响应面优化畜禽归芪益母汤酶解提取工艺.pdf

河南农业科学，2 0 2 3,52(7)：12 5-135Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.07.013响应面优化畜禽归芪益母汤酶解提取工艺刘雪松1-2，薛沾枚1-2，杨庆稳”，张艳2，孟维珊2，王爽12，陈曦-2，杨旭东12,罗天瑶1.2，朱庆贺1,2 钟鹏1.2（1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔16 10 0 5；2.黑龙江省兽用药物重点实验室，黑龙江齐齐哈尔16 10 0 5；3.重庆三峡职业学院动物科技学院，重庆40 4155）摘要：为了掌握传统中兽药畜禽归芪益母汤最佳纤维素酶提取工艺，采用单因素试验结合响应面优化法对提取工艺进行优化，包括酶解时间、温度、pH值，并测定优化后畜禽归芪益母汤酶解提取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度。结果表明，畜禽归芪益母汤最佳纤维素酶酶解工艺为温度50、pH值为5.0 的条件下提取9h,提取后酶解液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为0.2 17 mg/mL,阿魏酸质量浓度为0.12 2 mg/mL,与模型预测值相近。与传统提取方法相比,纤维素酶酶解提取的畜禽归芪益母汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度分别提升48.6 3%和6 9.52%。关键词：畜禽归芪益母汤；响应面法；中药酶解；提取工艺中图分类号：S853.7Optimization of Enzymatic Hydrolysis and Extraction Process ofLivestock and Poultry Guiqi Yimu Decoction by Response SurfaceLIU Xuesong2,XUE Zhanmei*2,YANG Qingwen,ZHANG Yan2,MENG Weishan2,WANGShuang2,CHEN Xi2,YANG Xudong*2,LUO Tianyao-2,ZHU Qinghe*2,ZHONG Peng0:1,2(1.Branch of Animal Husbandry and Veterinary,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Qiqihar 161005,China;2.Heilongjiang Key Laboratory of Veterinary Drugs,Qiqihar 161005,China;3.Department of Animal Science andAbstract:In order to obtain the best enzymatic extraction process of traditional Chinese veterinary druglivestock and poultry Guiqi Yimu decoction,single factor experiment combined with response surfacemethodology was carried to optimize the enzymatic extraction process.The conditions for measurementincluded enzymolysis time,temperature,and pH value.The mass concentration of calycosin-7-O-D-glucopyranoside and ferulic acid in the enzymatic hydrolysis extract of livestock and poultry GuiqiYimu decoction was determined.The results showed that the optimal hydrolysis process of livestock andpoultry Guiqi Yimu decoction was as fllows:temperature was 50 ,e x t r a c t i o n t i me w a s 9 h,p H v a l u ewas 5.0.Under these conditions,the mass concentration of calycosin-7-0-D-glucopyranoside was0.217 mg/mL and the mass concentration of ferulic acid was 0.122 mg/mL,which were similar to the文献标志码：AMethodologyTechnology,Chongqing Three Gorges Vocational College,Chongqing 404155,China)文章编号：10 0 4-32 6 8（2 0 2 3)0 7-0 12 5-11收稿日期：2 0 2 3-0 1-0 2基金项目：黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院2 0 2 2 年自拟课题（ZNKT-202207)；黑龙江省农业科学院院级课题资助项目（2 0 2 1YYYF008）；黑龙江省省属科研院所科研业务费项目（CZKYF2022-1-C010）；重庆市教委科研项目（KJQN201903509）；黑龙江省重点研发计划项目(GA21B006)作者简介：刘雪松（1993-），男，黑龙江齐齐哈尔人，研究实习员，硕士，主要从事中兽药制剂与分析研究。