油樟叶精油的抑菌及抗氧化作用的研究_冯悦.pdf

第36卷第3期2023年6月Vol.36 No.3Jun.2023四川轻化工大学学报（自然科学版）Journal of Sichuan University of Science&Engineering(Natural Science Edition)油樟叶精油的抑菌及抗氧化作用的研究冯悦，毕静，罗茂，王静，陈咏梅（四川轻化工大学化学工程学院，四川自贡643000）摘要：首先通过水蒸气蒸馏法进行宜宾产油樟叶精油的提取，利用气质联用技术鉴定油樟叶精油的主要化学成分，然后通过抑菌圈、最低抑菌浓度和最低杀菌浓度实验测定油樟精油的抑菌活性，采用1,1-二苯基-2-苦基肼（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力检测其抗氧化能力。结果表明：油樟精油中主要成分为1,8-桉叶素、-松油醇和-水芹烯，具有一定的抑菌和抗氧化能力。油樟精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为6.25 L/mL，最低杀菌浓度均为25 L/mL；油樟精油的浓度为25 L/mL时，DPPH清除率达到85%，接近于维生素C。关键词：油樟；精油；抑菌；抗氧化中图分类号：S792.23；TQ654.2文献标志码：A引言油樟（Cinnamomum longepaniculatum（Gamble）N.Chao）为樟科樟属常绿乔木，主产于四川省宜宾市1-2。油樟全身都是宝，尤其是油樟叶含油率高达3%5%3。宜宾油樟精油提取物的主要成分为1,8-桉叶素、-松油醇、-松油醇、桧烯、-松油醇、香桧烯4-6等。其中萜烯类化合物1,8-桉叶素毒副作用小、刺激性小，是一种具有极高生物活性的天然药物7-8。油樟精油具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、驱蚊、消炎镇痛等作用9-13，在医药、农业、化妆品等行业具有极大的应用潜力。宜宾的油樟资源丰富，油樟精油产量占全球产量的50%左右3，但加工再利用率低，现在仍以粗产品售卖为主。研究油樟精油的抑菌和抗氧化生物活性，可以为精油在食品、化妆品和医药等领域作为天然防腐剂提供依据，为油樟的合理利用及后续开发奠定良好的基础，以此做好油樟精油的精深加工，发展其二、三产业。1材料与方法1.1试验材料试 验 所 用 大 肠 杆 菌（Escherichiacoli，ATCC15489）、金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcusaureus，ATCC25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC23856）3个菌种均由四川轻化工大学生物制药微生物实验室提供。试验所用油樟于春季3月份采 自 四 川 省 宜 宾 市 叙 州 区 樟 海 镇（104 41E，2895N），阴阳两面随机采摘。收稿日期：2022-08-13基金项目：四川省科技厅项目(2018JY0487)通信作者：陈咏梅(1987-),女,讲师,博士,研究方向为生物医药,(E-mail)文章编号：20967543（2023）03003606DOI:10.11863/j.suse.2023.03.05第36卷第3期冯 悦，等：油樟叶精油的抑菌及抗氧化作用的研究1.2试剂及仪器本实验中所用的试剂及仪器分别见表1、表2。表1实验试剂试剂名称酵母浸粉胰蛋白胨牛肉膏琼脂粉NaClDPPHL-抗坏血酸草酸二水吐温80乙醇规格BRBRBRBRARHPLCUSP GradeReagent GradeARAR生产厂家赛默飞世尔科技公司赛默飞世尔科技公司北京奥博星生物技术有限责任公司成都市科隆化学品有限公司成都市科隆化学品有限公司如吉生物科技有限公司生工生物工程（上海）股份有限公司生工生物工程（上海）股份有限公司青岛日水生物技术有限公司成都金山化学试剂有限公司表2实验仪器仪器名称超纯水制造系统超净工作台电热鼓风干燥箱恒温水浴锅全波长酶标仪隔水式恒温培养箱立式压力蒸汽灭菌器分析天平气质联用仪恒温培养振荡器恒温电热套型号UPH-II-20TSW-CJ-2D101-3ABHH-3K3WReadMax1200GNP-9050LS-75HDESJ182-4TSQ 8000ZWY-2102CZTB生产厂家西安优普仪器设备有限公司郑州南北仪器设备有限公司天津泰斯特仪器有限公司江苏佳美仪器制造有限公司上海闪谱生物科技有限公司上海精宏实验设备有限公司江阴滨江医疗设备有限公司沈阳龙腾电子有限公司Thermo Scientific上海智诚分析仪器制造有限公司山东鄄城华鲁电热仪器有限公司1.3油樟精油提取本实验中油樟精油采用隔水式水蒸气蒸馏14提取。油樟叶在60 下干燥3 h后，取20 g装入过滤袋中，悬挂于装有200 mL蒸馏水的圆底烧瓶中。安装固定精油提取器和冷凝装置后，置于恒温水浴锅中加热5 h。