贮藏和液体培养条件对文冠果花粉萌发的影响_黄晓梅.pdf

贮藏和液体培养条件对文冠果花粉萌发的影响黄晓梅，李春雨，邢加浩，刘洪慧，张 锦，李佳宸(潍坊学院，山东潍坊 261061)摘要 目的 优化改善文冠果花粉离体萌发培养基。方法 以新鲜文冠果花粉为试验材料，采用液体培养法，测定蔗糖、硼酸和钙对文冠果花粉离体萌发特性及花粉管长度的影响，筛选适合文冠果花粉离体培养液体培养基成分的最佳浓度。测定不同贮藏温度(70、20、4、25)及不同贮藏时间(2、5、10 d)下，文冠果花粉萌发率的变化。结果 通过控制单一因素变量试验，文冠果花粉离体萌发的液体培养基最佳组分为 15%蔗糖+002%硼酸+001%钙离子(硝酸钙)，萌发率达 925%，花粉管长达 161 mm;而在花粉管生长过程中需要的钙离子浓度为 004%。70 超低温贮藏花粉有利于保持花粉生活力，20 冷冻贮藏次之，4 低温贮藏不利于保持花粉生活力，25 恒温贮藏会大大降低花粉生活力。结论 该研究可为文冠果花粉离体培养的液体培养基最佳组分配方提供参考依据，也为文冠果花粉贮藏研究奠定基础。关键词文冠果;花粉萌发;贮藏;生活力中图分类号S5659文献标识码A文章编号05176611(2023)07013104doi:103969/jissn05176611202307031开放科学(资源服务)标识码(OSID):Effects of Storage and Liquid Culture Conditions on Xanthoceras sorbifolium Pollen GerminationHUANG Xiao-mei，LI Chun-yu，XING Jia-hao et al(Weifang University，Weifang，Shandong 261061)Abstract Objective In order to optimize and improve the culture medium of Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro MethodThe effects of sucrose，boric acid and calcium ion on the germination rate of Xanthoceras sorbifolium pollen and pollen tube length were meas-ured by liquid culture method，which fresh pollen was used as experimental material So as to screen out the best concentration of liquid medi-um components suitable for Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro At the same time，the changes of pollen germination rate ofXanthoceras sorbifolium were measured under different storage temperatures(70，20，4，25)and different storage times(2，5，10 d)esult The results showed that through controlling the single factor variable test，the optimal medium group that promoted in vitro germinationrate of pollen of Xanthoceras sorbifolium was 15%sucrose+002%boric acid+001%calcium ion(calcium nitrate)，the germination rate was925%，and the pollen tube length was 161 mm While the concentration of calcium ion needed in the process of pollen tube growth was 004%The statistics indicates that 70 cryogenic storage of pollen was beneficial to keep the vitality of pollen，and 