代谢,线粒体是三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的主要生成场所,骨骼肌在运动过程中则需要消耗大量的 ATP,线粒体中ATP 的生物合成和能量代谢对机体运动能力起着决定性作用2。因此,如何有效提高骨骼肌中线粒体能量代谢水平是目前运动营养学领域的研究重点。腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase,AMPK)/过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor-1,PGC-1)通路是调控线粒体生物合成和能量代谢最主要的通路之一。AMPK 是机体能量代谢总开关,同时也是 PGC-1 信号调控的起始调节物质。机体在受到一定外源刺激后,AMPK 会被诱导,进而激活 AMPK/PGC-1 信号通路,从而调控骨骼肌内 ATP 水平,进一步影响线粒体中 ATP 的生物合成3。另外,一定强度运动会诱导 AMPK 发生磷酸化,激活下游效应物过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR),继而促进线粒体内脂肪酸的氧化分解。同时,AMPK 还可激活细胞内葡萄糖转运蛋白(recombinant glucose transporter 4,GLUT4),使其从细胞囊泡中转位至细胞膜上,起到转运葡萄糖的作用,进而提高骨骼肌对葡萄糖的摄取能力4。相关研究进一步表明,机体处在运动疲劳状态下时,骨骼肌细胞内 ATP/磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)比值下降,通过补充食源性活性物质则可以提高 AMPK/PGC-1 信号通路上相关因子的表达能力,同时还能提高 GLUT4 的表达作用,提高骨骼肌内葡萄糖的分解能力,改善骨骼肌线粒体能量代谢,维持细胞内ATP/AMP 比值的稳定,从而使机体发挥抗疲劳作用5。目前,在运动疲劳方面,有较多的研究表明,黄酮具有清除体内活性氧、降低细胞脂质过氧化和提高抗氧化酶活性的作用67。研究表明,由于不同植物体内黄酮含量及黄酮成分具有较大差异,其表现出的药理活性会大不相同,当成分结构中含有较多酚羟基时,其抗氧化和抗疲劳活性会更强89。鱼腥草又名折耳根,因新鲜的根部和叶片有浓浓的鱼腥味而得名,在我国主要产于西南地区以及湖北、浙江等地。鱼腥草营养丰富,内含多种必需氨基酸、维生素、矿物质等,还含有丰富的功能活性物质,黄酮则为其主要的一个活性物质,含量达到 3%左右10。研究表明,鱼腥草黄酮(Houttuynia cordata flavonoids,HCF)中含有大量的槲皮苷,而一个槲皮苷分子结构中含有7个酚羟基,这使得其具有非常强的抗氧化和抗疲劳作用11。因此,本研究以鱼腥草为材料,首先通过超声波辅助乙醇提取并纯化鱼腥草黄酮,其次建立大鼠的运动疲劳模型,观察鱼腥草黄酮对疲劳大鼠骨骼肌能量代谢酶活性和氧化应激水平的影响,最后通过AMPK/PGC-1 信号通路探讨其对大鼠骨骼肌线粒体能量代谢的作用机制,为鱼腥草黄酮在运动功能食品领域的开发及应用提供科学参考。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 鱼腥草干粉,河南利欣制药股份有限公司提供;SPF级 SD 雄性大鼠,体重(18010)g,华兰生物疫苗有限公司,生产许可证:SCXK(豫)2020-0003,动物试验在本院药学院下河南省天然药物研究重点实验室开展,实验批准文号:202204-015。