冷却后收集精油，加入无水硫酸钠除水后，精确称量其质量并记录。精油经甲醇稀释后进行气相色谱-质谱联用仪（Gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）测定其化学成分。色谱条件：样品注入量为1 L，分流比为5 1；程序升温至 50 保持 3 min，5/min 升至 240，20/min升至300 保持5 min。质谱条件：电子能量为 70 eV，传输线温度为280，离子源温度为230，四极杆温度为150，质量扫描范围（m/z）为35500，扫描速率为1.6 scans/s。1.4油樟精油抑菌活性测定1.4.1菌悬液的制备将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌分别接种到固体培养基平板上进行纯化，挑取单个特征菌落接种于灭菌液体培养基中，置于37 恒温摇床中过夜培养。将培养好的菌悬液加入灭菌生理盐水中依次进行2倍比稀释，通过酶标仪测定其在600 nm处的吸光度。选取浓度为106cfu/mL的菌悬液进行实验，即加入细菌的液体培养基比没加细菌的液体培养基在600 nm波长下的吸光度值读取上多0.115。1.4.2最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）以 2.5%吐温 80 为乳化剂，将溶液配制成 50、25、12.5、6.25、3.13 L/mL及1.56 L/mL的油樟精油抑菌液，用直径0.22 m的无菌滤器过滤除掉配制过程中可能引入的杂菌。选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为受试菌种，向试管中加入1.98 mL不同浓度的油樟精油抑菌液和20 L菌悬液（106cfu/mL），37 下恒温培养24 h。以未加入菌悬液的肉汤培养基溶液、加吐温80的肉汤培养基溶液、加菌悬液的肉汤培养基溶液分别作为对照组，观察溶液是否变得浑浊5。1.4.3最低杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration,MBC）取油樟精油 MIC 以上未见细菌生长的培养物每管各0.1 mL，于营养琼脂培养基上均匀涂布16，置于37 恒温箱中培养24 h，观察细菌生长状况，以菌落数不超过5个的平板所对应孔中的最低浓度为该药物的MBC。1.4.4抑菌圈实验取 配 成 1.0106cfu/mL 的 供 试 菌 菌 悬 液 各0.1 mL涂布于营养琼脂固体平板培养基上。用枪头在培养皿上打孔17，孔内加20 L的油樟精油，每份均平行试验3次。将去离子水作为空白对照。将加入油樟精油的平板置于恒温培养箱中，在37 下培养24 h，取出后测定抑菌圈直径15。372023年6月四川轻化工大学学报（自然科学版）1.4.5抑菌时间曲线抑菌时间曲线测量参考霍归国等18的测量方法。将吐温80与油樟精油混合后，溶于培养液中。依据 1.4.2 节中结果，配制成相应浓度的 0.5MIC、1.0MIC、2.0MIC油樟抑菌液。将菌悬液加入油樟抑菌液中进行混合后，加入96孔板中。每隔2 h，测量600 nm处的吸光度。1.5油樟精油抗氧化活性测定1,1-二 苯 基-2-苦 基 肼（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）乙醇溶液呈深紫红色，当抗氧化剂与DPPH乙醇溶液进行反应时，溶液颜色变浅。溶液颜色越浅，说明抗氧化剂的抗氧化能力越强。DPPH自由基在515529 nm范围内有最大吸收峰，通过测定516 nm处的吸光度值，来判断自由基清除能力。用乙醇将 DPPH 溶解，配成浓度为 0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液19，于4 避光保存备用。称取油樟精油溶于无水乙醇中，配制成质量浓度为200、100、50、25、12.5 mg/mL及 6.25 mg/mL的溶液。将维生素C溶于水，配制成与油樟精油相同浓度的5种溶液。将配制好的DPPH溶液与待测化合物溶液按1 1比例混合均匀，在室温下避光放置30 min、1 h、2 h后，通过酶标仪在516 nm处测量每孔的吸光度，以维生素C对DPPH自由基的清除率为阳性对照，测定精油的DPPH自由基清除效果，DPPH清除率计算公式如下：清除率=(A0 At)/A0 100%。式中，A0为不加样品的DPPH溶液吸光度值；At为待测样品与DPPH反应t时的吸光度值。2结果与讨论2.1油樟化学成分分析通过隔水蒸馏得到的油樟精油为无色澄清油状液体，樟叶气味明显。根据气质联用得到的质谱信息及相对保留时间，经NIST数据库进行检索，并与数据库中的标准图谱进行对照。隔水蒸馏法提取油樟精油GC-MS总离子流如图1所示，用峰面积归一化法计算相对含量百分比。图1隔水蒸馏法提取油樟精油的GC-MS总离子流油樟精油的成分见表3。