20 refrigerated storagetimes，4 low temperature storage was not conducive to maintain vitality of pollen，25 constant temperature storage will greatly reduce thevitality of pollen Conclusion This study can provide reference basis for the optimal formula of liquid medium for Xanthoceras sorbifolium pol-len germination in vitro，and lay a foundation for the study of Xanthoceras sorbifolium pollen storageKey wordsXanthoceras sorbifolia;Pollen germination;Storage;Pollen vitality基金项目国家自然科学基金项目(31301733);潍坊学院博士基金资助项目(2012BS19);山东省高等学校科技发展计划资助项目(J18KA157);潍坊学院大学生研究计划项目(WFUSTP-2020L24)。作者简介黄晓梅(1997)，女，广西藤县人，从事植物花粉发育与萌发研究。收稿日期20220603;修回日期20230104文冠果(Xanthoceras sorbifolia)是我国北方常见落叶灌木，属无患子科。其根系发达且分布面积广，有利于水分吸收和贮藏，在多种极端土壤环境条件下都能够生长，是防治风沙、治理荒漠的首选优良树种;文冠果花期由于满树繁花、鲜艳美丽而具有很高的观赏性;其果实集保健与药用价值一身1。因此，目前对文冠果的研究较为热点，对其花粉离体萌发的研究也有不少报道，但在花粉培养的最适培养基成分和培养方法方面存在较大差异。如刘武林等2 采用悬滴法进行文冠果花粉培养;有学者采用半固体培养基，其培养基中均加入了琼脂，如吴月亮等3 加入 5%6%琼脂，李强峰等4 采用 1%琼脂。李强峰等4 研究表明，培养基中最佳蔗糖浓度为 02%，而刘武林等23 所测得的结果为 10%15%，二者蔗糖溶液浓度相差较大。硼酸是文冠果花粉萌发最重要的元素之一，001%002%硼酸可较好地促进文冠果花粉萌发，但是过高浓度会导致花粉萌发数量下降。针对培养基中钙离子的研究，吴月亮等5 研究表明，钙离子对文冠果花粉离体萌发促进作用不大，培养基中可不加入钙离子。在文冠果花粉贮藏温度和贮藏时间试验中，吴月亮等3，5 控制贮藏时间和贮藏温度 2 个因素变量，测定了文冠果花粉最适贮藏温度。笔者采用与前人不同的液体培养基对文冠果花粉进行培养，筛选培养基中蔗糖、硼酸、钙离子(硝酸钙)的最佳浓度，同时对文冠果花粉贮藏温度和贮藏时间进行探究，以期为研究文冠果杂交育种及花粉长期贮藏提供科学依据。1材料与方法11试验材料试验材料为潍坊市人民广场种植的文冠果树，于每天 06:00 采集当天开放的花朵，取下花粉进行不同处理。试验中采用的花粉均为当天采集的同一批次花粉，贮藏花粉为第一批次采集的花粉。12试验方法121花粉离体萌发预试验。文冠果花粉离体培养先进行预试验，目的是观察花粉离体培养过程是否需要光照。将新鲜花粉接种到 15%蔗糖+001%硼酸+001%钙离子液体培养基上，在光照和黑暗环境下 25 恒温培养，培养 1、2、3、4、5 h 分别取出观察。文冠果花粉离体培养在光照条件下花粉萌发率要高于黑暗条件下(图 1)，同时文冠果花粉萌发在4 h时即可观察。122花粉培养最适培养基组分测定。蔗糖浓度设为0(CK，空白对照组)、5%、10%、15%、20%、25%、30%，培养安徽农业科学，JAnhui AgricSci 2023，51(7):131134，141基中硼酸和钙离子浓度均为 001%。硼酸浓度设置为 0(CK)、001%、002%、003%、004%、005%、010%;将第 1步测定的最适蔗糖浓度加入培养基中，同时将钙离子浓度设置为 0.01%最低水平。最后，钙离子(硝酸钙)浓度设置为0(CK)、001%、002%、003%、004%、005%、010%。将以上 2 步测定蔗糖和硼酸浓度作为测定最适钙离子浓度培养基成分的浓度。在涂有凡士林凹槽的载玻片上滴配置好的培养基，用镊子轻轻夹起开裂的花药将新鲜花粉抖落在培养基上，在培养皿中放置 1 张湿滤纸，保持湿度，然后将载玻片放在培养皿滤纸上，25 恒温培养 4 h 后，显微镜下记录并观察，同时测量花粉管长度。