芦丁标准品(纯度99%,色谱级,成都乐美天医药科技有限);亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、丙酮、乙酸、氢氧化钠、盐酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);生化指标304 食品安全质量检测学报 第 14 卷 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);D301 大孔树脂(郑州阿尔法化工有限公司);引物合成(生物工程上海股份有限公司);0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液(上海麦克林生化科技股份有限公司)。1.2 仪 器 DB080 恒温游泳箱(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司);N-1210BS-WB 旋转蒸发仪(日本东京理化 Eyela);HWS-24 恒温水浴锅(上海慧泰仪器有限公司);ASK-101 电热 恒 温 干 燥 箱(深 圳 市 艾 斯 科 仪 器 设 备 有 限 公 司);JY98-IIIL 超声波细胞破碎仪(上海标隆仪器有限公司);FK-SY96S 多 功 能 酶 标 仪(山 东 方 科 仪器 有 限 公 司);ME104E 千分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);TD-5 台式低速离心机(四川蜀科仪器有限公司)。1.3 方 法 1.3.1 HCF 的纯化 参考孙美玲等12方法并作适当修改,称取 10 g 鱼腥草干粉,经 0.5 mm 筛网过滤后,在 45烘箱中烘至恒重,加入 300 mL 蒸馏水在 90水浴锅中水浴 1 h,加入无水乙醇 200 mL,在 50水浴锅中水浴 0.5 h,然后在超声仪中设置功率 250 W,超声时间 1 h,温度 50。超声处理结束后,5000 r/min 离心 10 min,小心吸取上层清液,旋转蒸发浓缩至约 50 mL,冷冻干燥后得黄酮粗提物。参考洪开文等13黄酮的纯化工艺,选取 D301 大孔树脂,将黄酮粗提物用 70%乙醇溶解配制一定浓度溶液,上样于吸附柱中,25恒温水浴摇床振荡吸附 24 h,最后的洗脱液旋转蒸发浓缩并冷冻干燥即得 HCF 纯化粉末。1.3.2 鱼腥草中总黄酮含量和纯化后黄酮的质量纯度测定 参考罗佳等14、鄢又玉等15的方法绘制芦丁标准曲线,以芦丁质量浓度(X,mg/mL)为横坐标,510 nm 下的吸光值(Y)为纵坐标,绘制回归标准曲线。得到标准曲线为Y=12.857X0.0024,r2=0.9996,根据标准曲线计算出溶液中总黄酮质量浓度并分别计算出黄酮得率和纯化后黄酮的质量纯度,公式见式(1)、(2):A/%=BCDE100%(1)a/%=bc100%(2)其中,A为黄酮得率(%),B为黄酮质量浓度(mg/mL),C为溶液体积(mL),D为稀释倍数,E为干粉质量(g);a为质量纯度(%),b为洗脱冻干后黄酮质量(g),c为黄酮粗提物质量(g)。1.3.3 大鼠运动疲劳模型(1)试验设计及剂量 SD 大鼠适应性饲养一周后,通过负重游泳淘汰不合格大鼠,将剩余大鼠进行随机分组,分为安静对照组(Q-CK)、运动对照组(E-CK)、鱼腥草黄酮低、中、高剂量组(分别记为 HCF-L、HCF-M、HCF-H),每组 10 只,Q-CK和 E-CK 大鼠每天灌胃无菌生理盐水,HCF 剂量参考周桃英16方法,并在前期试验的基础上,确定 HCF-L、HCF-M、HCF-H 各组每天灌胃剂量分别为 25、50、100 mg/kg 的鱼腥草黄酮,每天同一时间对大鼠进行称重,灌胃体积按照大鼠体质量 20 mL/kg,连续灌胃 28 d。其中 Q-CK 大鼠进行运动干预,E-CK、HCF-L、HCF-M、HCF-H 各组大鼠在灌胃结束后 1 h 进行 5%负重游泳 30 min,建立运动性疲劳模型。