有尾噬菌体的结构及其受体研究进展_李托_.pdf

综述与专论2023,39(6):88-101生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN收稿日期：2022-10-27基金项目：陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目（2022JQ-187）作者简介：李托，女，硕士，讲师，研究方向：动物营养与健康养殖；E-mail:通讯作者：李陇平，男，博士，讲师，研究方向：动物营养与牛羊噬菌体；E-mail:llp_超过 95%的已知噬菌体都属于有尾噬菌体目（Caudovirales），其典型特征为具有多面体头部和尾巴，遗传物质为双链 DNA1。传统上，按其形态结构可以将其分为 3 种类型：肌尾病毒科（Myoviridae）、长尾病毒科（Siphoviridae）和短尾病毒科（Podoviridae）。最近几年，随着测序技术的快有尾噬菌体的结构及其受体研究进展李托 李陇平 屈雷（1.榆林学院生命科学学院，榆林 719000；2.榆林学院 陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，榆林 719000）摘 要：随着“超级耐药”细菌的不断出现和快速传播，噬菌体（细菌病毒）成为抗生素替代品研究的热点，是解决抗生素耐药难题、促进养殖业健康发展的新途径。噬菌体能够特异性裂解宿主菌是其发挥治疗功效的关键，然而噬菌体裂解细菌的特异性又取决于噬菌体受体结合蛋白与受体的识别与吸附。有尾噬菌体利用其受体结合蛋白（尾部纤维、尾钉和基板结构等）识别细菌表面受体（脂多糖、外膜蛋白、荚膜、鞭毛和菌毛等），最终将细菌裂解。本文综述了有尾噬菌体及其受体结合蛋白的类型和结构，以及噬菌体受体方面的研究进展，讨论了基于噬菌体与宿主菌互作研究基础上的噬菌体治疗制剂的选择策略，为后续深入研究噬菌体与其宿主菌互作机理、改造噬菌体和创制噬菌体生物杀菌制剂提供坚实的理论基础。关键词：有尾噬菌体；结构；受体结合蛋白；受体；噬菌体治疗制剂选择策略DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1329Research Progress in the Structure of Tailed Bacteriophage and Its ReceptorsLI Tuo LI Long-ping QU Lei（1.College of Life Sciences,Yulin University,Yulin 719000;2.Shaanxi Province Engineering&Technology Research Center of Cashmere Goat,Yulin University,Yulin 719000）Abstract:With the emergence and rapid spread of“super drug-resistant”bacteria,phages have become a research hot spot for antibiotic alternatives and a new way to solve the problem of antibiotic resistance and promote the healthy development of the farming industry.The key to the therapeutic role of phages is their ability of specifically lysing their host bacteria,while the specificity of phage lysis of bacteria depends on the recognition and adsorption of phage receptor-binding proteins to the receptor.Tailed bacteriophages use a broad range of receptor-binding proteins,such as tail fiber,tail spikes and the central tail spike,to target their cognate bacterial cell surface receptors lipopolysaccharide,outer membrane protein,capsule,flagella and pili,etc.