炎症性肠病患者血清miR-...与Th1_Th2平衡的关系_董瑞.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 19 期炎症性肠病患者血清miR-21、HMGB1水平与Th1/Th2平衡的关系董瑞，薛玲珑太原钢铁（集团）有限公司总医院消化内科，太原030008摘要：目的探讨炎症性肠病（IBD）患者血清微小RNA-21（miR-21）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）水平与辅助性T细胞（Th）1/Th2平衡的关系。方法选取109例IBD患者，根据疾病活动性分为活动期组56例和缓解期组53例，同期另选 50 名健康体检者为对照组。用实时荧光定量 PCR 法检测血清 miR-21；酶联免疫吸附法检测血清HMGB1、IL-2、干扰素（INF）-、IL-4、IL-10；流式细胞术检测外周血Th1、Th2比例，并计算Th1/Th2。Pearson、Spearman相关法分析各指标间的相关性。结果对照组、缓解期组、活动期组血清miR-21、IL-4、IL-10水平及外周血Th2比例依次降低（P均0.05），血清HMGB1、IL-2、IFN-水平及外周血Th1比例、Th1/Th2依次升高（P均0.05）。IBD患者血清miR-21与HMGB1水平呈负相关（P0.05）；血清miR-21水平与血清IL-2、IFN-水平及外周血Th1比例、Th1/Th2呈负相关（P均0.05），与血清IL-4、IL-10水平及外周血Th2比例呈正相关（P均0.05）；血清HMGB1水平与血清IL-2、IFN-水平及外周血Th1比例、Th1/Th2呈正相关（P均0.05），与血清IL-4、IL-10水平及外周血Th2比例呈负相关（P均4分、溃疡性结肠炎（UC）患者 Mayo 评分2分 组 56例、缓解期（CD患者简化 CDAI计算法4分、UC患者Mayo评分2分且无单项评分1分）组53例。活动期组男30例，女26例；年龄1867（48.45 7.57）岁；体质量指数18.9527.84（22.46 1.63）kg/m2；CD 25例、UC 31例。缓解期组男28例，女25例；年龄 1864（49.66 6.18）岁；体质量指数 19.3026.42（22.91 2.00）kg/m2；CD 24例、UC 29例。同期另选50名健康体检者为对照组，其中男26例，女24 例；年龄 2066（47.72 6.26）岁；体质量指数 临床研究 基金项目：山西省卫生健康科研课题（2019074）。通信作者：薛玲珑（E-mail：）开放科学（资源服务）标识码（OSID）46山东医药2023 年第 63 卷第 19 期18.0827.36（22.61 2.19）kg/m2。纳入标准：年龄18岁。排除标准：既往有胃肠道疾病史；妊娠期及哺乳期妇女；近2周内服用免疫制剂等药物。三组性别、年龄、体质量指数比较差异无统计学意义（P均0.05）。研究对象均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。1.2血清 miR-21、HMGB1和 Th1、Th2相关细胞因子水平检测采集IBD患者入院次日和对照组体检时空腹静脉血 4 mL，3 000 r/min 离心 15 min（半径8 cm），取上层血清分装于两管试剂管。一管血清使用TRIzol试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）提取总RNA，用TaKaRa反转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒（上海赫果生物科技有限公司）说明，采用实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行检测，反应条件：95 90 s；95 30 s、63 30 s、72 15 s循环40次。以U6为内参，2-CT法计算血清miR-21相对表达量。miR-21上游引物5-GGGGGTAGGATTGACAGGAT-3，下 游 引 物 5-CTCCAGGAGGGTATTCACCA-3；U6上游引物5-AATAGTGCCACGCAGTCTACA-3，下游引物 5-CAGATGGCCTGTCTAAGGCAA-3。取另一管血清，用酶联免疫吸附法检测HMGB1、IL-2、干扰素（INF-）、IL-4、IL-10。试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司。1.3外周血 Th1、Th2检测采集 IBD患者入院次日和对照组体检时空腹外周静脉血3 mL，经体积稀释、加入抗体、孵育后使用全自动流式细胞仪（美国BD 公司）检测外周血 Th1、Th2 比例，并计算 Th1/Th2。1.4统计学方法采用SPSS28.0统计软件。符合正态分布的计量资料以-x s表示，非正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，多组比较采用F或H检验，组间两两比较 LSD-t检验或 Z 检验；Pearson、Spearman相关法分析各指标间的相关性。