一株2,4-二氯苯酚降解菌的筛选及降解特性.pdf

从活性污泥中分离筛选出一株 2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)降解菌,结合 16S rDNA 对菌株进行鉴定,并考察了菌株对 2,4-DCP 的耐受性能及降解特征.结果表明,该降解菌为棒状杆菌属(Corynebacterium sp.),命名为 ZH404;该菌对2,4-DCP 的最小抑菌浓度可达 160 mg/L;在无机盐培养基中菌株 ZH404 培养 30 h 生物量达到 0.29,添加 5%和 10%葡萄糖作为辅助碳源,生物量分别提高了 1.3 和 1.9 倍;该菌处理 2,4-DCP(50 mg/L)10 d 降解率达到 40.1%,添加 5%和10%葡萄糖的降解率分别提高到 46.4%和 63.5%.可见菌株 ZH404 能够在以 2,4-DCP 为唯一碳源的环境下生长,且辅助碳源有利于 ZH404 的生长及提高对 2,4-DCP 的降解效率,该菌株可用于含酚类污染物的有机废水处理.以上结果可为实际含酚废水的生物修复提供理论依据和技术参考.关键词:生物降解;2,4-二氯苯酚;筛选分离;最小抑菌浓度中图分类号:X703.1文献标志码:ADOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2022.00.059著录信息:朱经纬,罗艾虎,张天翼,等.一株 2,4-二氯苯酚降解菌的筛选及降解特性J.湖北大学学报(自然科学版),2023,45(4):516-522.DOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2022.00.059.ZHU J W,LUO A H,ZHANG T Y,et al.Screening of a 2,4-dichlorophenol-degrading bacteria and its biodegradation characteristicsJ.Journal of Hubei University(Natural Science),2023,45(4):516-522.DOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2022.00.059.Screening of a 2,4-dichlorophenol-degrading bacteria andits biodegradation characteristicsZHU Jingwei,LUO Aihu,ZHANG Tianyi,SONG Wenxuan,DONG Yuji,PENG Fang(Hubei Province Key Laboratory of Regional Development and Environment Response,Faculty of Resources and Environmental Science,Hubei University,Wuhan 430062,China)Abstract:A strain of 2,4-dichlorophenol(2,4-DCP)degrading bacteria was isolated and screened from activated sludge,and then was identified by 16S rDNA sequence analysis.The tolerance and degradation characteristics were investigated.The results showed that a DCP-degrading bacterial strain ZH404 was isolated and identified as Corynebacterium sp.Its minimum inhibitory concentration to 2,4-DCP was 160 mg/L.The biomass of strain ZH404 in inorganic salt medium reached 0.29 at the 30th hour,and increased by 1.3 and 1.9 times with addition of 5%and 10%glucose as auxiliary carbon source.Treating with strain ZH404 for 10 days,the degradation rate of 2,4-DCP(50 mg/L)reached 40.1%,and increased to 46.4%and 63.5%,with 5%and 10%glucose,respectively.It indicated that the strain ZH404 could grow with 2,4-DCP as the sole carbon source,and also grow better with the addition of the auxiliary carbon source,resulting