E-mail:通信作者：钟鹏（197 8-）,男，内蒙古赤峰人，研究员，硕士，主要从事油饲兼用作物育种及栽培技术研究。E-mail:126model predicted values.Compared with the traditional extraction method,the mass concentration ofcalycosin-7-O-D-glucopyranoside and ferulic acid in the livestock and poultry Guiqi Yimu decoctionextracted by cellulase enzymatic hydrolysis increased by 48.63%and 69.52%,respectively.Key words:Livestock and poultry Guiqi Yimu decoction;Response surface method;Herb enzymolysis;Extraction process畜禽归芪益母汤是传统中兽药经典组方之一，收录于牛经备要医方中，是由内外伤辩惑论中补血汤加益母草组成，主治动物气血虚弱、产后血虚等，具有补气生血、活血祛瘀等功效。在方剂中，黄芪补脾和肺气，滋生血源，为君药；当归补血活血，使黄芪的补血效果更强，为臣药；益母草疏通气血，祛瘀生新，为佐使药2。畜禽归芪益母汤在兽医临床上应用较为广泛，可有效提高动物的生长水平、免疫能力和抗病能力，改善动物的血液生化指标，并可发挥产后保健作用3。中药提取是中药加工中非常重要的环节。传统中药提取方式，如煎煮法、浸渍法及渗流法等，因选择性差、热敏物质降解率高及杂质多等缺点，已不能满足现代的中药生产需求(4。面对这种情况，研究人员一直在探索着新型中药提取技术，用来满足现代中药生产需求5-8 。生物酶解提取中药有效成分是一种技术成熟的新型提取技术，该技术利用酶的高效性和专一性破坏中药细胞壁，使有效成分更加容易扩散出来，从而有效提高有效物质的浸出率，相比较于传统的煎煮法，生物酶解法具有热敏感物质降解率低、性价比高及设备简单等优势。生物酶解技术已发展多年，技术成熟，可有效提高中药中多糖、黄酮及生物碱等有效物质的提取率10-1。针对中药植物细胞壁的特点，常采用的酶种类包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、-甘露聚糖酶及蛋白酶等12 。畜禽归芪益母汤的提取依然采用传统煎煮法，存在药材中热敏物质降解率高、提取成本高及杂质多等缺点。鉴于此，以中药有效物质的质量浓度为指标，通过单因素试验、响应面优化试验对畜禽归芪益母汤的酶解提取工艺进行探索优化，以期掌握畜禽归芪益母汤最佳的提取工艺。1材料和方法1.1材料黄芪、当归及益母草药材由黑龙江省领康生物科技有限公司提供；纤维素酶（10 万U/g）、果胶酶（10 万U/g）、木瓜蛋白酶（10 万U/g）、-葡聚糖酶河南农业科学(4万U/g）及木聚糖酶（10 万U/g）等均购自宁夏和氏璧生物技术有限公司；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201907）、阿魏酸（批号110 7 7 3-2 0 1915）均购自中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇、色谱级乙睛均购自北京迪科马科技有限公司；分析级磷酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分析级甲酸购自辽宁泉瑞试剂有限公司。1.2试验仪器岛津LC20-AT液相色谱仪、SPD-M20A二级阵列管检测器、InertSustainC18色谱柱（2 50 mmx4.6mm，5m）等均为日本岛津公司产品；FS-250N超声波处理器为上海生析超声仪器有限公司产品；MS104TS电子分析天平为梅特勒-托利多有限公司产品；DH4000恒温培养箱为泰斯特仪器有限公司产品。1.3高效液相色谱条件按照文献13-14 的方法，建立毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸的液相色谱测定方法。毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱测定方法：以乙腈-0.2%甲酸溶液（14：8 6）为流动相，检测波长为2 6 0 nm，柱温为25,流速为1mL/min。阿魏酸色谱测定方法：以乙腈-0.0 8 5%磷酸溶液（17：8 3）为流动相，检测波长为316 nm，柱温35,流速为1mL/min。1.4畜禽归芪益母汤酶解液制备取黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院自制畜禽归芪益母汤酶解提取液，以350 0 r/min的条件离心2 0 min，取上清液滤过0.2 2 m滤膜后上机器进行检测。1.5标准曲线绘制精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品5mg至10mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度线，混匀，即得毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品储备液。通过稀释分别获得质量浓度为50、2 5、10、1、0.5g/mL的工作液，分别进样2 0 L至液相色谱仪，测定峰面积，绘制毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准曲线3。精密称定阿魏酸对照品2.4mg至10 mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解定容至刻度线，混匀，即得阿魏酸对第52 卷第7 期照品储备液。