(2)大鼠血清生化指标和糖原含量测定 试验结束后的第 2 d 上午,分别从各处理组中随机选取5只大鼠进行负重游泳30 min,游泳结束后将大鼠毛发全部吹干并休息 60 min,通过麻醉后处死,静脉取血,1500 r/min 低温离心 10 min,留取血清。解剖大鼠后取骨骼肌肌肉组织和肝脏组织,预冷的 0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液清洗干净并用滤纸吸干组织表面水分,剪碎保存于冻存管中,样品80低温保存。采用试剂盒分别测定血清中血乳酸(blood lactic acid,BLA)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肝糖原(hepatic glycogen,HG)、肌糖原(muscle glycogen,MG)含量。(3)骨骼肌能量代谢相关酶活性检测 试验结束后的第 2 d 下午,再取各组剩余大鼠进行5%负重力竭游泳试验,游泳期间,用玻璃棒在大鼠周围进行轻微搅拌,确保大鼠四肢一直处于游泳状态。记录大鼠从放入水中到头部沉入水下 7 s 内的时间。试验结束后,立即处死大鼠,静脉取血,试剂盒测定血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。并解剖大鼠取出骨骼肌腓肠肌,测定 10%腓肠肌组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。同时试剂盒提取腓肠肌线粒体,检测 ATP 水平和骨骼肌线粒体中 Ca2+-ATP、Mg2+-ATP 酶和 H+-ATP 酶活性。(4)骨骼肌能量代谢 AMPK/PGC-1信号通路中相关基因 mRNA 的表达 实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测相关基因 mRNA的表达,采用 Trizol 一步法提取腓肠肌总RNA,根据TaKaRa的RNA反转录试剂盒说明书,配制反转录体系,反应体积 25 L,反应条件:37 15 min,85 5 s,4保存。继续配制逆转录-聚合酶链反应反应体系,在 96 孔 PCR 板中加入反应体积 25 L,设置反应条件,95 30 s;95 5 s,56 30 s,40循环;95 15 s,60 30 s,95 1 s。引物序列见表 1。以-actin 为内参,采用 2-Ct法对目的基因进行定量分析。1.4 数据分析 数据使用 Excel 2020 和 SPSS 22.0 处理,数据采用均值标准偏差(xs)表示,并通过单因素方差分析,P0.05),试验后 E-CK 大鼠体重显著低于其他组(P0.05),但均显著高于 HCF-L(P0.05),表明鱼腥草黄酮对大鼠因运动性疲劳导致的体重下降现象具有干预作用。表 2 大鼠试验前后体重变化(n=10)Table 2 Changes of body weights of rats before and after experiment(n=10)组别 试验开展前体重/g 试验结束后体重/g Q-CK 223.547.58a 296.7218.84a E-CK 225.478.64a 261.1812.58c HCF-L 228.227.41a 277.1819.35b HCF-M 223.588.76a 288.7418.47a HCF-H 229.738.46a 294.0519.84a 注:同列不同小写字母,表示差异显著(P0.05),下同。2.3 HCF 对大鼠运动耐力的影响 表 3 为大鼠的力竭游泳时间,与 E-CK 相比,HCF-L、HCF-M、HCF-H 游泳时间均显著增加(P0.05),且随着HCF 剂量的增加,游泳时间分别显著提高了 19.21%、38.41%、58.27%。