注:A 为光照条件;B 为黑暗条件。Note:A was light conditions;B was dark conditions图 1不同培养条件下文冠果花粉萌发状况Fig1Pollen germination of Xanthoceras sorbifolium under different culture conditions123花粉最适贮藏温度测定。将文冠果花粉用镊子取下用硫酸纸包好后贴上标签，分别装入 4 个药品袋中，然后将药品袋分别放入70 超低温冷冻箱，20 和4 冰箱冷藏，25 电热恒温培养箱中。分别在第 2 天、第 5 天、第 10 天取出，在培养基中放置适量花粉，采用上述方法培养 4 h 后，统计花粉萌发率。2结果与分析21文冠果花粉培养最适培养基筛选211蔗糖对文冠果花粉萌发的影响。由表 1 可知，不同浓度蔗糖对文冠果花粉萌发率影响较大，与CK 对比可知，蔗糖能明显提升文冠果花粉离体萌发率，其中蔗糖浓度为 15%时，最有利于花粉萌发(图 2A)，花粉萌发率达 92.9%。蔗糖浓度为 5%20%时，文冠果花粉萌发率在 821%92.9%，相差不大。当培养基中蔗糖浓度为 25%时，文冠果花粉萌发率为 486%，萌发率大幅下降，花粉萌发严重受到抑制。当蔗糖浓度达到 30%时，萌发率很低，仅 21%(图 2B)。表 1不同蔗糖浓度下文冠果花粉萌发和花粉管生长Table 1Effect of different concentration of sucrose on pollen germina-tion and pollen tube length of Xanthoceras sorbifolium蔗糖浓度Sucrose concentration%花粉萌发率Pollen germinationrate%花粉管长度Pollen tubelengthmm0(CK)2240225821165108711861592912420858074254860563021008注:A 为 15%蔗糖;B 为 30%蔗糖。Note:A was 15%sucrose;B was 30%sucrose图 2不同蔗糖浓度下文冠果花粉萌发情况Fig2Pollen germination changes of Xanthoceras sorbifolium under different sucrose concentration231安徽农业科学2023 年低浓度蔗糖有利于文冠果花粉管的生长，花粉管生长的最佳蔗糖浓度为 10%，长度达 186 mm。当蔗糖浓度在 5%15%时，花粉管的生长快速，长度较长，为 124186 mm。当蔗糖浓度达到 25%及以上时，由于文冠果花粉萌发受到抑制，因此花粉管的伸长也受到影响，仅 008056 mm(表 1)。212钙对文冠果花粉萌发的影响。由表 2 可知，钙(硝酸钙)可促进文冠果花粉萌发，钙浓度为 001%时最有利于文冠果花粉萌发。对比 CK 可以看出，当培养基中加入钙后文冠果花粉萌发率均有一定程度的提高，001%010%钙浓度对文冠果花粉萌发均表现出提升效果，无抑制作用产生。因此，若研究文冠果花粉萌发试验，可添加 001%最低水平钙离子溶液，从而使花粉萌发率有一定提高。从花粉管长度数据可见，钙离子对文冠果花粉管生长有一定影响。与 CK 相比，添加 004%钙离子后，花粉管长度达 110 mm(图3A)，远长于 CK 的045 mm(图3B);在钙离子达010%时，花粉管长 047 mm，与 CK 相差不大，说明高钙会抑制花粉管的生长。因此，研究花粉管生长的最适培养基中需添加 004%钙离子。表 2不同钙离子浓度下文冠果花粉萌发和花粉管生长Table 2Effects of different concentrations of calcium on pollen ger-mination and pollen tube length of Xanthoceras sorbifolium钙离子浓度Calcium ionconcentration%花粉萌发率Pollen germinationrate%花粉管长度Pollen tubelengthmm0(CK)837045001902043002889068003871072004894110005869068010864047注:A 为添加钙离子培养基;B 为 CK。Note:A was medium supplemented with calcium ions;B was control group图 3不同钙离子浓度下文冠果花粉管生长情况Fig3Pollen tube growth of Xanthoceras sorbifolium with different calcium ion concentration213硼酸对文冠果花粉萌发的影响。