通过稀释分别获得质量浓度为2 4、12、6、3、1、0.5g/mL的工作液，分别进样2 0 L至液相色谱仪，测定峰面积,绘制阿魏酸标准曲线4。1.6方法学验证取自制畜禽归芪益母汤酶解提取液样品，测定6次，分别计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度，进行精密度测定；取同批次自制畜禽归芪益母汤酶解提取液样品6 份，分别测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度，进行重复性试验；将已知毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度的畜禽归芪益母汤酶解提取液样品分成3份，按照8 0%、100%和12 0%的比例分别加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸对照品，处理后测定质量浓度，进行回收率试验。1.7畜禽归芪益母汤酶解产物有效物质质量浓度测定将12 0 g黄芪、30 g当归和6 0 g益母草进行粉碎，过0.42 5mm孔径筛。将2 0 g中药粉加入10 0 mL水后分别调整到各个酶的最适pH值，分别加入纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、-葡聚糖酶及木聚糖酶。其中纤维素酶组和木聚糖酶组调节pH值至5.0,果胶酶组及木瓜蛋白酶调节pH值至7.0,调节-葡聚糖酶组pH值至5.5。酶底比为45%,在50 条件下酶解6 h，酶解后加热10 min使酶灭活。待酶解产物冷却后，按照文献9 的方法进行超声提取：超声功率2 50 W、频率50 Hz、温度50、时间30min，提取2 次。将提取液浓缩至2 5mL，取2.5mL浓缩提取液至2 5mL容量瓶中，加入7 0%甲醇定容到刻度，摇匀，按照1.4中的步骤处理后上机分别测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度。应用传统煎煮法对中药进行提取作为对照组。1.8纤维素酶酶解条件单因素试验称取2 0 g中药粉置于10 0 mL水中，酶底比为45%，酶解温度为50，pH值为5.0，酶解时间分别为3、6、9、12、2 4h，测定不同时间组酶解产物毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度。在酶解温度为50,pH值为5.0,酶解时间为9h，酶底比分别为5%、15%、30%、45%、6 0%的条件下，测定不同酶底比组酶解产物毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度。在pH值为5.0,酶解时间为9 h,酶底比为45%，酶解温度分别为30、40、50、6 0、7 0 的条件下，测定不同温度组酶解产物毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度。在酶解时间为9 h，酶底比为刘雪松等：响应面优化畜禽归芪益母汤酶解提取工艺及水平Tab.1Response surface factors and levels of enzymatichydrolysis extraction process of live stock and poultry因素Factor温度/cTemperaturepH时间/hTime2结果与分析2.1标准曲线绘制及方法学验证毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品和酶解提取产物的色谱图如图1所示。毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品和酶解提取液样品均在16.9 17.3min处出峰，且周围无杂质峰干扰。毛蕊异黄酮葡萄糖苷的标准曲线为Y=475.00X-908.33，决定系数（R）为0.9991。在精密度试验中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积相对标准偏差（RSD)为0.94%，精密度良好；在重复性试验中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积RSD为0.93%，重复性良好；在加样回收率试验中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均回收率为90.13%，RSD为1.97%，回收率良好。以上结果表明，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱方法可用于测定样品。阿魏酸对照品及酶解提取产物的色谱图如图2所示。阿魏酸对照品及酶解提取液样品均在2 6.2 27.6min处出峰，且周围无杂质峰干扰。阿魏酸的标准曲线为Y=455.00X-871.33，决定系数（R）为0.9987。在精密度试验中，阿魏酸峰面积RSD为1.01%，说明精密度良好；在重复性试验中，阿魏酸12745%，温度为50，分别调节pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的条件下，测定不同pH值组酶解产物毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度。1.9响应面法优化纤维素酶酶解条件依据单因素试验的结果，以响应面法中的Box-Behnken设计进行优化。在45%酶底比的条件下，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度为响应值，以酶解时间、酶解温度和pH值为自变量按表1设计三因素三水平的响应面优化试验，从而掌握畜禽归芪益母汤最佳酶解提取工艺。