，and finally the bacteria are lysed.In the present review,we systematically summarized the research advances in the types and structures of tailed bacteriophage and its receptors.We also discussed the selection strategies of phage therapeutic agents based on the research foundation of phage-host interaction mechanism.It is aimed to provide a solid theoretical foundation for the further study of the mechanism of interaction between phages and their host bacteria,modification of phages and creation of phage biocidal agents.Keywords:tailed bacteriophage;structure;receptor-binding protein;receptor;selection strategy for phage therapeutic biological agents2023,39(6)89李托等：有尾噬菌体的结构及其受体研究进展速发展和成本降低，关于噬菌体基因组测序及其多样性的研究不断深入，也有学者提出了基于噬菌体基因组系统进化同源性的噬菌体重新分类标准，即将有尾噬菌体目（Caudovirales）修改为有尾噬菌体纲（Caudoviricetes），并按照噬菌体基因组序列之间的同源性将其划分为不同的目（Order）、科（Family）、亚科（Subfamily）、属（Genus）、种（Species）的新型噬菌体分类方法2。但是，不管是传统的有尾噬菌体分类方法，还是基于噬菌体基因组系统进化同源性的噬菌体新型分类方法，以形态学为基础的噬菌体描述将会继续存在且永久使用，诸如肌尾噬菌体（Myophages）、长尾噬菌体（Siphophages）和短尾噬菌体（Podophages）等这些术语及其对噬菌体的描述2。另外，本文主要在阐述有尾噬菌体受体结合蛋白及其受体的基础上，旨在提供一些基于噬菌体与宿主菌互作研究基础上的噬菌体治疗制剂的选择策略。所以，本文仍然采用传统的噬菌体分类方法，对有尾噬菌体形态学结构介绍的基础上，阐述有尾噬菌体及其受体结合蛋白的类型和结构，以及噬菌体受体方面的研究进展，讨论了基于噬菌体与宿主菌互作研究基础上的噬菌体治疗制剂的选择策略，以期为理解噬菌体-宿主菌互作机理、改造噬菌体和创制噬菌体生物杀菌制剂提供坚实的理论基础。1 有尾噬菌体形态结构肌尾科噬菌体（Myophages）具有可收缩的长尾，尾根有 6 根长的、可收缩的尾部纤维、基板结构、尾钉或中央尾纤维等结构3，典型代表有 T4 和 Mu噬菌体等（图 1-A）。尾管（tail tube）顶端连接衣壳，尾管底部连接噬菌体的基板结构（baseplate），尾管表面有能使其伸缩的尾鞘（sheath），衣壳和尾管之间由衣领（collar）结构连接。基板结构是肌尾科噬菌体和长尾科噬菌体特有的一种存在于尾根的蛋白质结构，由噬菌体尾根和尾根附属物构成，噬菌体的尾部纤维、尾钉和中央尾针等附着于基板结构4。长尾科噬菌体（Siphophages）具有不可收缩长尾和基板结构，没有尾鞘，典型代表有肠杆菌噬菌体 和 T5 噬菌体等（图 1-B）。短尾科噬菌体（Podophages）具有不可收缩的短尾，没有尾鞘，上半部分直接由一个接合器蛋白（tail adaptor protein）连接短尾和衣壳，底部喷嘴结构由 6 或 12 条尾部纤维或尾钉组成，没有基板结构5，典型代表为肠杆菌噬菌体T7 和沙门噬菌体 P22 等（图 1-C）。有尾噬菌体的尾部结构决定着噬菌体的特异性和感染过程6-7。噬菌体依靠其尾部的受体结合蛋白（receptor-binding proteins,RBPs），包括尾部纤维（tail fibres）、尾钉（tail spikes）和基板结构（baseplate）等，与细菌表面受体（脂多糖、磷壁酸、菌毛等）相互作用和识别，并发生结合4,8，继而注入噬菌体 DNA9，最终完成子代噬菌体组装和裂菌过程。