in higher degradation efficiency.It presented the strain ZH404 could be used for the treatment of chlorophenol wastewater.The above results provided theoretical basis and technical reference for the bioremediation of phenols wastewater.Key words:biodegradation;2,4-dichlorophenol;screen separation;minimum inhibitory concentration 第 4 期朱经纬,等:一株 2,4-二氯苯酚降解菌的筛选及降解特性517 0引言2,4-二氯苯酚(2,4-dichlorophenol)主要用作农药、医药中间体1.由于 2,4-二氯苯酚是一种原生质的高毒物质,美国环保署(EPA)将其列为优先控制污染物2.含二氯酚废水如果未经处理排放会污染周边场地土壤、水体、底泥等环境介质,并对人体健康构成威胁3-4.因而去除环境中 2,4-二氯苯酚的污染物研究受到了众多学者的关注5-7.微生物法因其二次污染小、经济环保等优点,已逐渐成为处理含酚废水的主要方法8.目前已分离得到多种 2,4-DCP 降解菌,主要有白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)9、芽孢杆菌(Bacillus sp.)10和 假 单 胞 菌(Pseudomonas sp.)11等.Huang 等12筛 选 出 黄 孢 原 毛 平 革 菌(Phanerochaete chrysosporium)降解 10 mg/L 2,4-DCP,48 h 可 完 全 降 解.Wang 等13利 用 芽 孢 杆 菌(Bacillus insoli-tus)处理 20 mg/L 2,4-DCP,24 h 后 2,4-DCP 降解率达到 77%.张文艺等14从农药化工厂土壤中筛选出摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)HD-1 降解 30 mg/L 2,4-DCP,10 d 降解率达到59.6%.然而这些降解菌对于较低浓度(小于 30 mg/L)2,4-DCP 的降解效果较好,较高浓度(50 mg/L)2,4-DCP 下因微生物生长受抑制导致降解能力下降.近年来也有较高浓度二氯酚降解菌的研究报道.张莹等15采用丝瓜瓢作为载体固定白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)处理 50 mg/L 二氯酚废水,12 d降解率可达到 86%.Patel 等16分离出内生芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)CP1R 降解 50 mg/L 的 2,4-DCP,20 d 降解率达到 73%.Setlhare 等17分离出一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)PKZNSA 降解 50 mg/L 的 2,4-DCP,20 d 降解率达到 64%.文献中较高浓度二氯酚降解菌存在处理时间长、降解效率低等问题,因此筛选高效降解较高浓度 2,4-DCP 的降解菌具有重要意义.本研究从活性污泥中分离筛选出一株氯酚高效降解菌株(Corynebacterium sp.),结合菌株对 2,4-DCP 耐受性、生理生化特征、生长曲线和在不同碳源下菌株对 2,4-DCP 的降解特性进行系统分析,为微生物法处理氯酚废水提供了宝贵菌源,为进一步工业化应用提供了技术参考.1材料与方法1.1培养基LB 培养基(g/L):胰蛋白胨 10、酵母提取物 5、NaCl 10;无机盐培养基(g/L):NaCl 0.2、K2HPO4 0.5、KH2PO4 0.5、NH4NO3 1、MgSO4 7H2O 0.2、FeSO47H2O 微量;无机盐+葡萄糖混合培养基(g/L):葡萄糖 5 10、K2HPO4 0.25、NH4NO3 0.5、MgSO47H2O 0.1、FeSO47H2O 微量;醋酸铅培养基(g/L):胰蛋白胨 10、牛肉浸粉 3、NaCl 5、Na2S2O3 2.5、琼脂 12.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%(w/v)琼脂.以上培养基在使用前均经过 121 高压蒸汽灭菌 30 min,配制 1 g/L 2,4-DCP 母液,过滤除菌后,按需加入培养基中.1.2二氯酚降解菌株的分离筛选实验用活性污泥取自湖北省孝昌县污水处理厂曝气池.从中取10 mL 活性污泥转入 90 mL LB 液体培养基中,28 、250 r/min 恒温摇床震荡培养 24 h.按污泥 培养基=1 10 的比例转接至含 30 mg/L 2,4-DCP 的 LB 培养基中,28 、250 r/min 恒温培养 48 h.从中取10 mL 转接至 90 mL 含 50 mg/L 2,4-DCP 的 LB 培养基,富集培养 7 d.