采用响应面法确定的最佳酶解工艺，进行5次平行试验验证预测结果。表1畜禽归芪益母汤酶解提取工艺响应面设计试验因素Guiqi Yimudecoction-1045504.55.089水平Level1555.510128峰面积RSD为1.0 4%，重复性良好；在加样回收率试验中，阿魏酸平均回收率为90.13%，RSD为1.8 8%，A60504030201000Fig.1 Chromatographic analysis results of clycosin-7-O-D-glucopyranoside reference substance sample(A)andA252015nvu10500Fig.2 Chromatographic analysis results of ferulic acid reference substance sample(A)and enzymatic hydrolysis extraction2.2酶解对畜禽归芪益母汤有效物质质量浓度的影响酶解对畜禽归芪益母汤有效物质质量浓度的影响表2 所示。由表2 可以看出，与应用传统方法提取的对照组相比，纤维素酶酶解产物中毛蕊异黄Tab.2Effect of enzymatic hydrolysis on the mass concentration of effective substances in livestock and poultry组别Group纤维素酶Cellulose果胶酶Pectase木瓜蛋白酶Papain-葡聚糖酶-Glucanase木聚糖酶Xylanase对照组 Control注：与对照组相比，*表示差异显著（P0.05），*表示差异极显著（P0.01)。Note:Compared with thecontrolgroup,*indicateds that thedfferenceissignificant(P0.05),*indicatedsthat thedference isextremelysignificant(P0.01).河南农业科学说明回收率良好。以上结果表明，测定阿魏酸的色谱方法可用于测定样品。B250PDAMulti1260nm,4nm200150nvu1005001020时间/minTime图1毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（A)及酶解提取样品(B)色谱分析结果enzymatic hydrolysis extraction sample(B)PAMulti1316n,4nm510时间/minTime图2 阿魏酸对照品(A)及酶解提取样品(B)色谱分析结果表2 酶解对畜禽归芪益母汤有效物质质量浓度的影响Guiqi Yimudecoction毛蕊异黄酮葡萄糖苷Calycosin-7-O-D-glucopyranoside0.1890.087*0.1760.057*0.0960.024*0.1720.035*0.1570.042*0.1460.093第52 卷PDA Multi 1.260nm,4nm304015200B175015001250nvu10007505002500250sample(B)酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度增幅最高，分别为29.45%和35.52%。纤维素酶使黄芪和当归细胞壁充分酶解，有效物质充分释放，故选用纤维素酶进行畜禽归芪益母汤的酶解提取。mg/mL阿魏酸Ferulicacid0.1030.057*0.0890.031*0.0490.012*0.0910.018*0.0830.027*0.0760.02310520时间/minTime1015时间/minTime3040PDMMult113160n,4nm202550第7 期2.3纤维素酶酶解条件单因素试验结果酶解时间对毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度影响如图3A所示，在3 9 h，随着酶解时间的延长，有效物质质量浓度也在不断增加，在9 12 h，有效物质质量浓度提升较小。酶底比对有效物质质量浓度影响如图3B所示，在酶底比为5%45%时，随着酶底比的增加，有效物质质量浓度不断提升；在酶底比为45%6 0%时，有效物质质量浓度几毛蕊异黄酮葡萄糖苷Calycosin-7-O-D-glucopyranosideA0.25(Tu/eu)/鲁号0.200.150.100.050.000C0.250.20(Tu/Aul)/0.150.100.050.0002.4纤维素酶酶解条件响应面优化试验结果按照表3的设计进行提取试验，建立毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程：Y=0.220+2.37510-3A+1.250 x10-3B-8.75010-4C-2.250 x10-3AB-1.00010-3AC+2.500 x10-*BC-0.016A2-0.012B-0.018C。经方差分析，模型F=41.11,P0.05（表4），说明回归模型拟合程度高。二次项A、B?及C对方程影响极显著。酶解温度与时间对毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度影响三维效应见图4A。在酶解温度相同时，随着时间增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。在酶解时间相同时，随着温表3酶解提取试验设计及优化结果Tab.3 Enzymolysis extraction experiment design and optimization results因素Factor温度(B)Temperature1-10-11129乎不变。