说明灌胃鱼腥草黄酮可以缓解大鼠的运动疲劳,提高大鼠的运动耐力。表 3 大鼠力竭游泳时间 Table 3 Exhaustive swimming times of rats 组别 力竭游泳时间/min Q-CK 64.673.94c E-CK 56.444.22d HCF-L 67.285.27c HCF-M 78.124.84b HCF-H 89.336.65a 2.4 HCF对运动后大鼠肝糖原和肌糖原含量的影响 图 1 为 HCF 对大鼠体内 HG 和 MG 含量的影响,可知,与 Q-CK 相比,E-CK 大鼠体内 HG 和 MG 含量均明显降低(P0.01),表明大鼠在运动性疲劳中消耗了大量的 HG和 MG。与 E-CK 相比,HCF-L、HCF-M、HCF-H 中 HG 含量均极显著升高(P0.01),分别提高了 21.01%、42.79%、57.58%,与 HCF-L 相比,HCF-M、HCF-H 中 HG 含量分别极显著增加了 18.00%和 30.22%(P0.01),与 HCF-M 相比,HCF-H 中 HG 含量显著升高了 10.36(P0.05),而 HCF-M、HCF-H 中 MG 含量均极显著增加(P0.01),分别增加了 36.43%和 62.17%;与 HCF-L相比,HCF-M、HCF-H 中 MG 含量分别极显著增加了22.44%和 45.35%(P0.01),与 HCF-M 相比,HCF-H 中 HG含量显著升高了 18.71%(P0.05)。结果表明,补充鱼腥草黄酮可以有效提高大鼠体内 HG 和 MG 含量,对大鼠耐力的提高发挥着较好的作用。2.5 HCF 对运动后大鼠血清生化指标的影响 图 2 为大鼠血清 BLA 和 BUN 含量的变化趋势,图 2 中显示,与 Q-CK 相比,E-CK 大鼠血清 BLA 和 BUN 含量均呈显著增加(P0.01),说明运动性疲劳影响了大鼠的机体代谢,使得骨骼肌内乳酸代谢和蛋白质分解加快。与 E-CK 相比,HCF-L、HCF-M、HCF-H 中 BLA 含量均极显著降低(P0.01),分别降低了 18.47%、29.82%、39.66%,BUN 则分别降低了10.28%(P0.05)、22.28%(P0.01)、34.69%(P0.01)。与HCF-L 相比,HCF-M、HCF-H 中 BLA 和 BUN 含量均呈现明显降低,与HCF-M 相比,HCF-H 中BLA 和BUN 含量显著降低(P0.05)。从上述结果可知,大鼠在运动性疲劳过程中,306 食品安全质量检测学报 第 14 卷 注:与 Q-CK 相比,表示 P0.01;与 E-CK 相比,*表示 P0.05、*表示 P0.01;与 HCF-L 相比,表示 P0.05,表示 P0.01;与 HCF-M 相比,#表示 P0.05,#表示 P0.01,下同。图 1 HCF 对大鼠 HG 和 MG 含量的影响 Fig.1 Effects of HCF on HG and MG content in rats 图 2 HCF 对大鼠血清 BLA 和 BUN 的影响 Fig.2 Effects of HCF on serum BLA and BUN in rats 体内 BLA 和 BUN 水平会明显升高,而通过补充鱼腥草黄酮则可以逆转上述作用,可以有效降低血清内 BLA 和 BUN 含量,且随着 HCF 剂量的提高,这种降低作用越明显。2.6 HCF对力竭运动后大鼠肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性的影响 图 3 显示,与 Q-CK 相比,E-CK 大鼠中 CK 和 LDH活性明显升高,表明运动性疲劳对大鼠骨骼肌造成了一定程度损伤,使得骨骼肌细胞中 CK 和 LDH 大量渗透到血液中。