将驯化后的菌液稀释涂布到含有2,4-DCP(50 mg/L)的无机盐培养基平板,28 培养 7 d,挑出生长良好的菌落,接种至 100 mL 含 2,4-DCP(50 mg/L)的 LB 培养基中,在 28 、250 r/min 的摇床恒温培养 24 h,菌液稀释涂布在含 2,4-DCP(50 mg/L)的无机盐平板上接种划线,重复 3 次,分离纯化出耐受 2,4-DCP 能力最强的菌株,用甘油冷冻保藏于-80 冰箱.1.3菌株鉴定 1.3.1形态学观察将菌株接种于无机盐固体平板,培养 12 h 后观察菌落形态.取出菌液离心后加入生理盐水,制成菌悬液,用光学显微镜 16100 倍油镜观察细菌形态.1.3.2生理生化实验测定方法参照常见细菌系统鉴定手册18伯杰细菌鉴定手册(第八版)19518 湖北大学学报(自然科学版)第 45 卷进行实验.1.3.3菌株 16S rDNA 的扩增和鉴定提取菌株 DNA 扩增 16S rDNA 序列,16S rDNA 扩增引物序列:27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 1492R(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3).PCR 扩增体系:总体积为 50 L,PCR Mix 25 L,27F 引物(10 mol/L)2 L,1492R 引物(10 mol/L)2 L,基因组DNA 1 L,用 ddH2O 补足.扩增程序:98 预变性 2 min,98 变性 10 s,57 退火 10 s,72 延伸30 s,35 个循环,72 最终延伸 5 min,4 保存,委托武汉擎科伟业生物科技有限公司检测.测序结果经NCBI 的 Blast 工具与已知核酸序列进行比对,选择同源性较高的已知 16S rDNA 序列通过 MEGA 软件构建进化树.1.4实验方法 1.4.1耐受性实验取 1 g/L 的 2,4-DCP 母液分别稀释至 30170 mg/L.取试管若干,分别加入 4 mL LB 培养基和一定浓度的 2,4-DCP,液体总体积为 8 mL.向试管中分别接入 50 L 菌液,28 恒温培养24 h,观察试管中的混浊度.当试管中液体澄清时,试管中的 2,4-DCP 浓度即为最小抑菌浓度(MIC),以此来表征菌株对 2,4-DCP 的耐受性.1.4.2生长及降解实验活化后的菌株分别接种至含 50 mg/L 2,4-DCP 的无机盐培养基、5%葡萄糖+无机盐混合培养基和 10%葡萄糖+无机盐混合培养基中,接种量保持一致,使接种后培养基中的初始OD600=0.1,每 3 h 取样 1 mL 测定其生物量,绘制生长曲线;每 12 h 取样 1 mL 测定 2,4-DCP 含量,绘制降解曲线,实验均设置 3 个重复.1.5分析方法 1.5.1菌株生物量的测定采用 UV-1000 型紫外-可见分光光度计在 600 nm 波长下测定菌株的吸光度,OD600值反映菌株在培养基中的生长情况.1.5.2 2,4-DCP 含量的测定含酚样品经离心后取上清液,0.22 m 有机相微孔滤膜过滤,采用高效液相色谱法20测定 2,4-DCP 含量.高效液相色谱仪器参数:Agilent 1200 HPLC(Agilent,USA),XDB-C18(5 m,4.6 mm250 mm)色谱柱;色谱条件:流动相 V(甲醇)V(水)=80 20,检测波长280 nm,流速 1 mL/min,柱温 35 ,进样量 10 L.2,4-DCP 降解率=(初始浓度-反应后浓度)/初始浓度100%.2结果与讨论2.1二氯酚降解菌株的筛选与鉴定经富集培养,分离纯化得到一株以 2,4-DCP 为唯一碳源生长的菌株,并将其命名为 ZH404.该菌株在无机盐固体平板上培养 12 h 后,菌落呈圆形,淡黄色,中心隆起,边缘整齐(图 1(a).16100 倍油镜观察,细胞呈现颗粒短棒状(图 1(b).菌株 ZH404 的生理生化特征如表 1 所示.该菌为好氧革兰氏阳性菌,具有过氧化氢酶,不能将明胶分解成液状表明不含类蛋白水解酶,未出现使醋酸铅培养基变黑的情况说明在代谢过程中不产生硫化氢,在蛋白胨水培养基中未有玫瑰红色显色反应故不含色氨酸酶,在葡萄糖蛋白胨水培养基中加入甲基红试剂后呈红色表明该菌可以利用葡萄糖.图 1菌株 ZH404 菌落及细胞形态表 1菌株 ZH404 生理生化指标 实验类别菌株 ZH404 空白对照革兰氏染色接触酶实验明胶水解实验 硫化氢实验 吲哚产生 甲基红实验+-+-注:“+”表示菌株反应为阳性,“-”表示菌株反应为阴性.第 4 期朱经纬,等:一株 2,4-二氯苯酚降解菌的筛选及降解特性519 PCR 扩增菌株的 16S rDNA,并测序.将所测序列在 NCBI 上进行 blast 比对,通过比对结果从 NCBI中选择出 9 株同源性较高的菌株序列,在 MEGA5 软件中进行发育树的构建如图 2 所示.结果显示该菌株属于棒状菌属,与 Corynebacterium stationis FC25277 亲缘关系最相近,鉴定该菌株为停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis),命名为 Corynebacterium stationis sp.ZH404.