考虑到性价比等因素，故采用45%酶底比进行下一步的试验。温度对有效物质质量浓度影响结果如图3C所示，随着温度提升，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度均呈现先上升后下降趋势，在50 左右质量浓度最高。pH值对有效物质质量浓度影响如图3D所示，随着pH值增加，2 种有效物质的质量浓度均呈现出先上升后下降趋势，在pH值为5.0 的条件下，2 种有效物质质量浓度最高。-阿魏酸FerulicacidB0.25 0.20(Tu/ul)/喜号0.150.100.050.00300D0.250.20(Tu/Aul)/喜号0.150.100.050.004060温度/pH(C)0-101-112040酶底比/%Enzyme substrate ratioPH800毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度/（mg/mL）Calycosin-7-O-D-glucopyranoside mass concentration0.1960.1930.2210.1910.194602.04.0pH806.08.0阿魏酸质量浓度/（mg/mL）Ferulic acidmass concentration0.1170.1120.1230.110.11210.0130序号时间（A)No.Time60708-19110011112113014115016-117-1Tab.4 Variance analysis of regression model with the content of calycosin-7-O-D-glucopyranoside as response value方差来源Source of variance回归模型Model时间(A)Time温度(B)TemperaturepH(C)ABACBCA2B2C2残差Residual失拟项Lack offit纯误差Pureerror总离差Cortotal注：*为极显著水平（P0.01)，下同。Note:*is extremely significant(P0.01),the same below.A(Tu/)/河南农业科学续表3酶解提取试验设计及优化结果Tab.3(Continued)Enzymolysis extraction experiment design and optimization results因素 Factor温度(B)Temperature10010000-10-10表4以毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为响应值回归模型方差分析平方和F值Sum of squaresFree degree3.5410-394.51x10-511.25x10-516.13x10612.0310514.00 x10612.5010-711.1310-316.2210-411.35x10-316.71x10-572.25x10636.4810-543.61x10-3160.230.220.210.200.190.1855.0053.0051.0049.00温度/47.0045.00Temperature第52 卷阿魏酸质量浓度/（mg/mL）毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度（mg/mL）Ferulic acidpH(C)Calycosin-7-O-D-glucopyranoside mass concentration10-100-11000019.008.50时间/hTimemass concentration0.1930.1110.2230.1210.1860.1080.1960.1180.2260.1230.1930.1110.1890.1110.2270.1220.1970.1160.2170.1260.1880.1140.1860.113自由度方差Variance3.9410-44.51x10-51.25x10-56.13x1062.0310-54.00 x1062.5010-71.1310-36.2210-41.35x10-39.58x1067.5010-71.6210-5B（T m/）/10.009.50P值FvaluePvalue41.110.000 1*4.710.066 61.300.29090.640.45022.110.18930.420.538 70.030.8762118.230.000 1*64.890.000 1*140.850.000 1*0.050.98490.230.220.210.200.190.185.505.305.104.904.704.5010.008.50时间/hTime第7 期Fig.4 Response surface analysis of the interaction among enzymatic time,temperature and pH value on the mass度增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度先增大后减小，响应面坡度明显。酶解pH值与时间对毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度影响三维效应见图4B。在pH值相同时，随着时间增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。在时间相同时，随着pH值增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。酶解pH值与温度对毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度影响三维效应见图4C。