噬菌体裂解细菌的特异性主要取决于噬菌体受体结合蛋白与其受体的相互识别10。经典的研究证实，T4 噬菌体基板结构含有短的（gp12）和长的（gp34-gp37）两种尾部纤维，在与受体相互作用的过程中，6 根长的尾部纤维会交替形成折叠和伸展状态的不同结构7。首先，一根伸展的长的尾部纤维可逆地、特异性地识别宿主特定受体（如 LPS、OmpC 等）；紧接着，第二根长的尾部纤维在第一根长的尾部纤维解离之前结合到特定受体的特定位点，通过重复使用不同伸展状态下长的尾部纤维能够使噬菌体不断移动并最终找到合适的作用位点，再由短的尾部纤维进行不可逆地吸附，最终进行基因组注入7。在此过程中，第一步的可逆吸附决定着 T4 噬菌体的宿主范围。当 6 根长的尾部纤维中的 2 根或 3 根和受体结合后，刺激基板的形态构造发生变化，从而使得一些短的尾部纤维不可逆地结合受体（LPS 的外核心寡糖等）。基板进一步变形、变大，最终使其余短的尾部纤维与受体结合，噬菌体尾鞘（sheath）快速收缩，推动尾管（tube）使其穿入细菌膜7，最后注入基因组。所以，研究和寻找噬菌体受体结合蛋白及其受体对深入解析噬菌体的作用方式尤为重要。2 有尾噬菌体受体结合蛋白有尾噬菌体的受体结合蛋白具有较强的遗传可塑性，随着宿主菌和环境的变化，噬菌体能够进行适当的遗传变化，一定意义上具备持续感染宿主的功能。2.1 尾钉（tail spikes）有尾噬菌体的尾钉结构存在于尾根结构（基板或尾部纤维组成）的中央，也称为中央尾纤维（central 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.690tail fibre）4。噬菌体 P22 的 gp22 蛋白结构是研究较为透彻的一个尾钉蛋白。它由一个 3 聚体结构组成，每一个亚基蛋白有 3 个结构域。N（氨基）末端颗粒结合结构域（particle-binding domain）附着于噬菌体尾巴11，C（羧基）末端受体结合结构域介导 O-抗原的附着，并具有糖苷酶活性，切割 O-抗原并使其暴露于外膜12。颗粒结合结构域与受体结合结构域（receptor-binding domain）通过一个构象高度可变的连接短肽（short linker peptide）连接在一起。当连接肽的构象改变信号传递到颗粒结合域引发 DNA 注入11。一般地，P22 类噬菌体具有保守的颗粒结合域和可变的受体结合域13。然而，一些 p22 类噬菌体，如 sp6 含有和 P22 一样的受体结合结构域，而有着其他噬菌体的颗粒结合结构域14。短尾噬菌体SP6（感染沙门氏菌）和肌尾噬菌体 Det7 分别具有相似的尾钉蛋白 gp49 和 gp207，暗示不同类型噬菌体之间存在受体结合区之间的信息交流15。假单胞菌噬菌体 LKA1 尾钉蛋白含有 O5 血清型特异性多糖裂解酶16。VI 类噬菌体（感染沙门氏菌）具有类似于短尾噬菌体 p22 样尾钉结构15,17，其尾钉结构中含有识别胞外多糖和去乙酰化的结构域，能够识别含有 Vi 抗原的荚膜（Vi 荚膜）和没有 Vi 荚膜的细菌18。总之，尾钉结构较为保守，但是其受体结合结构域的变化赋予噬菌体识别宿主的特异性。此外，尾钉蛋白还通常携带降解细胞壁和促进 DNA 注入的一些酶类。2.2 尾部纤维（tail fibres）与尾钉不同，尾部纤维通常没有酶的功能。T4噬菌体尾部长纤维研究最为深入，由 4 种不同蛋白质组成，呈铰接式腿状（articulated leg-like shape）结构19。近端段（“大腿”）由 gp34 蛋白同型三聚体组成，远端段（“小腿”）由 gp36 蛋白三聚体和gp37 蛋白三聚体组成，两者由 gp35 单体构成的铰链（“膝”）连接在一起。其中，蛋白三聚体的形成和组装需要噬菌体编码的伴侣蛋白参与20。gp37 的受体结合区域是一个复杂的、三聚体相互交织的结构，分为球状衣领结构域（globular collar domain）、细长针状结构域（elongated needle domain）和头部结构域（head domain）。球状衣领结构域是一个三聚体结构，其中每个单体包括两个反向平行 折叠片和一个 螺旋。相反，针状结构域是一个长的反向平行的 桶状蛋白，由 3 个多肽组成。铁离子把这些不同的蛋白片段链连接在一起，成为交织的核心，头部结构域包含与宿主结合的残基21。有研究表明头部结构域垂直结合到 Omp C 多聚体结构的中心，其侧面在多个位点与孔蛋白的胞外环相互作用22。