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1三组血清miR-21、HMGB1水平及外周血Th1、Th2、Th1/Th2比较见表1。2.2三组 Th1、Th2 相关细胞因子水平比较见表2。2.3IBD 患者各指标的相关性经 TargetScan7.2数据库预测，miR-21 与 HMGB1 存在结合位点。Pearson 相关性分析显示，IBD 患者血清 miR-21 与HMGB1水平呈负相关（r=-0.705，P0.05）。Spearman 相关分析显示，IBD 患者血清 miR-21、HMGB1水平与外周血Th1、Th2、Th1/Th2及细胞因子水平的相关性见表3。3 讨论 IBD是临床常见的消化道疾病，近年来随着国人生活节奏、饮食习惯以及环境的改变，IBD的发病率呈上升趋势13。IBD的发病机制尚未完全明确，表1三组血清miR-21、HMGB1水平和外周血Th1、Th2、Th1/Th2比较组别活动期组缓解期组对照组Pn565350miR-21（-x s）1.20 0.43*#1.52 0.44*1.89 0.530.05HMGB1（ng/mL，-x s）14.01 6.67*#9.37 4.78*2.66 1.300.05Th1（%，-x s）2.49 0.62*#2.00 0.56*0.74 0.210.05Th2（%，-x s）1.02 0.36*#1.30 0.32*1.93 0.400.05Th1/Th2 M（P25，P75）2.38（1.96，3.64）*#1.62（1.05，1.99）*0.38（0.31，0.48）0.05注：与对照组比较，*P0.05；与缓解期组比较，#P0.05。表2三组血清IL-2、IFN-、IL-4、IL-10水平比较 ng/mL，M（P25，P75）组别活动期组缓解期组对照组Pn565350IL-236.74（33.22，40.98）*#27.79（24.98，31.66）*16.00（12.34，19.27）0.05IFN-87.93（59.28，105.70）*#56.97（39.61，66.13）*30.86（21.41，35.67）0.05IL-414.52（13.21，16.27）*#20.27（17.38，22.11）*24.71（22.45，26.99）0.05IL-1020.05（18.08，22.70）*#26.07（24.16，28.02）*32.67（31.52，33.65）0.05注：与对照组比较，*P0.05；与缓解期组比较，#P0.05。表3IBD患者血清miR-21、HMGB1水平与外周血Th1、Th2、Th1/Th2及细胞因子水平的相关性指标Th1Th2Th1/Th2IL-2IFN-IL-4IL-10miR-21r/rs-0.658*0.678*-0.696-0.661-0.6660.7100.689P0.050.050.050.050.050.050.05HMGB1r/rs0.683*-0.704*0.7310.6800.664-0.621-0.678P0.050.050.050.050.050.050.05注：*采用Pearson相关法。47山东医药2023 年第 63 卷第 19 期目前研究认为与肠道微生态、遗传、环境等多种因素相互作用导致的肠道免疫失衡有关，尚无治愈方法。尽管生物制剂在促进IBD黏膜愈合方面疗效较好，但常反复发作，严重影响患者生活质量，并给社会造成了负担14-15。近年研究发现，肠道免疫系统在IBD发生、发展中扮演重要角色，CD4T细胞浸润肠道组织是IBD患者的共同特征，可降低肠道细菌免疫耐受性，并引起肠道损伤和慢性肠道炎症。Th细胞是 CD4T细胞亚群中调控免疫炎症的关键细胞，当Th1/Th2失衡时则会引起IBD，可能是IBD发病的关键环节16。寻找IBD患者Th1/Th2平衡相关分子机制，对纠正Th1/Th2失衡和控制病情、改善生活质量等具有重要意义。Th1主要负责对抗细胞免疫反应，能通过分泌IL-2、IFN-等因子参与炎症反应；Th2主要负责对抗体液免疫反应，能通过分泌IL-4、IL-10等因子抑制炎症反应。正常状态下Th1与Th2相互抑制处于平衡状态，当Th1/Th2失衡则会导致CD4T细胞过度活化并促进 IBD 肠道炎症进展16。本研究结果显示，对照组、缓解期组、活动期组外周血 Th1比例、Th1/Th2依次升高，Th2比例依次降低。说明IBD患者Th1/Th2明显失衡，并随着疾病活动性增加而加重。同时结果显示，对照组、缓解期组、活动期组血清IL-2、IFN-水平依次升高，IL-4、IL-10水平依次降低，符合Th1/Th2失衡变化。研究发现，IBD存在非编码RNA、组蛋白修饰、DNA甲基化等表观遗传改变，其中miRNA作为表观遗传学调控分子能通过调控免疫功能参与IBD发生发展17。miR-21是首个在肿瘤患者血液中检测到的miRNA，最初发现其能作为癌基因参与多种恶性肿瘤进展。近年研究发现，miR-21还参与免疫细胞的分化、增殖、凋亡等调控7。激活 miR-21能促进CD4T细胞存活，抑制miR-21表达将导致CD4T细胞凋亡18。有研究将miR-21转染至初始CD4T细胞，发 现 miR-21 能 调 节 CD4T 细 胞 体 外 分 化，miR-21表达下调可导致CD4T细胞发育和功能缺陷。