在pH值相同时，随着温度增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。在温度相同时，随着pH值增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度先增大后减小，响应面坡度明显。按照表3的设计进行提取试验，建立阿魏酸回归方程：Y=0.120+5.00010-4A+7.50010-B+2.500 x10-*C-2.500 x10-4AB-1.25010-3AC+2.50010-*BC-3.62510-A-3.12510-B-8.62510-3C。经方差分方差来源Source of variance回归模型Model时间(A)Time温度(B)TemperaturepH(C)ABACBCA2B2C2残差Residual失拟项Lackoffit刘雪松等：响应面优化畜禽归芪益母汤酶解提取工艺C0.230.220.210.200.190.185.505.305.104.904.70pH4.50图4酶解时间、温度和pH值对毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度交互作用的响应面分析concentration of calycosin-7-O-D-glucopyranoside表5以阿魏酸质量浓度为响应值回归模型方差分析Tab.5 Variance analysis of regression model with the content of ferulic acid as response value平方和Sum of squares4.5910-42.001064.501065.0010-72.5010-76.251062.5010-75.5310-54.111053.1310-42.451051.05105131温度/Temperature析，模型F=14.56,P0.05（表5），说明回归模型拟合程度高。二次项B对方程影响显著，A?和C对方程影响极显著。酶解温度与时间对阿魏酸质量浓度影响三维效应见图5A，在温度相同时，随着时间增加，阿魏酸质量浓度先增大后趋于平缓，响应面坡度较明显。在时间相同时，随着温度增加，阿魏酸质量浓度先增大后趋于平缓，响应面坡度较明显。酶解pH值与时间对阿魏酸质量浓度影响三维效应见图5B。在pH值相同时，随着时间增加，阿魏酸质量浓度先增大后趋于平缓，响应面坡度明显。在时间相同时，随着pH值增加，阿魏酸质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。酶解pH值与温度对阿魏酸质量浓度影响三维效应见图5C。在pH值相同时，随着温度增加，阿魏酸质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。在温度相同时，随着pH值增加，阿魏酸质量浓度先增大后减小，响应面坡度较大。自由度方差Free degreeVariance95.10 x10512.0010-614.5010615.0010-712.5010-716.25x10-612.5010-715.53x10514.1110513.1310-473.5010633.5010-6F值Fvalue14.560.571.290.140.071.790.0715.8111.7589.491P值Pvalue0.001 0*0.474 40.294 20.716 70.797 00.223 30.797 00.005 4*0.011 0*0.000 1*0.478 9132方差来源Sourceofvariance纯误差Pureerror总离差Cortotal注：*为显著水平(P0.05)。No t e:*i s s i g n i f i c a n t(P 0.0 5).A(u/u)/吾湿7Fig.5Response surface analysis of the interaction among enzymatic time,temperature and pH value on the mass经过DesignExpert软件分析，预测最佳酶解条件为时间9.0 4h、温度50.36，pH值为5.0。在这个条件下毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为0.2 2 2mg/mL,阿魏酸质量浓度为0.12 4mg/mL。在温度50、p H 值为5.0、时间9h、酶底比为45%的条件下进行酶解，验证预测结果有效性，共重复5次。经验证，在此条件下，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为0.217mg/mL,阿魏酸质量浓度为0.12 2 mg/mL,与模型预期结果相近。经纤维素酶酶解提取的畜禽归芪益母汤较传统提取方法的毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度提高48.6 3%，阿魏酸质量浓度提高69.52%。3结论与讨论畜禽归芪益母汤作为典型的传统中兽药，在兽医临床上应用较为广泛，可有效增强动物机体的免河南农业科学续表5以阿魏酸质量浓度为响应值回归模型方差分析Tab.5(Continued)Variance analysis of regression model with the content of ferulic acid as response value平方和P值Sum of squaresFreedegree1.4010-544.8310-4160.1300.1250.1200.1150.1100.1051.000.500.00-0.50温度-1.00TemperatureC(Tu/a)/鲁湿图5酶解时间、温度和pH值对阿魏酸质量浓度交互作用的响应面分析concentration of ferulic acid第52 卷自由度方差Variance3.5010-6B(Tu/)/喜0.50时间Time0.1300.1250.1200.1150.1100.1051.000.500.00-0.50pH-1.00疫力、提高抗氧化能力及改善肾功能等15。