一种简易快速的肺炎克雷伯菌电镜观察负染方法.pdf

：引用本文格式：贾成林，戴文敬一种简易快速的肺炎克雷伯菌电镜观察负染方法湖北医药学院学报，（）：一种简易快速的肺炎克雷伯菌电镜观察负染方法贾成林，戴文敬（十堰市中医医院；湖北医药学院生物医药研究院，湖北 十堰）关键词 肺炎克雷伯菌；菌毛；负染；透射电镜通信作者戴文敬（），女，湖北天门人，助理实验师，硕士，研究方向：超微病理学。：肺炎克雷伯菌是一种常见的革兰阴性杆菌，是社区获得性肺炎的主要致病菌，在临床上对患者的影响较大，不仅可以引起常见的呼吸道感染，还可能侵入血液循环从而引起败血症或脓毒血症。目前对肺炎克雷伯菌的研究也较多，主要采用透射电镜、扫描电镜对其超微结构进行研究。而对菌毛的研究，最简便快速的方法是用负染色法进行前期处理后使用透射电镜观察。负染技术包含了样品悬液制备、样品吸附、漂洗、染色等多重步骤，每一步的操作都会影响最终结果。为了更好地辅助临床和科研工作者对肺炎克雷伯菌的研究，本文对电镜观察肺炎克雷伯菌的前期处理方法做了相关研究，通过对其进行负染得到较为满意的电镜图片。材料与方法 材料 菌株肺炎克雷伯菌野生株由湖北医药学院李蓓教授团队提供。首先将细菌从 冰箱活化，然后将 值调到，转接一次培养 ，连续转接 次，使用第 次培养得到的菌液进行菌毛观察实验。仪器与试剂 透射电子显微镜（日本日立公司，型号：）、目碳支持膜铜网、电镜专用镊子、醋酸双氧铀（美国 公司，型号：，生产批号：）、氯化钠溶液、双蒸水。方法 醋酸铀染色液的配制及保存按照经典透射电镜染液的配制方法：醋酸双氧铀 ，溶于 的双蒸水中，充分摇匀约 ，在 冰箱静置 ，取上清分装后避光保存在 冰箱中备用。样品的吸附与漂洗将封口膜剪取一段，将洁净的一面朝上粘贴在玻璃培养皿中，将培养肺炎克雷伯菌的液体培养基用吸管吸取一滴在封口膜上，形成一个拱起的小液滴，将覆有碳支持膜的铜网倒扣在菌液上，吸附 ，随后夹走铜网，多余液滴用滤纸吸走。铜网在预先滴在封口膜上的 氯化钠溶液漂洗液中蘸取一下，用滤纸吸除多余的液滴。染色将封口膜洁净的一面朝上粘贴在玻璃培养皿中，使用前撕下封口膜上方的粘贴纸，将醋酸双氧铀染液滴在封口膜上，待上一步样品漂洗结束铜网快干时，将铜网倒扣在醋酸双氧铀染液中分别染色 、，随即在滴在封口膜上的双蒸水漂洗液中蘸取一下洗掉多余的染液，用滤纸毛边在铜网边缘吸干后即可上透射电镜观察。结果在 透射电镜下观察到肺炎克雷伯菌浓度及密度适中，未发现明显的细菌细胞壁的破损，未发现明显的染液污染。染色 的样品轮廓稍显模糊，菌毛不清晰，立体感不强（图）；染色 的样品轮廓清晰，菌体和菌毛颜色适中，菌毛保存好，未发现明显的损伤，结构清晰可见（图）；染色 的样品轮廓清晰，但菌体和菌毛着色过深，立体感不强（图）。对于肺炎克雷伯菌野生株菌液的常规负染实验，使用漂浮法进行样品的吸附和染色效果理想，使用 氯化钠溶液进行吸附后漂洗得到的图片背景干净，醋酸双氧铀对肺炎克雷伯菌野生株染色 菌体和菌毛清晰，颜色适中，适合细菌菌毛的观察。湖北医药学院学报（）网址：年 月，（）图 肺炎克雷伯菌负染 透射电镜图像，菌体轮廓欠清晰，菌毛隐约可见 图 肺炎克雷伯菌负染 透射电镜图像，菌体和菌毛轮廓清晰，颜色适中，菌毛立体感强 图 肺炎克雷伯菌负染 透射电镜图像，菌体和菌毛轮廓清晰，但着色过深，立体感不强 讨论目前对于细菌超微结构观察的方法主要有负染方法和制作树脂切片两种。负染方法一般使用醋酸双氧铀或磷钨酸等重金属染液对生物标本周围进行填充，在透射电镜下观察，其轮廓显示电子密度较高，而与周围背景进行区分，操作相对简单、快速，但是由于分辨率相对较低，许多细小结构无法分辨，只能作为表面形态的研究，无法显示其内部的三维结构，。制作树脂切片需要涉及取材、固定、浸洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片、染色和电镜观察 个主要程序，每一步的操作细节都决定了最终超微结构的成败，并且耗时长，菌毛结构不易保存，适合细菌内部超微结构的观察。由于多数情况下磷钨酸对病毒的染色效果比较好，本文利用醋酸双氧铀作为染色剂对肺炎克雷伯菌进行负染，该方法可以对肺炎克雷伯菌的外形及菌毛做更准确的观察，并且制样和染色方法简单，节省时间，可以快速对肺炎克雷伯菌进行观察，有效避免传统制样方法固定、制样、切片等复杂操作环节费时费力的问题，对菌毛保存较差、实验周期较长等缺点，以及高压冷冻制样对仪器要求高，操作复杂等情况，值得在实验中进行推广使用。本法操作时，有几点需要注意：用吸管吸取菌液时动作要轻柔，避免损伤细菌菌毛，造成结果不准确。在醋酸双氧铀的配置、储存和染色操作时一定要注意避光，并储存在 的低温环境，并且，由于醋酸双氧铀具有一定的放射性，一定要做好自身的防护，使用完毕后需将废液回收，统一进行处理，不可随意倾倒丢弃，造成对环境的污染。由于该方法未对细菌进行灭活处理，在实验过程中需严格佩戴口罩、手套，穿防护服，在实验结束后需第一时间用 酒精对器皿进行消毒，并对制样环境进行紫外线消毒，确保实验环境安全和人员的身体健康。参 考 文 献，：，（）：丁明孝，梁凤霞，洪健生命科学中的电子显微镜技术北京：高等教育出版社，：胡晓梅，饶贤才医学微生物学实验指南北京：科学出版社，：邹方东，苏都莫日根，王宏英，等细胞生物学实验指南 版北京：高等教育出版社，辛 华现代细胞生物学技术北京：科学出版社，：汪克建医学电镜技术及应用北京：科学出版社，：张芳成，程 丹，孙小玲，等儿童遗传代谢性肝病的超微病理学观察电子显微学报，（）：，（）：收稿日期（本文编辑：邴云云）贾成林，等一种简易快速的肺炎克雷伯菌电镜观察负染方法