实验一 玻碳修饰电极分离检测水样中对苯二酚和邻苯二酚.doc

实验一 玻碳修饰电极分离检测水样中对苯二酚和邻苯二酚
（8学时）

一 、实验目的
1. 了解电聚合膜及修饰电极的制备方法。
2. 掌握CHI660D电化学工作站的使用方法。
3. 掌握修饰电极同时分离检测电活性物质的原理。
二、 实验原理
对苯二酚(Hydroquinone，HQ)和邻苯二酚(Catechol，CC)是重要的酚类化合物，同时也是应用广泛的化工原料。然而HQ和CC毒性较大，是一类有机污染物，对人体和环境危害较大。由于HQ和CC互为同分异构体，二者的物理性质和化学性质十分相似，故要快速、简便、灵敏地检测并区分二者有一定的难度。实验通过电聚合L-白氨酸（L-LEU）修饰玻碳电极分离检测HQ和CC。由于邻苯二酚、对苯二酚结构中含有羟基电化学活性官能团，可发生电化学反应。在一定条件下，邻苯二酚、对苯二酚的响应电流（I）与溶液浓度（C）成正比，即：I=KC。
采用差分脉冲伏安法对水样中的邻苯二酚、对苯二酚进行定量测定。差分脉冲伏安法是目前溶出法中灵敏度最高的一种电化学扫描方式。它是在缓慢线性扫描的电压（5-10 mV/s）上迭加一个振幅为50-100 mV的周期性脉冲，并在刚好加脉冲之前和脉冲的后期分别测量电流，将这两次电流的差值由电子线路放大输出。由于电容电流的衰减速率较法拉第电解电流快得多，在测量电解电流的时刻，电容电流已衰减趋近于零，所以灵敏度较高。通过这一方法可以实现邻苯二酚、对苯二酚的高灵敏检测。
三 、实验仪器与试剂
仪器：CHI660D电化学工作站、三电极工作体系：银-氯化银为参比电极，铂丝为对电极，工作电极为玻碳电极（GCE，d=3mm）。
试剂：对苯二酚、邻苯二酚、PP（磷酸）缓冲液（pH=4.5，7.0）、5.0 mmol/L L-白氨酸溶液。
四、 实验内容
1、电极处理:
玻碳电极先用少量0.05µm的 α-Al2O3 抛光至镜面，然后用二次水清洗待用，同时检查电极表面的清洁度，避免有杂质。
2、修饰电极的制备
将电极放入含有5.0 mmol/L L-LEU的0.2 mol/L PP (pH=7.0)的聚合底液中，采用在扫描速度为100 mV/s, 电位范围为0--2V时，循环扫描聚合5圈，即得到poly-L-LEU/GCE。
3、HQ和CC在修饰电极上的电化学行为
将GCE和poly-L-LEU/GCE分别放入含有1×10-4 mol/L的混合有HQ和CC的溶液中，采用CV法，在扫描速度为100 mV/s, 电位范围为-0.4～0.8 V时，循环扫描1圈，并进行表征。
4、HQ和CC电化学响应标准曲线的绘制：
（1） 电解液的配制：配制0.2 mol/L PP缓冲液 (pH=4.5) 100mL。
（2） HQ和CC标准溶液的配制：分别配制0.01mol/L的HQ和CC高浓度储备液，用电解液稀释成不同浓度的HQ和CC标准溶液，浓度依次为：1×10-5 mol/L、2.5×10-5 mol/L、5×10-5 mol/L、7.5×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L。
（3） 用差分脉冲电化学方法进行测定，以系列标准液的浓度为横坐标，以相应的电流强度为纵坐标绘制标准曲线。
5、精密度和回收率实验
取HQ和CC标准品配置成5×10-5 mol/L的混合液，用差分脉冲法扫描五次，记录其电流值，并求其精密度。采用用标准加入法测定二者的回收率。
6、实际水样中HQ和CC含量的测定及回收率试验
取2.5mL的实际水样，在小烧杯中用PP (pH=4.5.0)缓冲溶液稀释至5mL。在上述相同条件下，测定其电流值，在标准曲线上找出相应电流强度的浓度Cx。采用用标准加入法测定二者的回收率(各加100ul)。
五、结果与分析
1、标准曲线的绘制
表1 HQ和CC标准曲线绘制
编号
1
2
3
4
5
CHQ（µmol/L）