另外，T4 噬菌体的短尾纤维有一个简单的三股 螺旋结构23，由 gp12 蛋白形成同型三聚体24。同源三聚体的 N 末端部分附着在基板上，而 C 末端部分与宿主受体结合23。C 末端结构域含有金属锌离子结合位点23，此结构域的正确折叠需要伴侣蛋白参与25。短尾纤维与隐藏在基板中的受体结合区域连接，在结构蛋白 gp10 帮助下实现旋转和伸展26，并最终与受体结合。与 T4 噬菌体不同，关于长尾噬菌体和短尾噬菌体尾部纤维结构的研究不多。长尾噬菌体 T5 的 L 型 pb1 纤维是由一个具有子弹状的 螺旋远端结构域和一个近端结构域组成的多聚体27。短尾噬菌体 T7 的尾部纤维是拉长的 gp17 蛋白同型三聚体，折叠不需要噬菌体伴侣蛋白，颗粒结合结构域相对保守28，受体结合结构域则各不相同，用以识别不同的宿主29。总体来说，有尾噬菌体尾部纤维具有与尾钉相似的模块化结构（颗粒结合结构域和受体结合结构A：肌尾科噬菌体；B：长尾科噬菌体；C：短尾科噬菌体A:Myophages;B：Siphophages;C:Podophages图 1 有尾噬菌体的 3 种典型代表结构Fig.1 Three typical representative structures of tailed bacteriophages2023,39(6)91李托等：有尾噬菌体的结构及其受体研究进展域）。然而，尾部纤维在结构上通常比尾钉复杂，且需要伴侣分子才能正确折叠、发挥功能。与尾钉一样，尾部纤维也具有高度可变的受体结合结构域，参与可逆和/或不可逆吸附。虽然在尾部纤维基因中也发现了编码解聚酶的区域，但它们没有酶活30。尾部纤维触发噬菌体一系列的构象变化，最终使噬菌体衣壳中的 DNA 注入宿主菌。2.3 透膜蛋白（membrane-penetrating proteins）噬菌体尾巴尖端需要穿透革兰氏阳性菌厚厚的肽聚糖和内膜结构，以及革兰氏阴性菌较薄的细胞壁和内、外细胞膜屏障。对于革兰氏阴性菌外膜蛋白的结构及功能研究较多，但对于噬菌体是如何穿透细菌内膜结构的机制尚不清楚，但可能涉及 gp27或卷尺测量蛋白（tape measure protein）gp29。pb2和 HK97 分别是肠杆菌长尾噬菌体 T5 和 HK97 的卷尺测量蛋白，形成连接宿主细胞外膜和内膜的通道。pb2 有 3 个结构域：一个横跨尾巴的卷曲螺旋结构域，作为触发和打开头-尾连接器通道的传感器；一个由两个 螺旋构成的跨膜结构域；和一个金属肽酶基序31，跨膜结构域和金属肽酶结构域位于由pb5 形成的纤维内。pb5 与宿主受体 FhuA 的结合引起 pb2 构象发生变化，导致噬菌体衣壳 DNA 释放。同时，pb2 金属肽酶降解肽聚糖，使外膜和内膜融合，形成 DNA 转移孔31。目前还不清楚 pb2 是如何使膜融合的，相比之下，其他长尾噬菌体（如噬菌体 HK97）需要宿主蛋白才能穿透膜。遗传研究表明，HK97 进入细胞质，并在宿主伴侣分子 FkpA 协助下，组装成导管。HK97 随后与内膜葡萄糖转运蛋白 PtsG 相互作用，并锚定在外膜和内膜表面，从而使噬菌体 DNA 进入细菌胞质32。短尾噬菌体 P22针状蛋白 gp26 是一种同型三聚体的扭曲纤维，针头的 N 端结构域是由疏水分子和 螺旋形成，其功能是门脉蛋白通道的塞子33。C 端包含 3 个 螺旋和一个 螺旋结构域，介导细胞膜的穿透34。芳香族酪氨酸残基位于 gp26 针头的末端，通过侵入外膜，启动与宿主的接触，从而使膜发生融合并触发构象变化。与 P22 一样，芽孢杆菌短尾噬菌体 29 有一个能穿透细胞的尾端，但是这个尾尖是 gp9 和 gp13蛋白形成的一个“球状突出物”结构35。gp9 是一个圆柱形的、类似管状的检测器，它有一个 桶状蛋白 N 端域，一个由/和一个中间 结构域组成的中心管，以及顶端的另一个 结构域；一个疏水的长环（L 环）从靠近尖端 结构域的内壁突出，并填充了大部分管的内部；在脱离管时，L 环形成一个圆锥状的尖端，穿透膜并形成一个通道，以便DNA 释放到细胞中36。此外，该复合物含有 gp13蛋白酶活性用来降解肽聚糖35。透膜蛋白在结构和功能上有别于噬菌体尾部纤维和尾钉结构。主要功能是突破细胞边界。此外，一些膜穿透蛋白还参与吸附宿主受体，决定着噬菌体的宿主谱范围，比如像噬菌体的gpJ透膜蛋白37。3 有尾噬菌体受体噬菌体与细菌相互作用的特异性不仅依赖于噬菌体受体结合蛋白，而且决定于宿主菌表面的受体类型及结构。目前研究确认的受体几乎都被定位在细菌结构中。革兰阴性菌由两层膜包围：内膜和外膜。