与 E-CK 相比,HCF-L、HCF-M、HCF-H 中 CK 和 LDH活性均极显著降低(P0.01),分别降低了 14.36%、25.24%、43.17%和 20.32%、36.42%、53.17%;与 HCF-L 相比,HCF-M、HCF-H 中 CK 和 LDH 活性分别极显著降低了12.70%、33.64%(P0.01)和 20.20%、41.22%(P0.01);与HCF-M 相比,HCF-H 中 CK 和 LDH 活性分别显著降低了23.98%和 26.34%(P0.05)。说明补充鱼腥草黄酮可以明显降低大鼠血清中 CK 和 LDH 活性,能够有效缓解运动性疲劳对大鼠骨骼肌造成的损伤。2.7 HCF对力竭运动后大鼠骨骼肌线粒体能量代谢酶活性的影响 图4显示,与Q-CK相比,E-CK中大鼠骨骼肌内ATP含量极显著降低了 26.18%(P0.01),Ca2+-ATPase、H+-ATPase活性分别极显著降低了37.06%和32.52%(P0.01),表明运动疲劳降低了大鼠骨骼肌线粒体 ATP 的生成速率,同时抑制了参与线粒体能量代谢的相关酶活性。与 E-CK 相比,HCF-L、HCF-M、HCF-H 中大鼠骨骼肌线粒体 ATP 水平均极显著升高(P0.01),分别升高了 24.81%、66.65%、86.29%,其Ca2+-ATPase、H+-ATPase 活性则分别提高了 22.95%、62.40%、121.19%和 61.27%、74.41%、114.97%;与 HCF-L 相比,HCF-M、HCF-H 中 ATP 水平分别极显著提高了 33.52%、49.26%(P0.01),Ca2+-ATPase 分别极显著提高了 32.09%、79.90%(P0.01),H+-ATPase 活性分别显著提高了 8.15%(P0.05)、33.30%(P0.01)。结果表明,大鼠在运动疲劳状态下,补充鱼腥草黄酮可以提高骨骼肌内线粒体的新陈代谢,同时激活能量代谢相关酶活性,生成更多的ATP 来补充能量。第 11 期 任盼红,等:鱼腥草黄酮对运动疲劳大鼠骨骼肌能量代谢的影响 307 图 3 HCF 对大鼠 CK 和 LDH 活性的影响 Fig.3 Effects of HCF on CK and LDH activities in rats 图 4 HCF 对大鼠骨骼肌线粒体能量代谢酶活性的影响 Fig.4 Effects of HCF on the activity of energy metabolism enzymes in rat skeletal muscle mitochondria 2.8 HCF对力竭运动后大鼠骨骼肌氧化应激的影响 SOD、CAT、GSH-Px 等组成了骨骼肌细胞内抗氧化防御系统,从图 5 可知,与 Q-CK 相比,E-CK 大鼠骨骼肌内抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性极显著降低(P0.01),MDA 含量则极显著升高(P0.01),表明运动性疲劳对大鼠骨骼肌产生了明显的氧化应激作用,抑制了抗氧化酶活性;与 E-CK 相比,HCF-L、HCF-M、HCF-H 中大鼠骨骼肌内抗氧化酶活性均得到了显著升高(P0.05 或P0.01),MDA含量均显著降低(P0.01);另外,与 HCF-L 相比,HCF-M、HCF-H 中 SOD、CAT、GSH-Px 活性均极显著增加(P0.01),MDA 含量则极显著降低(P0.01)。说明补充鱼腥草黄酮可以有效提高运动疲劳下大鼠骨骼肌内抗氧化酶活性,缓解疲劳对大鼠骨骼肌造成的氧化损伤,且随着黄酮剂量的提高,抗氧化酶活性随之明显提高。