I（µA）

CCC（µmol/L）

I（µA）

以系列标准液的浓度为横坐标，以相应的电流相对强度I值为纵坐标绘制标准曲线。

2、 精密度
表2 精密度试验
编号
1
2
3
4
5
平均值
RSD (%)
I（µA，HQ）

I（µA，CC）

（精密度：RSD = S / ×100% ， ）

3、 回收率

表3 回收率试验
样品
含量
加入量 (μmol/L)
测得值(μmol/L)
回收率(%)
HQ

CC

实验二 槐花中芦丁与槲皮素的提取分离以及色谱鉴定
（10学时）

一、实验目的
(1) 掌握黄酮苷水解生成苷元的方法及二者之间的分离;
(2) 熟悉高效液相色谱仪的基本操作;
(3) 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过HPLC分离测定来对目标化合物的分析鉴定。
二、实验原理
槐花中的主要有效成分是芦丁和槲皮素等黄酮类物质。芦丁具有广泛的药理活性，能维持及恢复毛细管的正常弹性，增强其抵抗力，防止血细胞凝聚，临床用于防治溢血、高血压等心脑血管疾病；槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒等多方面的药理作用,对糖尿病的肾脏、胃肠粘膜、器官缺血损伤具有保护作用，同时还有抗忧郁、抗心胸肥大、降压等作用。由此可见，来自同一药物中的不同成分有着不同的药理活性。
高效液相色谱法(HPLC)是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。 在已知的有机化合物中，约有80%能用高效液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。
实验采用回流方法提取槐花中的芦丁和槲皮素，并利用HPLC法测定其含量。
三、实验仪器与试剂
1.仪器：Agilent 1100高效液相色谱（紫外检测器）用于芸香苷、槲皮素的检测。Extend-18C柱（5um,4.6*250 nm）用于分离芸香苷和槲皮素。1mL、50μL的移液枪及配套枪头、KQ5200型的超声波清洗器，SHB-Ⅲ循环水多真空泵，SK-1快速混匀器，0.45µm有机相针头式滤器、一次性注射器 、研钵一套、10ml容量瓶
2.试剂：芸香苷和槲皮素标准品、槐米、甲醇为高效液相色谱纯、0.4%磷酸、饱和石灰水
3.其他：纱布、pH试纸、250mL烧杯3个。
四、实验内容
(一)色谱条件
色谱柱：Extend-18C柱（250 ×4. 6mm，5 μm）；流动相，甲醇-0.4%磷酸（70：30，v/ v）；检测波长，254 nm；流速，1.1ml/mim；柱温，30℃。
(二)供试品溶液配制
精密称取净制后的槐花5 g，置于圆底烧瓶中，加入 20 倍量水浸泡1 h，加热回流 2 h，放冷，加水补足差失的量，过滤，分别吸取续滤液 2 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中定容，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
(三)芸香苷和槲皮素的HPLC检测：
1.对照品溶液配制：
精密称取 50 mg 芦丁对照品及 2.5 mg 槲皮素对照品，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容至 10 mL，摇匀，过 0.45 µm微孔滤膜，即得芦丁浓度为 5.0 mg/mL、槲皮素浓度为0.25 mg/mL的混合对照品溶液。
2.芸香苷、槲皮素不同混合浓度HPLC的测定
取芸香苷和槲皮素混合液：500μL、200μL、80μL、10μL、5μL用甲醇定容成1mL，用5μL的进样器进样，按上述色谱条件进样，测定，平行三次，记录峰面积，求平均值。以对照品进行浓度量X(ppm)为横坐标,峰面积值Y(A)为纵坐标,绘制标准曲线，计算回归方程。
3.精密度试验
取对照品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，测定芦丁和槲皮素的峰面积，并求其精密度。
4.样品测定及回收率试验
取供试品溶液在最佳的色谱条件进行实际样品中芸香苷和槲皮素含量的测定，重复三次，测的实际样品中芸香苷的平均浓度和槲皮素的平均浓度。采用用标准加入法测定二者的回收率。
五、注意事项(强调)
.建立高效液相色谱法检测槐米中槲皮素和芸香苷的含量，对所建立的方法进行考察非常关键，这影响到检测结果的准确性、可靠性。
六、结果与分析
(1)含量测定
表1 芸香苷和槲皮素标准曲线
编号
1#
2#
3#
4#
5#
芸香苷溶液浓度/μg /mL

槲皮素溶液浓度/μg /mL

芸香苷峰面积

槲皮素峰面积

(2) 精密度
表2 精密度试验
编号
1
2
3
4
5
平均值
RSD (%)
芸香苷峰面积

槲皮素峰面积

（精密度：RSD = S / ×100% ）

4、 回收率
表3 回收率试验
样品
含量
加入量 (μmol/L)
测得值(μmol/L)
回收率(%)
芸香苷

槲皮素

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