畜禽归芪益母汤中主要活性成分包括黄芪异黄酮类、黄芪皂苷类、阿魏酸及多糖类等有效物质16 。黄芪中黄酮类化合物主要包括毛蕊异黄酮、芒柄花素葡糖苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷等17 。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是中华人民共和国药典（2 0 2 0 版）中规定的黄芪测定指标之一，具有提高机体免疫力、抗癌等作用，中华人民共和国药典（2 0 2 0 版）中规定黄芪干燥品中含毛蕊异黄酮葡萄糖苷不得少于0.0 2 0%18 。当归的主要作用活性成分是阿魏酸，是中华人民共和国药典（2 0 2 0 版）中规定的当归测定指标之一，中华人民共和国药典（2 0 2 0 版）规定当归干燥品中含阿魏酸不得少于0.0 50%1。考虑到畜禽归芪益母汤中黄芪为君药，当归为臣药，本研究选用毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度作为测定指标，并且这2种有效物质使用紫外及二级阵列管检测器便可进F值Fvalue0.1300.1250.1200.1150.1100.1051.000.500.00-0.50-1.00pH0.000.50温度TemperaturePvalue1.000.00时间Time第7 期行检测，要求的质量浓度测定设备较为简单。本研究测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱方法是按照文献14 中的等度洗脱方法，而非中华人民共和国药典（2 0 2 0 版）中规定的梯度洗脱方法。本研究预试验时采用中华人民共和国药典（2 0 2 0 版）中规定的梯度洗脱方法对毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行测定，发现毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰与基线不能分离，可能是由于畜禽归芪益母汤中成分复杂，杂质峰较多造成的。随后采用文献14 中描述的等度洗脱方法，增大了流动相极性，并且延长了洗脱时间，使毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰与基线分离，并且周围无杂质峰干扰。生物学酶解提取中药是伴随着酶工程发展而兴起的一项提取技术。酶的作用具有极高的专一性，需要根据中药的种类选择酶的种类2 0 。吕凤娇等2 1 利用响应面法优化纤维素酶提取黄芪总皂苷的工艺，发现纤维素酶可有效酶解黄芪的细胞壁，提高黄芪总皂苷的提取率。王妮等2 2 利用单因素及正交试验优化黄芪超声-纤维素酶协同提取工艺，发现纤维素酶与超声协同可有效提取黄芪中的黄芪多酚。纤维素酶除了可有效酶解黄芪外，也可对当归进行酶解。刘炳福等2 3 的研究表明，纤维素酶可有效提高当归中阿魏酸的质量浓度，比传统水提工艺增加34.36%。本研究中，经过纤维素酶酶解后的畜禽归芪益母汤中有效物质质量浓度最高，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的质量浓度为0.2 17 mg/mL,经过换算质量浓度为0.2 7 1mg/g,高于侯秋苑等2 4 应用冷浸法提取理冲汤测定的0.2 0 0 mg/g，与田甜等2 5 在木丹颗粒中测定的0.2 8 6 mg/g相近。经过纤维素酶酶解后畜禽归芪益母汤产物中阿魏酸的质量浓度为0.122mg/mL,高于温海波等2 6 在复方生丹芩口服液中测定的0.0 43mg/mL，高于程伟等2 7 应用煎煮法提取益肾汤测定的0.0 45mg/mL。纤维素酶对黄芪的提取符合Fick第二定律，纤维素酶不会改变提取传质动力学，仅破坏细胞壁，降低扩散阻力，使有效物质的传质速率和有效扩散系数显著提高2 9。纤维素酶也可有效破坏当归的细胞壁，增加细胞壁的通透性，使扩散阻力减小，从而增加阿魏酸等有效成分的提取率2 3。酶解提取技术因具有提高中药有效物质的提取率、降低热敏物质的降解率、节省能源的使用及设备仪器较简单等优点，得到大力提倡2 9。本研究以毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度为指标，对传统中兽药组方畜禽归芪益母汤的纤维素酶酶解工艺进行了优化，最终掌握了最佳的刘雪松等：响应面优化畜禽归芪益母汤酶解提取工艺133纤维素酶提取工艺。纤维素酶提取条件：酶解时间9h，酶底比45%，温度50，pH值为5.0。在此条件下，酶解产物中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸质量浓度均较高。综上，本研究掌握了可有效提取畜禽归芪益母汤有效物质的纤维素酶提取工艺，为下一步的中试试验提供了依据。参考文献：1胡元亮.中兽医学M.北京：中国农业出版社，2 0 0 6：447-448.HU Y L.Traditional chinese veterinary medicine M.Beijing:China Agricultural Press,2006:447-448.2邹素华，徐坤玲，汪德刚，等.归芪益母汤作用机理及其在兽医临床上的应用J.中兽医医药杂志，2 0 17,36(2):76-78.ZOU S H,XU K L,WANG D Q,et al.Research progressof veterinary clinical applicatio