2.9 HCF对力竭运动后大鼠骨骼肌线粒体能量代谢基因表达的影响 从图 6 可知,与 Q-CK 相比,E-CK 的大鼠骨骼肌中AMPK、PGC-1、GLUT-4基因的 mRNA 相对表达水平均 308 食品安全质量检测学报 第 14 卷 图 5 HCF 对大鼠骨骼肌细胞内抗氧化酶活性和 MDA 含量的影响 Fig.5 Effects of HCF on antioxidant enzyme activity and MDA content in rat skeletal muscle cells 图 6 补充 HCF 下大鼠骨骼肌能量代谢相关基因 mRNA 的相对表达 Fig.6 Relative expression of mRNA of energy metabolism-related genes in rat skeletal muscle after HCF supplementation 第 11 期 任盼红,等:鱼腥草黄酮对运动疲劳大鼠骨骼肌能量代谢的影响 309 极显著降低(P0.01),说明运动性疲劳在某种程度上可以抑制大鼠骨骼肌中参与能量代谢相基因的表达。与 E-CK相比,补充鱼腥草黄酮的各剂量组(HCF-L、HCF-M、HCF-H)中AMPK、PGC-1、PPAR、GLUT-4的 mRNA表达量均极显著升高(P0.01),当提高 HCF 的剂量时,相关基因 mRNA 的表达量均随之极显著升高(P0.01),其中 HCF-H 中基因的相对表达最显著。结果表明,大鼠在运动性疲劳过程中,通过补充鱼腥草黄酮可以提高骨骼肌中能量代谢相关基因 mRNA 的表达,进而提高线粒体的能量代谢。3 讨 论 3.1 HCF 对大鼠运动耐力和体内糖代谢的影响 负重游泳是建立运动性疲劳的经典模型之一,而通过测量力竭游泳时间,可以判断机体的运动耐力17。在本研究中运动性疲劳对照组大鼠的游泳时间最短,显著低于安静对照组,在负重游泳过程中通过补充 HCF后,低、中、高剂量组的游泳时间均明显高于运动对照组,且补充剂量越高,大鼠游泳时间越长。结果表明,HCF 具有提高大鼠运动耐力的作用,发挥出了较好的抗疲劳活性。影响机体运动耐力的因素有很多,一些研究表明,通过提高体内 HG、MG 含量,以及降低血清中 BLA 和 BUN含量均能够提高机体的运动耐力1819。HG、MG 是体内主要的能源储备形式,HG 在肝脏内优先对机体运动提供能量,骨骼肌中的 MG 则通过糖酵解为机体供能,糖原供能的时间越长,机体反应疲劳的时间则越短,其运动耐力越好。本研究结果显示,与运动对照组相比,补充HCF 的各处理组大鼠内 HG 和 MG 含量均得到了明显的提高,其中高剂量组中 HG 和 MG 含量均高于安静对照组,表明 HCF 对大鼠运动耐力的提高与体内 HG 和 MG含量的增加存在紧密关系,这一研究结果与周桃英16、邵哲等20在鱼腥草黄酮和红托竹荪菌托黄酮对小鼠的抗疲劳研究结果相似。机体在运动性疲劳中,糖脂代谢为机体提供大量能量,当糖脂代谢难以补充机体的能量损耗时,体内的一些氨基酸和蛋白质则会分解为机体供能,此时,体内会产生大量的代谢产物如 BLA 和 BUN,这些堆积的代谢产物会进一步加剧机体的疲劳感。研究表明,通过减少代谢产物在体内的堆积可以提高小鼠的运动耐力。本研究结果中,运动对照组大鼠体内 BLA 和BUN 含量均显著高于其他组,补充 HCF 后明显降低了BLA 和 BUN 含量。杨果等21研究结果显示补充西番莲果皮黄酮后小鼠体内 BLA 和 BUN 含量显著降低,小鼠运动时间显著增加,这与本研究结果相一致。表明 HCF具有降低 BLA和 BUN含量的作用,从而提高大鼠的运动耐力。3.2 HCF 对大鼠骨骼肌能量代谢酶活性的影响 CK 和 LDH 是参与骨骼肌能量代谢比较重要的两种酶,CK 可以催化肌酸磷酸化产生大量 ATP,LDH 则具有调控糖酵解产生 ATP 的作用22。机体在运动疲劳状态下,产生的乳酸会破坏内环境,使肌细胞膜的通透性增大,导致血液中 CK、LDH 含量增大,所以血液中这两种酶活性高低可以判断机体的疲劳程度23。