图 2菌株 ZH404 系统发育树分析2.2菌株对 2,4-DCP 的耐受性分析菌株 ZH404 在含 2,4-DCP 的 LB 培养基中生长情况如图 3 和表2 所示.当 2,4-DCP 浓度低于 110 mg/L 时,对 ZH404 的生长无明显的抑制作用,菌株生长较好;随着图 3菌株在含 2,4-DCP 的 LB 培养基中生长情况2,4-DCP 浓度提高到 110 mg/L 后,菌株在培养基中的生物量明显减少.在 2,4-DCP 浓度达到 160 mg/L 时,菌株试管振荡培养 24 h 后菌液澄清,说明此时 2,4-DCP 的毒性破坏了细胞结构,从而导致菌株无法生长.实验结果表明,菌株 ZH404 对 2,4-DCP 的最小抑菌浓度为 160 mg/L.520 湖北大学学报(自然科学版)第 45 卷表 2菌株 ZH404 对 2,4-DCP 的最小抑菌浓度2,4-二氯苯酚浓度/(mg/L)5080100110120130140150160170生长情况+-注:“+”表示细菌生长量多,“+”表示细菌生长量较多,“+”表示细菌生长量少,“-”表示不能生长.图 4菌株 ZH404 的生长曲线2.3外加碳源对菌株生长特性的影响以 2,4-DCP(50 mg/L)为底物,分别测定菌株 ZH404 在添加不同浓度葡萄糖培养基中的生物量.如图 4所示,菌株 ZH404 在含有 2,4-DCP 的无机盐培养基中的生物量最小,30 h 时 OD600仅为 0.29,说明该菌株能够以 2,4-DCP 为唯一碳源生长,但菌株生长受到了 2,4-DCP 的抑制作用.在分别添加5%和 10%葡萄糖作为辅助碳源后,30 h OD600分别达到了 0.68 和 0.85,生物量提高了 1.3 倍和1.9 倍,表明添加葡萄糖作为辅助碳源能大幅度提高菌株的生物量.从菌株 ZH404 在不同培养基中的生长曲线来看,在无机盐培养基中菌株的生长延迟期约为 6 h,添加葡萄糖后菌株的生长延迟期不到 3 h,说明菌株生长受到了 2,4-DCP 的抑制作用导致生长延迟期变长,辅助碳源葡萄糖的添加能缓解 2,4-DCP 对菌株的生长抑制,缩短菌株生长延迟期.添加葡萄糖明显减弱了 2,4-DCP 对菌株的生长抑制作用,菌株在3 h 进入对数生长期,生长明显加快;而在 2,4-DCP 为唯一碳源条件下,2,4-DCP 对菌株的生长抑制并没有随着时间的增加而减弱.图 5菌株 ZH404 在不同培养基中对 2,4-DCP 的降解曲线2.4外加碳源对菌株降解特性的影响实验设置同 2.3,分别测定菌株 ZH404 在不同培养基中的 2,4-DCP 含量.如图 5 所示,菌株在无机盐条件下处理 10 d,2,4-DCP 降解率为 40.1%;添加 5%葡萄糖后,降解率提高到46.4%;添加 10%葡萄糖,降解率大幅提高到63.5%.与 2,4-DCP 为唯一碳源相比,添加葡萄糖后氯酚降解率分别提高了 0.16 和 0.6倍,与该菌的生长特性表现出一致性.结合菌株生长和降解曲线,在 024 h 内无机盐培养基中生物量增长幅度较小,添加葡萄糖后的培养基中生物量快速增加,而此阶段微生物对 2,4-DCP 的消耗量较少,说明在对微生物有毒害作用的 2,4-DCP 与葡萄糖同时存在时,微生物会优先消耗葡萄糖进行快速生长,以抵制 2,4-DCP 的毒性作用,因而适当增加葡萄糖的投加量能促进生物量的增长.在生长对数期菌株逐渐适应 2,4-DCP 后,3 种培养基中对 2,4-DCP 的降解效率开始提高,在 10%葡萄糖+无机盐混合培养基中这种变化更为明显.进入稳定期后,菌株在无机盐培养基中生物量最少,对 2,4-DCP 的降解速率最低;10%葡萄糖+无机盐混合培养基中生物量最高,氯酚降解速率最高,说明高生物量能减轻 2,4-DCP 对菌株的毒性抑制,加快菌株对 2,4-DCP 的降解速度.本次实验发现,30 h 后 3 种培养基中菌株均保持稳定期生长,在培养 6 d 之后菌株对 2,4-DCP 的降解速率减缓,可能进入了衰亡期,10 d 后 2,4-DCP 的浓度几乎不再降低,此时菌株可能已经死亡.说明第 4 期朱经纬,等:一株 2,4-二氯苯酚降解菌的筛选及降解特性521 菌株在进入生长衰亡期后,若不及时补充碳源,菌株无法继续降解 2,4-DCP.因此,在生物降解 2,4-DCP的过程中,在菌株生长初期和稳定期,添加辅助碳源增强菌株对污染物的耐受能力,减少有毒物质对细胞的毒性和生长抑制,促进菌株生长,高生物量进而提高生物降解 2,4-DCP 的降解性能21-22.Liao X等23发现在微生物菌群补充葡萄糖可以提高微生物降解效率;Liao H Y 等24添加 0.8%的葡萄糖能提高柠檬酸杆菌对 2,4,6-三硝基甲苯的耐受能力和降解效率;Bhattacharya A 等25在含有葡萄糖的培养基中不动杆菌 B9 降解 188 mg/L 苯酚时间缩短了 96 h.这些结果表明在添加葡萄糖之后可以帮助减少有毒物质对微生物的毒性和生长抑制,显著提高污染物的降解程度和降解速率.