表3中可见相对含量在1%以上的挥发性成分有19种。油樟提取的油樟精油中萜类化合物较多，以单萜和倍半萜类为主。1,8-桉叶油素（37.77%）含量最高，其次为-松油醇（12.54%）、-水芹烯（11.46%）和 3-蒈烯（4.05%）。与程贤等4测得的油樟精油主要成分相似，本实验制备的油樟精油中1,8-桉叶油素含量偏低。表3油樟叶的精油成分序号12345678910111213141516171819保留时间/min11.22116.2859.2087.8909.32324.37529.06515.68023.28122.35826.7829.62821.79812.27011.84013.21319.95015.37110.522化合物名称1,8-桉叶素-松油醇-水芹烯3-蒈烯-萜品烯正十五烷正十七烷4-萜烯醇1,4,7,-Cycloundecatriene,1,5,9,9-tetramethyl-,Z,Z,Z-Bicyclo5.2.0nonane,2-methylene-4,8,8-trimethyl-4-vinyl-正十六烷(-)-蒎烯十四烷Bicyclo3.1.0hexan-2-ol,2-methyl-5-(1-methylethyl)-,(1R,2R,5S)-rel-松油烯2-Cyclohexen-1-ol,1-methyl-4-(1-methylethyl)-,cis-榄香烯Cyclohexanemethanol,-dimethyl-4-methylene-松油烯分子式C10H18OC10H18OC10H16C10H16C10H16C15H32C17H36C10H18OC15H24C15H24C16H34C10H16C14H30C10H18OC10H16C10H18OC15H24C10H18OC10H16峰面积总和/%37.7712.5411.464.053.293.162.142.082.001.981.891.891.871.741.391.291.281.181.072.2抑菌实验结果最低抑菌浓度实验显示，与对照组相比，加入油樟抑菌液浓度为6.2550 L/mL时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌这3种菌的培养液均澄清，而加入3.13 L/mL、1.56 L/mL浓度油樟抑菌液的38第36卷第3期冯 悦，等：油樟叶精油的抑菌及抗氧化作用的研究培养液均混浊。这表明油樟对3种菌的最低抑菌浓度均为6.25 L/mL。油樟精油的最低杀菌浓度实验结果如图 2 所示，图中可见涂布 50 L/mL、25 L/mL 的油樟抑菌液的固体培养基上未见菌落，而涂布12.5 L/mL、6.25 L/mL 的油樟抑菌液的固体培养基上有菌落生长。这表明油樟精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌这3种菌的最低杀菌浓度为25 L/mL。50 L/mL25 L/mL12.5 L/mL6.25 L/mL(a)不同浓度油樟精油抑菌液对金黄色葡萄球菌杀菌效果50 L/mL25 L/mL12.5 L/mL6.25 L/mL(b)不同浓度油樟精油抑菌液对大肠杆菌杀菌效果50 L/mL25 L/mL12.5 L/mL6.25 L/mL(c)不同浓度油樟精油抑菌液对枯草芽孢杆菌杀菌效果图2油樟精油的最低杀菌浓度采用打孔法研究油樟精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌试验菌的抑制效果，以抑菌圈直径的大小为衡量指标，实验结果如图3所示。油樟精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小分别为 23.0、19.3 mm 及 21.5 mm。抑菌圈直径r在8.010.0 mm之间为抑菌较明显，抑菌圈直径r 10.0mm为抑菌明显。实验结果表明油樟精油对3种菌均有较好的抑菌效果。(a)金黄色葡萄球菌(b)大肠杆菌(c)枯草芽孢杆菌图3油樟精油抑菌圈实验图4所示为油樟精油对不同细菌的抑菌时间曲线。从图4中可见，当油樟抑菌液的浓度为2.0MIC和 1.0MIC时，这 3种图的吸光度值都几乎没有变化，油樟抑菌液在此浓度下能够完全抑制这3种细菌的生长。而油樟精油浓度为0.5MIC时，只能延缓这3种细菌的生长速度。经过油樟精油处理后的细菌吸光度均低于对照组。这表明油樟精油对3种菌均具有较好的抑制效果，与尹浩等5的研究结果一致。据报道，油樟精油的主成分1,8-桉叶油素、-松油醇、-松油烯等可能抑制细菌增殖和生物膜生长20-21，这可能是油樟精油具有抑菌作用的原因。(a)金黄色葡萄球菌(b)大肠杆菌(c)枯草芽孢杆菌图4油樟精油对不同细菌的抑菌时间曲线2.3抗氧化实验结果图 5 所示为油樟精油 DPPH 清除能力测试结果。由图5可看出，随着油樟精油的质量浓度增加，DPPH 的清除率呈现出先增加最后趋于稳定的状态，且油樟精油的清除率与反应时间呈现正相关的关系。