内膜由磷脂组成；外膜内侧是磷脂，外侧是由 O 抗原、核心多糖和脂质A组成脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）；外膜上还镶嵌有大量的外膜蛋白。细菌的外膜蛋白和脂多糖是革兰氏阴性菌（如志贺菌、埃希菌属、霍乱弧菌属等）噬菌体最重要和最广泛的受体（表 1）。然而，对于革兰氏阳性菌，细菌的肽聚糖结构、磷壁酸及细菌的附属结构都可以作为噬菌体受体（表 2）。3.1 革兰氏阴性菌噬菌体主要受体脂多糖是革兰氏阴性菌最常见的噬菌体受体，如裂解鼠疫耶尔森氏菌和结核耶尔森氏菌的phiA112268，裂解小肠结肠炎耶尔森氏菌的 Phi-YeO3-1269，裂解鼠伤寒沙门氏菌的 P2270，以及裂解铜绿假单胞菌的 PaP1 等71都以宿主 LPS 作为其受体。有些噬菌体通过识别核心寡糖感染宿主 菌22，而有些是通过识别 O 抗原吸附到细菌表 面72。尽管 LPS 核心多糖结构保守，但是 O-抗原的存在会阻止噬菌体与 LPS 核心多糖的结合73。噬菌体可以利用尾部纤维识别并水解 O-抗原16，短尾噬菌体 T7 和长尾噬菌体 SSU5 分别利用尾部纤维gp17 和 gp22 结合志贺氏菌、埃希氏菌和沙门氏菌的脂多糖6,43。同一种噬菌体与不同种属的细菌相互生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.692作用，可以识别和结合脂多糖核心多糖的不同结构，并且结合难易程度决定着噬菌体裂菌谱范围74。另外，有些噬菌体结合细菌的外膜蛋白，像维生素 B12摄取蛋白 BtuB51、离子泵蛋白 TolC75、铁 运 输 蛋 白 FhuA76、TonB44、OmpC55和OmpF56等。很多大肠杆菌的外膜蛋白都是噬菌体受体，噬菌体 Sf6 以外膜蛋白 OmpA 表面环和 OmpC为受体77，外膜蛋白 OmpW 是霍乱弧菌噬菌体 VP5的受体78。除此之外，不同噬菌体吸附细菌表面受体不同，可能是单一受体也可能是多个受体，单一受体如 噬菌体受体79，而外膜蛋白 Ail 和 OmpF共同介导噬菌体 Yep-phi 的特异性56。噬菌体 Sf6（短尾噬菌体）与宿主菌相互作用的过程中，LPS充当一级受体介导初始的、可逆的结合80，随后OmpA 或 OmpC 充当二级受体，介导不可逆的相互作用60。对噬菌体 Bp7 的研究表明，大肠杆菌 K-12表面的 LamB 和 OmpC 蛋白是 Bp7 第一步可逆吸附的特定受体，多糖内核 HepI 作为噬菌体 Bp7 识别的第二个受体，对噬菌体 Bp7 的感染至关重要55。肌尾科噬菌体 T4 也能够同时以 OmpC 和脂多糖为受表 1 革兰氏阴性菌噬菌体受体结合蛋白与受体类型Table 1 Gram-negative bacteria-specific bacteriophage receptor binding proteins and receptors噬菌体类型Phage type特征Features噬菌体Phage species宿主细菌Host bacterium噬菌体受体结合蛋白Receptor-binding protein受体Receptor参考文献References肌尾科噬菌体Myoviridae具有长的可收缩尾巴Long contractile tailT2、T4大肠杆菌 Escherichia coli尾部纤维OmpC、OmpF22,38SPN3US沙门氏菌 Salmonella enterica尾部纤维鞭毛39MAM1沙雷氏菌属、克鲁维菌属Enterobacterial genera Serratia and Kluyvera尾钉荚膜 40Det7沙门氏菌 S.enterica尾钉脂多糖15JG004铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa-脂多糖41长尾科噬菌体Siphoviridae具有长的不可收缩尾巴Long non-contractile tailT5大肠杆菌 E.coli尾部纤维脂多糖 O 抗原42SSU5沙门氏菌 S.enterica尾部纤维脂多糖核心多糖 43、TLS、H8、phi2013大肠杆菌E.coli尾部纤维LamB、TolC、FepA、FhuA44-47iEPS5沙门氏菌 S.enterica尾部纤维鞭毛48DMS3铜绿假单胞菌 P.aeruginosa尾部纤维菌毛49Vi-II沙门氏菌 S.enterica尾钉荚膜189NA沙门氏菌 S.enterica尾钉脂多糖33phiChi13、phiCbKCaulobacter