由表 3 可知，硼酸可促进文冠果花粉萌发，相比 CK，低浓度硼酸能刺激花粉萌发，提高花粉萌发率。硼酸浓度为 001%0.05%时，花粉萌发率为 897%925%，低浓度硼酸对文冠果花粉萌发均具有一定促进作用。当硼酸浓度为 010%时，文冠果花粉萌发率大幅度降至 563%，远低于 CK(825%)，说明硼酸浓度过高会产生抑制效果。因此，文冠果花粉萌发的最适培养基为表 3不同硼酸浓度下文冠果花粉萌发和花粉管生长Table 3Effect of boric acid on pollen germination and pollen tubelength of Xanthoceras sorbifolium硼酸浓度Boric acidconcentration%花粉萌发率Pollen germinationrate%花粉管长度Pollen tubelengthmm0(CK)82506700191211800292516100391412300490611500589709501056308715%蔗糖+002%硼酸+001%硝酸钙。硼酸可加速文冠果花粉管的生长速度，利于花粉管伸长的硼酸浓度为 002%，该浓度下花粉管粗细均匀，长度达1.61 mm(图 4A);010%高硼酸环境会导致花粉管弯曲且尖端膨大，长度较短，仅有 087 mm(图 4B)。与 CK 相比可以看出，硼酸浓度 001%010%对花粉管的伸长均具有促进效果，但高浓度硼酸反而会导致花粉管生长畸形。22文冠果花粉贮藏条件由图 5 可知，文冠果同一批次新鲜花粉初始时的花粉萌发率为 8912%，随着贮藏温度升高，贮藏时间延长，花粉萌发率均出现不同程度降低。70 超低温贮藏条件下文冠果花粉萌发率变化不大，在 2和 5 d 时花粉萌发率为 8875%和 8732%，在贮藏 10 d 时花粉萌发率仍可以达到 8651%。20 低温冷冻条件下，文冠果花粉的萌发率在短时间内仍能保持较高水平，在贮藏2和 5 d 花粉萌发率分别为 8782%和 8554%，10 d 花粉萌发率为 8053%，可见在贮藏 10 d 文冠果萌发率出现较大下降。4 低温冷藏条件下，文冠果花粉萌发率出现略微降低，在 2、5 和 10 d 时花粉萌发率分别为 8572%、78.65%和33151 卷 7 期黄晓梅等贮藏和液体培养条件对文冠果花粉萌发的影响70.28%。25 常温贮藏条件下，文冠果花粉萌发率明显下降，在贮藏2 d 时文冠果花粉萌发率为 7136%，较初始情况下有明显下降，在贮藏 5 d 时花粉萌发率为 5675%，还有近 50%的花粉具有生活力，在10 d 后文冠果花粉萌发率仅 4.87%，表示文冠果花粉大量失去活力，说明常温不利于文冠果花粉的贮藏。可见，文冠果花粉在70 条件下有利于长期保存，20和4 次之，适合短期文冠果花粉保存，25 常温条件不利于文冠果花粉的保存，在贮藏10 d 后花粉基本失去活力。注:A 为 002%硼酸;B 为 010%硼酸。Note:A was 002%boric acid in the medium;B was 010%boric acid in the medium图 4不同硼酸浓度下文冠果花粉管生长情况Fig4Pollen tube growth of Xanthoceras sorbifolium with different boric acid concentration图 5不同贮藏时间下文冠果花粉萌发情况Fig5Pollen germination of Xanthoceras sorbifolium at differentstorage time3讨论相关研究表明，多数植物69 所需的蔗糖浓度为 10%25%，而在文冠果培养基中蔗糖浓度为 02%4，文冠果所需蔗糖浓度为 10%15%23，5，对此差异较大的蔗糖浓度可能是不同地区、不同气候下植物生长差异所致。该试验发现，文冠果花粉离体萌发过程中，蔗糖浓度过低，会使文冠果花粉管在培养前期吸水膨胀，甚至出现破裂等情况。该试验中文冠果花粉萌发最适蔗糖溶液浓度为 15%，花粉管生长蔗糖溶液最适浓度为 10%，这与刘武林等23，5 研究结果一致。植物花粉离体萌发过程一般都需在培养基中添加适量硼酸1012，而在文冠果花粉培养中，刘武林等2 研究指出，培养液中不加入硼酸溶液时，文冠果花粉基本不会萌发，萌发率低于 3%。