其原因可能在于油樟精油中含有大量的萜类成分，能够捕捉自由基并将其转换为非活泼的物质，阻止自由基的连锁反应22。经过一定时间的反应，油樟精油中的某些成分作为电子的供给体逐步与自由基反应完，最终自由基清除率达到平稳状392023年6月四川轻化工大学学报（自然科学版）态。终浓度为100 mg/mL的油樟精油溶液，其自由基清除率约为88.7%，可以达到和维生素C溶液相似的抗氧化效果。终浓度为25 mg/mL的油樟精油溶液，在与DPPH反应2 h后，其自由基清除率最终可达到85.0%，接近于100 mg/mL油樟精油溶液的自由基清除率。丛赢等11的研究也表明，随着精油浓度的升高，其自由基清除率逐渐升高。这可能是由于在一定浓度范围内，随着油樟精油中的抗氧化活性成分浓度升高，并且由于不同成分可能存在协同作用，其自由基清除率加速升高23。图5油樟精油DPPH清除能力测试3结束语不同生长时期的油樟以及不同的精油提取方式都会对精油的化学成分造成影响，从而影响其生物活性19。本研究采用隔水式水蒸气蒸馏法提取精油，通过GC-MS对油樟精油化学成分进行分析，其主要成分为1,8-桉叶素,占总含量的37.77%。本文对油樟精油抗菌及抗氧化能力进行了初步研究，并证明了油樟精油具有一定抑菌活性和抗氧化活性，且油樟精油自由基清除能力与时间和浓度都具有一定的相关性，浓度升高与反应时间延长都会增强油樟精油的自由基清除能力。宜宾作为油樟的主要产地，为全国乃至世界提供油樟精油，但是油樟精油的产率较低、且多产粗油，限制了宜宾油樟产业的发展。本实验通过研究油樟的生物活性，为油樟的深加工提供了重要的参考。参考文献：1 尹礼国,凌跃,杜永华,等.宜宾油樟营养器官精油主成分分析J.江苏农业科学,2014,42(11):348-350,355.2 胡贤陈,邱远望,赖炜康,等.阴干时间对不同产地油樟挥发油提取率的影响J.海峡药学,2022,34(3):72-74.3 周成强,练东明.宜宾油樟产业发展现状及对策J.农业与技术,2020,40(16):65-68.4 程贤,毕良武,李胜男,等.春秋两季油樟叶的油细胞形态、精油成分及其抗氧化活性研究J.林产化学与工业,2021,41(1):38-44.5 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Yongmei(School of Chemical Engineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China)Abstract:First,the essential oil of Yibin Cinnamomum longepaniculatum leaves is extracted by water steamdistillation.The main chemical components of essential oil are identified by gas chromatography massspectrometry(GC-MS).Then,the antibacterial activity of the essential oil is determined by bacteriostatic zone,minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC).The antioxidantcapacity is detected by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging ability.The results showthat the main components of the essential oil are 1,8-cineole,-terpineol and-phellandrene.The essential oil hasa certain bacteriostatic and antioxidant effect.The MIC values of the essential oil for Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis are 6.25 L/mL,and the MBC values are 25 L/mL.When theessential oil concentration is 25 L/mL,the essential oil clearance rate reaches 85%,which is close to the rate ofvitamin C solution.Key words:Cinnamomum longepaniculatum;essential oil;antibacterial;antioxidant41