crescentus衣壳 鞭毛50SPC35沙门氏菌 S.enterica尾部纤维BtuB51SPN7C、9C、10H、12C、14、17T、18沙门氏菌 S.enterica-鞭毛 Flagella、BtuB、脂多糖 O抗原52短尾科噬菌体Podoviridae具有短的可收缩尾巴Short contractile tailT3、T4、T7大肠杆菌 E.coli尾部纤维LPS,OmpC6,53-54Bp7大肠杆菌 E.coli-LamB、OmpC、HepI 55Yep-phi鼠疫耶尔氏菌 Yersinia pestis尾部纤维Ail、OmpF56MPK7铜绿假单胞菌 P.aeruginosa尾部纤维IV 型菌毛57phiK1-K5大肠杆菌 E.coli尾钉荚膜58P22沙门氏菌 S.enterica尾钉脂多糖 O 抗原59Sf6志贺氏杆菌 Shigella flexneri尾钉OmpA602023,39(6)93李托等：有尾噬菌体的结构及其受体研究进展体进行吸附22。由于已经鉴定出很多外膜蛋白都可以作为噬菌体受体（OmpA、OmpF、OmpC、Ail、LamB、FepA、TolC、TonB、BtuB 等）4，并且它们结构上具有一定的相似性81，推测这些不同外膜蛋白的同源区域对于噬菌体发挥作用具有重要意义。3.2 革兰氏阳性菌噬菌体主要受体革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分是由 N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸与 4-5 个氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子肽聚糖结构。N-乙酰氨基葡萄糖和 N-乙酰胞壁酸重复交替排列构成肽聚糖的骨架，短肽通过羟基附着在 N-乙酰胞壁酸上。除此之外，革兰氏阳性菌细胞壁还含有由核糖醇或甘油经磷酸二键连接而成的磷壁酸。对于金黄色葡萄球菌，长尾科噬菌体优先结合到细胞壁的支链及其取代基，而肌尾科噬菌体更倾向于结合肽骨架63。磷壁酸能够作为金黄色葡萄球菌噬菌体的受体63。但是，金黄色葡萄球菌噬菌体对磷壁酸是可逆性吸附，不可逆的吸附需要肽聚糖的四肽短链74或者肽聚糖胞壁酸 O-乙酰基82。除此之外，噬菌体还可以识别革兰氏阳性菌的一些蛋白质，比如炭疽杆菌细胞壁GamB 蛋白、枯草芽孢杆菌 YueB83、乳酸菌噬菌体侵染蛋白 Pip84。噬菌体还可以结合乳球菌一种独特的细胞壁多糖结构-细菌薄膜，膜的半保守核心基序促进了噬菌体的初始结合，其余膜聚合物之间的差异决定其特异性85。另外，细菌可以通过交换细胞表面成分，改变它们对噬菌体的敏感性，如YueB 蛋白介导的枯草芽孢杆菌细胞表面物质交换使得噬菌体 SPP1 能够感染以前不敏感的菌株86。到目前为止，革兰阳性细菌中发现的噬菌体受体比革兰阴性菌要少很多，造成这种差异的主要原因是革兰氏阳性菌致密的细胞壁和鉴定这些受体面临技术上的一些限制。随着科学技术的进步和研究噬菌体手段的革新，比如冷冻电镜技术的应用和发展，将有望探秘更多革兰氏阳性菌噬菌体受体。3.3 细菌的附属结构作为噬菌体受体3.3.1 鞭毛和菌毛作为噬菌体受体 细菌的附属结构鞭毛87和菌毛57,88也能够作为噬菌体受体。如沙门氏菌 Ieps548、柄杆菌噬菌体 phiCbK50、芽孢杆菌噬菌体 PBS189通过其尾部纤维结合细菌鞭毛蛋白 FliC、FliCB 和 FliK，随着鞭毛的运动最终将噬菌体传递到它们的最终受体90。长尾噬菌体 AcM4和 AcMS2 特异性地利用尾巴与鞭毛结合，尾部末梢则吸附细菌表面91。另外，假单胞菌有尾噬菌体常利用细菌菌毛为其识别受体，噬菌体 phiKMV92和MPK757特异性地结合 IV 型菌毛。此外，铜绿假单胞菌还可通过糖基化 IV 菌毛的方式阻断噬菌体吸附93。噬菌体与细菌附属结构的有效结合，也增加了噬菌体对细菌附着和侵染的概率50。3.3.2 荚膜和黏液层作为噬菌体受体 有些细菌产生多糖荚膜或/和黏液层。这些结构可以阻止噬菌体进入并结合细胞壁受体，但同时也是噬菌体吸附的受体94。