本研究与已报道的结果一致.3结论1)从活性污泥中筛选分离出一株氯酚降解菌株 ZH404,经 16S rDNA 序列分析,鉴定为停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis),命名为 Corynebacterium stationis sp.ZH404.2)该菌为革兰氏阳性菌,对 2,4-DCP 的最小抑菌浓度为 160 mg/L.3)添加葡萄糖作为辅助碳源可加快菌株生长,进而提高菌株降解 2,4-DCP 的能力.添加 10%葡萄糖,菌株 OD600值在 30 h 时达到 0.85,提高了 1.9 倍;10 d 对 2,4-DCP 的降解率达到 63.5%,提高了0.6 倍.4参考文献1 MUNOZ M,ZHANG G R,ETZOLD B J M.Exploring the role of the catalytic support sorption capacity on the hydrodechlorination kinetics by the use of carbide-derived carbonsJ.Applied Catalysis B:Environmental,2017,203:591-598.2 CAO Z,ZHANG M,ZHANG J,et al.Impact of continuous and intermittent supply of electric assistance on high-strength 2,4-dichlorophenol degradation in electro-microbial systemJ.Bioresource Technology,2016,212:138-143.3 李君敬,刘惠玲,程修文.氯酚废水处理方法研究进展J.工业水处理,2013,33(9):1-5.4 WOLF E C,REJMNKOV E,COOPER D J.Wood chip soil amendments in restored wetlands affect plant growth by reducing compaction and increasing dissolved phenolicsJ.Restoration Ecology,2019,27(5):1128-1136.5 NAIKOO M I,DAR M I,RAGHIB F,et al.Role and regulation of plants phenolics in abiotic stress tolerance:an overviewJ.Plant signaling molecules,2019(9):157-168.6 李雅君,张永祥,井琦.改性纳米铁镍去除水中 2,4-DCP 的研究J.应用化工,2019,48(12):2809-2814.7 徐田田,卢珏名,鲍建国,等.电沉积法制备 Pd-TiO2NTs/Ti 电极降解 2,4-二氯苯酚的试验研究J.安全与环境工程,2019,26(5):116-120.8 XU J,LV X,LI J,et al.Simultaneous adsorption and dechlorination of 2,4-dichlorophenol by Pd/Fe nanoparticles with multi-walled carbon nanotube supportJ.Journal of Hazardous Materials,2012,225:36-45.9 ORTEGA-CALVO J J,FESCH C,HARMS H.Biodegradation of Sorbed 2,4-dinitrotoluene in a clay-rich,aggregated porous mediumJ.Environmental Science&Technology,1999,33(21):3737-3742.10 HASSAN H,JIN B,DAI S,et al.Chemical impact of catholytes on Bacillus subtilis-catalysed microbial fuel cell performance for degrading 2,4-dichlorophenolJ.Chemical Engineering Journal,2016,301:103-114.11 OLANIRAN A O,SINGH L,KUMAR A,et al.Aerobic degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and other chlorophenols by Pseudomonas strains indigenous to contaminated soil in South Africa:growth kinetics and degradation pathwayJ.Applied Biochemistry and Microbiology,2017,53(2):209-216.12 HUANG Z,CHEN G,ZENG G,et al.Toxicity mechanisms and synergies of silver nanoparticles