但该试验中不加入硼酸时，花粉萌发率仍可以高达 825%，这与刘武林等2 的研究结果不同，可能是由于该试验中液体培养基组分中含有钙离子(硝酸钙)，而刘武林等2 的培养基中未加入钙离子，推测在文冠果花粉离体萌发过程中，钙离子可在某种程度上替代硼酸，从而促进硼酸离子空白对照组中的花粉萌发率仍可以达到较高水平。该试验 002%硼酸最适合文冠果花粉萌发和花粉管生长。吴月亮等5 研究结果表明，文冠果花粉培养基中不需要加入钙;而芦娟等13 研究认为，文冠果花粉培养需要较高浓度的钙参与。该试验结果表明，适量的钙会增加文冠果花粉离体萌发的数量，最适浓度为 001%;而花粉管的生长需要更多钙的参与，低钙会导致花粉管顶端膨大破裂，这与对百合、海仙花的研究结果一致1415。因此，若只探究文冠果花粉萌发率，可在培养基中添加少量的钙溶液，若需要探究文冠果花粉管生长情况，则需加入 004%钙，从而使文冠果花粉管能够正常生长。低温有利于花粉活力的保存已在多种植物中得到证实1618。该试验结果表明，70 超低温最有利于文冠果贮藏，20 冷冻贮藏次之，4 低温贮藏可在短时间内保持文冠果花粉萌发率，25 恒温贮藏不利于文冠果花粉贮藏，该环境下文冠果花粉萌发率降低过快，10 d 后基本不再萌发，这与吴月亮等5，19 的试验结果基本一致。因此，若要长期保存需要的文冠果花粉，70 超低温贮藏保存效果较好，若短期保存文冠果花粉，20 低温贮藏可达到较好的效果，既可保持花粉活力，又简单经济有效。综上，文冠果花粉体外萌发适宜培养基为 15%蔗糖+0.02%硼酸+001%硝酸钙，培养时间为 4 h;长期贮藏花粉使用70 超低温保存，活力保持最好。参考文献 1 中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志:第 47 卷 第 1 分册 M 北京:科学出版社，2004:72 2 刘武林，马丽玲文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bge)的花粉及其生活力的研究 J 东北师大学报(自然科学版)，1982，14(3):5764(下转第 141 页)431安徽农业科学2023 年可持续发展以及乡村振兴具有一定的指导意义。由于国家森林乡村是比较新的概念和类型，作为探索性研究，仅尝试采用传统研究中影响一般乡村类型发展的因子角度对国家森林乡村形成的内外影响因素进行探讨，但国家森林乡村还可能存在其他因素的影响，故有待进一步拓展研究。此外，研究发现，虽然湖南和江西在地理位置、地形和气候特点相似，但两省入选的国家森林乡村在空间分布上与地形和交通的关系却截然不同17，这一现象也值得进一步关注。此外，未来研究可以倾向于在国家森林乡村的生态营建智慧、生态系统修复、森林旅游与康养、乡村振兴背景下的产业发展模式等方面，以提高国家森林乡村发展政策与对策方面的连续性和针对性，达到“产业兴旺、生态宜居、乡风文明、治理有效、生活富裕”的发展目标。参考文献 1 汪彤，刘宽舒，董雨頔湖北省启动乡村绿化美化行动 N/OL 湖北日报，20190822 20210928 http:/wwwgovcn/xinwen/201908/22/content_5423279html 2 国家林业和草原局国家林业和草原局关于印发 乡村绿化美化行动方案 的通知:林生发 2019 33 号 A 20190325 3 KOVALEV S ATransformation of rural settlements in the Soviet Union J Geoforum，1972，3(1):3345 4 DUFFY Jural settlement change in the epublic of Ireland:A prelimi-nary discussion J Geoforum，1983，14(2):185191 5 孙华传统村落的性质与问题:我国乡村文化景观保护与利用刍议之一 J 中国文化遗产，2015(4):5057 6 周乾松我国传统村落保护的现状问题与对策思考 N 中国建设报，20130129(003)7 刘滨谊，王云才论中国乡村景观评价的理论基础与指标体系 J 中国园林，2002，18(5):7679 8 王静文，毛其智，杨东峰句法视域中的传统聚落空间形态研究 J 华中建筑，2008，26(6):141143，174 9 陶伟，陈红叶，林杰勇句法视角下广州传统村落空间形态及认知研究 J 地理学报，2013，68(2):209218 10 佟玉权基于 GIS 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