沙门氏菌和大肠杆菌的荚膜含有 Vi 抗表 2 革兰氏阳性菌噬菌体受体结合蛋白与受体类型Table 1 Gram-positive bacteria-specific bacteriophage receptor-binding proteins and receptor types噬菌体类型Phage type特征Features噬菌体Phage species宿主细菌Host bacterium噬菌体受体结合蛋白Receptor-binding protein受体Receptor参考文献References肌尾科噬菌体Myoviridae具有长的可收缩尾巴Long contractile tail炭疽杆菌 Bacillus anthracis尾部纤维GamR61A511李斯特菌 Listeria monocytogenes 尾部纤维磷壁酸，肽聚糖62812、K金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus-磷壁酸63长尾科噬菌体Siphoviridae具有长的不可收缩尾巴Long non-contractile tailIL-H德氏乳酸杆菌Lactobacillus delbrueckii 尾部纤维磷壁酸64SPP1枯草芽孢杆菌 B.subtilis尾钉YueB65SLT金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus中央尾尖磷壁酸66短尾科噬菌体Podoviridae具有短的可收缩尾巴Short contractile tailphi29枯草芽孢杆菌 B.subtilis尾钉磷壁酸35P2乳酸乳球菌 Lactococcus lactis尾部纤维细胞壁67生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.694原，沙门氏菌噬菌体 ViO117和肺炎克雷伯氏菌肌尾噬菌体 o507-KN2-195能够与 Vi 抗原结合。其中，荚膜发挥一级受体的功能，而细胞壁介导不可逆 结合96。4 基于噬菌体-宿主菌互作机理研究的噬菌体治疗制剂选择策略理解噬菌体受体结合蛋白及其受体的具体位置、功能及其互作机理能够为革新和创新噬菌体治疗方法打开一扇大门。噬菌体治疗的最大优势是它的多样性和多功能性，众所周知，自然界中的噬菌体数量几乎是无限的，可以通过设计噬菌体鸡尾酒制剂，寻找新型噬菌体衍生抗菌剂，以及利用噬菌体抗性突变等途径，为噬菌体及其生物制剂的研发和应用提供选择策略。4.1 噬菌体鸡尾酒制剂细菌具有快速进化出噬菌体抗性表型的特征97，为了提高裂菌效果和克服噬菌体抗性突变的产生，多种不同噬菌体混合后制成噬菌体鸡尾酒制剂无疑是一个不错的选择。但是，噬菌体鸡尾酒制剂并不是各种不同噬菌体的随机混合，而是通过理论上的优选或排除等优化设计，基于科学试验得出的不同噬菌体混合物98。噬菌体鸡尾酒中的噬菌体越多，其药代动力学、药效学和安全性就越难预测，生产也越发复杂99。所以，可以利用噬菌体受体结合蛋白及其受体的类型作为优化鸡尾酒的标准。例如，可以优先考虑针对相同宿主菌不同受体的噬菌体之间的组合，以减少产生噬菌体抗性的可能性和噬菌体之间潜在拮抗作用。Yang 等100设计针对铜绿假单胞菌的噬菌体鸡尾酒制剂中含有针对 O 抗原的噬菌体，以及能够对 O 抗原产生抗性以后发挥作用的 O 抗原截短体的第二噬菌体。Tanji 等101将针对两种不同受体的噬菌体结合起来，与单噬菌体治疗相比，成功延迟了大肠杆菌 O157:H7 噬菌体的抗性表型出现的时间。Gu 等102设计了一种针对肺炎克雷伯菌的噬菌体鸡尾酒，用 3 种噬菌体靶向 3 种不同的受体，取得了较好的治疗效果。除此之外，还可以通过分离可以结合一种以上不同受体或可以与同一受体的不同构象结合的噬菌体，实现噬菌体制剂的研发。Takeuchi 等103研究了葡萄球菌 Twort样噬菌体利用细胞壁中的磷壁酸作为其受体，而宿主的糖基化修饰并不影响噬菌体受体的功能，使其成为噬菌体鸡尾酒制剂的理想成分。使用基于优化受体的噬菌体鸡尾酒，可以最大限度地发挥其裂菌作用范围，同时可以有效降低噬菌体抗性产生的几率。4.2 新型噬菌体衍生抗菌剂对于某些噬菌体来说，到达位于细胞膜深层的受体需要突破诸如生物膜、荚膜或脂多糖等生物屏障，还有的噬菌体与受体的结合过程需要对受体本身进行一些必要的酶解104。在这种情况下，成功吸附到受体需要噬菌体进行一些精确的酶切，以避免噬菌体在自身遗传物质复制完成之前对细菌的生存能力造成致命的损伤。噬菌体基因组编码许多能够执行这些功能的酶，这些蛋白质位于噬菌体的尾部纤维、尾钉或基板结构中，也包括一些噬菌体透膜蛋白，其中许多酶都能独立地表现出一些抗菌特性105。例如，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的有尾噬菌体通常均含有肽聚糖降解酶，包括内肽酶106、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶107、N-乙酰葡萄糖胺酶108-109、溶菌酶110、糖基转移酶111等。