in 2,4-dichlorophenol degradation by Phanerochaete chrysosporiumJ.Journal of Hazardous Materials,2017,321:37-46.13 WANG H,LI Q,WANG Y,et al.Effect of recycling flux on performance and characteristics of activated sludge hydrolytic-aerobic recycling process in degradation of 2,4-dichlorophenolJ.Journal of Hazardous Materials,2009,168(1):203-209.14 张文艺,黄彬,郭惠娟,等.一株 2,4-二氯苯酚降解菌及降解方法P.江苏:CN108823122A.2018-11-16.522 湖北大学学报(自然科学版)第 45 卷15 张莹,李小明,杨麒,等.丝瓜瓤固定黄孢原毛平革菌对 2,4-二氯酚的降解研究J.工业用水与废水,2008,39(4):27-31.16 PATEL B P,KUMAR A.Biodegradation of 2,4-dichlorophenol by Bacillus endophyticus strain:optimization of experimental parameters using response surface methodology and kinetic study J.Desalination and Water Treatment,2016,57(34):15932-15940.17 SETLHARE B,KUMAR A,AREGBESOLA O A,et al.2,4-dichlorophenol degradation by indigenous Pseudomonas sp.PKZNSA and Klebsiella pneumoniae KpKZNSA:kinetics,enzyme activity and catabolic gene detection J.Applied Biochemistry and Microbiology,2021,57(5):656-665.18 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册M.北京:科学出版社,2001:162-167.19 布坎南 R E,吉本斯 N E.伯杰氏细菌鉴定手册M.8 版.北京:科学出版社,1984.20 PATEL B P,KUMAR A.Biodegradation of 2,4-dichlorophenol in packed-bed biofilm reactor:effect of hydraulic retention time,biogenic substrate and loading rateJ.Water Environment Research,2016,88(12):2191-2197.21 贺强礼,黄水娥,彭晓霞,等.一株苯酚降解菌的筛选鉴定及响应面法优化其降解J.环境科学学报,2016,36(1):112-123.22 YANG K,ZHAO Y,JI M,et al.Challenges and opportunities for the biodegradation of chlorophenols:aerobic,anaerobic and bioelectrochemical processesJ.Water Research,2021,193:116862.23 LIAO X,LI B,ZOU R,et al.Biodegradation of antibiotic ciprofloxacin:pathways,influential factors and bacterial community structureJ.Environmental Science and Pollution Research,2016,23(8):7911-7918.24 LIAO H Y,CHIEN C C,TANG P,et al.The integrated analysis of transcriptome and proteome for exploring the biodegradation mechanism of 2,4,6-trinitrotoluene by Citrobacter spJ.Journal of Hazardous Materials,2018,349:79-90.25 BHATTACHARYA A,GUPTA A,KAUR A,et al.Efficacy of Acinetobacter sp.B9 for simultaneous removal of phenol and hexavalent chromium from co-contaminated systemJ.Applied Microbiology&Biotechnology,2014,98(23):9829-9841.(责任编辑游俊)