上述研究提示，miR-21对维持CD4T细胞功能至关重要19。同时实验发现，miR-21 缺乏可导致CD4T细胞向Th1表型转化，上调miR-21表达能促进CD4T细胞向Th2表型转化20-21。提示miR-21还参与调控 Th细胞的分化。本研究结果显示，对照组、缓解期组、活动期组血清miR-21水平依次降低，提示血清miR-21水平降低参与IBD发生、发展。结果还显示，IBD患者血清miR-21水平与外周血Th1、Th1/Th2和血清 IL-2、IFN-水平呈负相关，与外周血Th2和血清IL-4、IL-10水平呈正相关。这说明血清 miR-21低表达可能通过调节 Th1/Th2失衡介导的炎症反应参与IBD发生、发展，分析其机制可能是miR-21低表达可导致CD4T细胞功能缺陷，促进其向Th1表型转化，抑制Th2表型转化，导致Th1/Th2失衡20-21。HMGB1是一种核蛋白，存在于真核细胞核中，当免疫细胞受到内源性炎症调节因子刺激时和细胞坏死、凋亡时被释放到胞外，胞外 HMGB1 可结合Toll样受体和晚期糖基化终产物受体（RAGE）等受体活化细胞和调控炎症应答，放大炎症反应10。实验发现，HMGB1 在 IBD 大鼠结肠中高表达，抑制HMGB1能减轻IBD大鼠肠道炎症反应22。这提示HMGB1与IBD炎症密切相关。近年研究还发现，胞外 HMGB1 还可以作为免疫激活信号介导初始CD4T细胞细胞分化23。在烫伤延长复苏大鼠模型中，血清HMGB1升高与初始CD4T细胞向Th2分化有关24。高剂量HMGB1刺激可抑制CD4T细胞增殖能力，导致其向Th2分化25。本研究结果显示，对照组、缓解期组、活动期组血清HMGB1水平依次升高，提示血清HMGB1水平升高参与IBD发生发展。进一步分析显示，血清HMGB1水平与外周血Th1、Th1/Th2和血清 IL-2、IFN-水平呈正相关，与外周血Th2和血清IL-4、IL-10水平呈负相关。这说明血清HMGB1水平升高可能通过调节Th1/Th2失衡介导的炎症反应参与IBD发生、发展，分析其机制可能与HMGB1能调节GATA结合蛋白3（GATA3）有关。GATA3是Th2细胞分化的特异性转录因子，能诱导初始CD4T细胞向Th2功能性分化。汤鲁明等26实验显示，HMGB1能结合RAGE活化GATA3途径，促使CD4T细胞向 Th2分化，导致Th1/Th2失衡。笔者通过网站预测发现，miR-21与HMGB1的3-非翻译区处存在结合位点，相关性分析发现IBD患者血清miR-21与HMGB1水平呈负相关，提示二者可能共同参与 IBD 发生、发展。近年研究亦发现，上调miR-497表达能靶向下调Sirt4表达，抑制血管紧张素诱导心肌肥大25。在碱烧伤小鼠模型中，miR-21能通过HMGB1途径介导炎症细胞浸润27。综上所述，IBD 患者血清 miR-21 水平降低、HMGB1水平升高，二者可能共同通过Th1/Th2平衡介导的炎症反应参与IBD发生发展，但本研究结果还需进一步实验证实。参考文献：1中国医药教育协会炎症性肠病专业委员会.中国炎症性肠病消化内镜诊疗共识 J.中华消化病与影像杂志，2021，11（1）：48山东医药2023 年第 63 卷第 19 期1-7.2黄钊鹏，晁康，林敏芝，等.肠内营养在炎症性肠病治疗中的应用现状 J.中华消化杂志，2022，42（4）：281-284.3万健，张玉洁，王卓，等.炎症性肠病消化道肿瘤的发生风险与监测 J.中华炎性肠病杂志，2022，6（4）：287-292.4SAEZ A，GOMEZ-BRIS R，HERRERO-FERNANDEZ B，et al.Innate lymphoid cells in intestinal homeostasis and inflammatory bowel disease J.Int J Mol Sci，2021，22（14）：7618.5徐振江，徐洪雨.T淋巴细胞亚群在炎症性肠病中作用的研究J.胃肠病学和肝病学杂志，2021，30（4）：454-458.6朱鹏，覃刚，吴莉莉.炎症性肠病中微小RNA的功能及临床研究进展 J.河北医药，2022，44（4）：603-607，613.7刘芮伶，刘超予，阮庆国.miR-21调控调节性T细胞发育和功能的研究进展 J.国际免疫学杂志，2018，41（6）：665-669.8ABDALLAH F，HENRIET E，SUET A，et al.miR-21-3p/IL-22 axes are major drivers of psoriasis pathogenesis by modulating keratinocytes proliferation-survival balance and inflammatory response J.Cells，2021，10（10）：2547.9ZHANG S，SUN P，XIAO X，et al.MicroRNA-21 promotes epithelial-mesenchymal transition and migration of human bronchial epithelial cells by targeting 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