N-乙酰-D-葡萄糖胺酶和 N-乙酰-D-胞壁酸酶都能作用于细菌细胞壁上的多糖；内肽酶水解肽链和交联桥之间的氨基或肽键连接体；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶能够水解连接糖链和肽基的酰胺键。虽然这些酶不是噬菌体感染细菌所必须，但是它们具有局部降解肽聚糖或使肽聚糖层结构发生变化的功能112，在特定的条件，能够为噬菌体有效侵染细菌提供便利。有些噬菌体尾钉蛋白中的果胶裂解酶能够作用于糖苷键，从而使细菌毒力减弱113。不同类群 Vi 噬菌体的乙酰酯酶能够作用于多糖结构中的乙酰基18。感染具有荚膜细菌的噬菌体通常编码一些针对细菌生物膜活性的酶类114。有研究证 实，解聚酶被噬菌体用来接触多糖隐藏的受体，或者在多糖链是受体的情况下，解聚酶将其自身裂解，从而起到稳定附着的作用115。Born 等116对Erwinia amylovora 噬菌体的研究证实，噬菌体衍生蛋白（包括解聚酶）可以用来揭开深层噬菌体受体的面纱，继而引发对宿主细菌的感染。另外，大多数2023,39(6)95李托等：有尾噬菌体的结构及其受体研究进展有尾噬菌体具有裂解酶-穿孔素裂菌系统，可以通过克隆、表达噬菌体裂解酶和穿孔素蛋白，或通过分子设计和表达一些裂菌模块蛋白117，都能发挥理想的裂菌功效。所以，理解噬菌体受体结合蛋白及其受体的位置和结构，以及噬菌体与宿主菌互作过程，有助于发现或设计新的噬菌体衍生抗菌物质。4.3 认识和利用噬菌体抗性突变在致病菌中，多数噬菌体受体是具有重要作用和功能的毒力因子，这些受体包括荚膜多糖、黏附素、侵袭因子和 LPS 的不同成分等。这些重要结构的改变或丢失均会导致噬菌体抗性突变的发生，同时影响了细菌毒力和生理功能118-119。因此，这也是噬菌体治疗的一个优点。铜绿假单胞菌噬菌体 OMKO1的受体是药物外排泵的膜成分，随着该受体功能的丧失，噬菌体出现抗性突变，在没有外排泵的情况下，耐药菌株的抗生素敏感性也得到了恢复120。Filippov 等121在鼠疫耶尔森菌脂多糖（LPS）的不同部位为 8 种噬菌体鉴定出了 6 种受体。然后，他们研究了噬菌体耐药性与 LPS 生物合成不同酶的突变体之间的关系，发现 LPS 分子的不同截短体影响了细菌毒性的强弱。Capparelli 等122确定噬菌体MSa使用细胞壁的 N-乙酰氨基葡萄糖作为其受体，受体一旦丢失或被破坏，噬菌体抗性突变体表现出生长下降和基因表达失调。Gordillo Altamirano 等123发现，鲍曼不动杆菌噬菌体利用细菌荚膜作为其受体，破坏细菌荚膜物合成的基因后，噬菌体无法完成吸附过程而产生抗性。鲍曼不动杆菌在失去荚膜后，无法形成生物膜，在小鼠菌血症模型中失去了毒性，并且易受多种抗菌剂的影响。或者，使用纯化的噬菌体解聚酶也可以获得和细菌荚膜丢失类似的临床效果124-125。另外，Kim 等126研究发现，噬菌体 SPC35 能够裂解大肠杆菌和肠道沙门氏菌，其发挥裂菌作用的受体为参与维生素 B12摄取的膜蛋白 BtuB。虽然通过破坏受体而产生的这种噬菌体抗体突变体的毒力降低不会受到多大影响127，但是通过细菌营养素的调控作用可能对细菌的生长等产生重要影响。综上所述，基于受体改变或丧失的噬菌体抗性突变的应用是噬菌体治疗制剂选择的可行策略。Capparelli 等122建议将对噬菌体产生抗性突变的菌株用作疫苗。Gordillo Altamirano 等123研发了一种针对鲍曼不动杆菌的噬菌体治疗模型，该模型利用了通过细菌荚膜丢失而出现的抗菌药物再敏化现象，该模型在鲍曼不动杆菌败血症的临床案例研究中得到了很好的应用128。5 总结与展望虽然关于噬菌体与宿主相互作用的机制研究报道较多，但是，由于噬菌体及其受体结合蛋白的结构复杂多样、作用方式千变万化，所以很多机理性问题还有待于进一步探索。虽然噬菌体受体结合蛋白结构很难预测，但其模块化的结构（如 C 端结构域的变化改变着其识别宿主的范围）为噬菌体的功能研究提供了可行的思路和方法。噬菌体受体的结构多样性揭示了噬菌体与细菌共同进化的过程和噬菌体宿主特异性的形成。此外，同一株噬菌体可能具有感染和裂解除宿主菌之外的其他种属的细菌，在这个过程中往往识别的是不同的受体。所以，研究宿主受体与噬菌体特异性仍然面临着诸多挑战。理解噬菌体与宿主相互作用的机制将为噬菌体的人工改造、噬菌体鸡尾酒制剂的研制和