本研究结果显示,与安静对照组相比,运动对照组大鼠 CK 和 LDH 活性明显升高,而与运动对照组相比,补充 HCF 组大鼠 CK 和 LDH 活性均显著降低,且降低趋势与剂量呈显著正相关。李欣24在研究辣木叶黄酮对小鼠运动疲劳的影响时,发现黄酮可以降低血清中 CK 和 LDH 活性,具有缓解小鼠运动疲劳的作用,该研究结果与本研究结果相似。运动性疲劳在一定程度上会引起机体的氧化损伤,而通过补充外源活性物质可以降低细胞氧化应激水平,提高机体的抗疲劳作用2527。大量研究结果表明,黄酮具有较强的体内和体外抗氧化效果2829,黄酮的抗氧化作用与其组分结构密不可分,彭丽华30和廖卫波等31研究均表明,鱼腥草黄酮中含有大量的槲皮苷和槲皮素,杜伊晗等32研究表明,槲皮素的抗氧化效果显著高于黄酮类的其他组分,张海浩33研究表明,槲皮苷具有较强的抗运动疲劳作用。这些研究表明,鱼腥草黄酮具有较强的抗氧化和抗疲劳作用。在机体内抗氧化体系中,SOD、CAT、GSH-Px是机体重要的抗氧化酶系,通过清除过多的氧自由基,降低细胞的氧化应激水平,缓解细胞的氧化损伤34。本研究结果表明,大鼠在运动疲劳状态下,骨骼肌中 SOD、CAT、GSH-Px 活性均显著低于安静对照组,MDA 含量则显著高于安静对照组,在补充 HCF 后,随着剂量的提高抗氧化酶活性随之显著提高,MDA含量则随之显著降低。ZHANG 等35和 BAO 等36分别在研究柠檬籽黄酮和柠檬皮黄酮的抗疲劳活性时,表明黄酮可以提高小鼠骨骼肌抗氧化水平进而提高运动耐力,这与本研究结果一致,表明 HCF 能够提高大鼠骨骼肌中抗氧化酶活性,起到增强大鼠运动能力的作用。3.3 HCF对大鼠骨骼肌线粒体能量代谢相关基因表达的影响 研究表明骨骼肌中AMPK/PGC-1信号通路是促进线粒体合成的主要通路之一,AMPK作为体内细胞能量代谢的感受器,对维持能量稳态起着重要作用,高表达的PGC-1可以促进线粒体转录复制,提高糖脂代谢和细胞中 ATP 含量37。PPAR为该信号通路的下游效应因子,可以感受细胞中 ATP 水平,调节糖代谢和脂肪水解,GLUT4310 食品安全质量检测学报 第 14 卷 能够将胞外葡萄糖转运至细胞内,促进其氧化分解,生成更多的 ATP38。本研究结果中,运动对照组大鼠骨骼肌内AMPK、PGC-1、PPAR、GLUT4的 mRNA 表达水平最低,在补充 HCF 后,4 个基因的表达水平出现了显著升高,且随着剂量的增加,各基因表达水平逐渐显著提高。陈祎等39研究发现,骨骼肌能量代谢紊乱的大鼠中AMPK、p-AMPK、PPAR、PGC-1的表达水平会出现明显下降,补充外源物会激活骨骼肌中 AMPK/PPAR/PGC-1通路,使相关基因表达水平出现大幅提高,从而增强线粒体功能,改善骨骼肌的能量代谢,董佳萍40研究发现补充金雀异黄素后的大鼠骨骼肌中AMPK、PPAR、PGC-1的 mRNA 表达量显著高于运动模型组。这些研究结果均与本研究结果相似,说明补充 HCF 可以激活大鼠骨骼肌 AMPK/PGC-1信号通路,提高线粒体能量代谢相关基因 mRNA 的表达,从而达到缓解运动疲劳的作用。4 结 论 综上,本研究通过超声波辅助乙醇提取鱼腥草黄酮,并通过大孔树脂进行纯化,得到黄酮提取率为 2.96%,纯化效率为 86.35%。大鼠运动疲劳模型结果显示,与运动对照组相比,HCF 显著延长了大鼠的力竭游泳时间,提高了HG、MG 含量并降低了 BLA、BUN 含量,同时还降低了血清中 CK、LDH 活性,提高了线粒体中 ATP 含量以及Ca2+-ATPase、H+-ATPase 活性;另外,HCF 还降低了骨骼线细胞中氧化应激水平,维持了细胞的氧化与抗氧化平衡,有效提高了大鼠的运动耐力。在骨骼肌能量代谢机制中发现,运动性疲劳会抑制 AMPK/PGC-1信号通路中相关基因mRNA的表达,而HCF具有激活该