阴离子通道CFTR与细胞自噬的关系研究进展_刘晗.pdf

*基金项目:广西自然科学基金项目(2020GXNSFDA297028)通信作者:何永华。E mail:hyhup shmu edu cn阴离子通道 CFT 与细胞自噬的关系研究进展*刘晗1，刘良肇1，莫林烽2，王娜1，何永华11桂林医学院公共卫生学院(广西桂林 541001);2广州华商职业学院健康医学院(广东广州 511300)【摘要】阴离子通道蛋白囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFT)分布广泛，可协调蛋白网络的稳态。自噬可经复杂的分子信号网络调节细胞的基本生物学功能。目前，CFT 与细胞自噬的关系尚未明确，故本文综述了 CFT 与细胞自噬的关联，为探究相关的细胞生物学机制提供新思路。【关键词】CFT;细胞自噬;研究进展【中图分类号】1;Q255【文献标志码】ADOI:10 13820/j cnki gdyx 20221625囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFT)1 2 属于膜转运蛋白 ATP 结合盒(ATP binding cassette，ABC)家族，是环磷酸腺苷(cyclic adenosine mono-phosphate，cAMP)调节的阴离子通道，介导氯离子/碳酸氢盐通过上皮的转运。CFT 不仅做为一个阴离子通道，而且它可协调蛋白网络的稳态。CFT是在相互作用蛋白的特定动态系统中运行的，该系统与蛋白质稳态网络连接并受其影响3。CFT 抑制或过表达则会导致细胞蛋白稳态的严重紊乱。细胞自噬(autophagy，型程序性细胞死亡)作为蛋白质稳态网络的主要参与者，调节细胞对胞质蛋白甚至整个细胞器进行降解和再利用。细胞自噬机制之一是通过调节能量代谢及物质代谢来维持细胞稳态4。因此，研究 CFT 与细胞自噬的作用及其相关性，可为 CFT 及自噬相关疾病的治疗提供特异性作用靶点，为开发新的药物提供新思路。本文综述 CFT 与自噬的相关进展，已通过桂林医学院附属医院医学伦理委员会伦理审核(批文号:QTLL202129)。1CFT 概述1 1CFT 的结构囊性纤维化跨膜转导调节因子的编码基因及其等位基因定位于 7 号染色体长臂(7q 31 2)，由 27 个编码外显子组成，约 230 kb，是生产和运输完整和功能性 CFT 蛋白所必需的。CFT 蛋白分布广泛，在所有与吸收和分泌相关的上皮细胞顶膜、线粒体等多种细胞器均有表达，如气管、肝、胰腺、小肠、生殖腺等的细胞膜中5。ATP 结合盒转运蛋白家族6 包括 CFT 在内均由以下几个功能结构域组成:MSD1 和 MSD2 两个跨膜结构域(membrane spanning domains，MSD)可形成选择性氯离子通道;NBD1 和 NBD2 两个胞质核苷酸结合域(nucleotide binding domains，NBD)具有调节门控氯离子通道的功能。CFT 除上述典型结构之外还包含一个独有的调节结构域(域)，该域磷酸化可控制氯离子通道的活性。1 2CFT 的功能ABC 家族涵盖 CFT 在内总计48 个成员，在人类中又分为7 个亚家族(ABCA ABCG)。大多数 ABC 蛋白作为依赖于 ATP 的活性转运蛋白进行单向转运7 8。CFT 是细胞内第二信使 cAMP 依赖的 ATP 门控阴离子通道蛋白，没有主动转运的功能，其最重要的功能是介导 Cl的跨膜转运，进而在细胞内外形成电化学浓度梯度，促进H2O 和其他离子的转运。膜片钳技术9 是目前分析 CFT 阴离子通道分子行为的金标准。CFT 在气道、生殖道等多种上皮组织中均起着十分重要的作用，而缺乏 CFT 的上皮细胞10 会增加分泌物黏度，最终积累并阻塞胃肠道、胆道和生殖道等，产生各种临床表现。例如，CFT 基因突变引起氯离子通道功能异常，从而影响氯离子和水在男性生殖器细胞中的正常交换。在这种情况下导致生殖器细胞内出现异常黏稠分泌物，直接破坏精子形成，阻塞输精管11 12。因此，这样的患者宜通过辅助治疗解决生育问题。1 3CFT 与线粒体的关系CFT 可调节细胞内外多种阴离子及部分阳离子平衡，其与相关激酶共同作用，对维持细胞正常生理功能具有重要意义。CFT 功能障碍可能影响线粒体的许多参数，如氧化应激水平、线粒体膜电位(mitochondrial membranepotential，MMP)和 ATP 生 成 等13。CFT 转 运Cl、HCO3和其他离子，调节细胞内液的 pH 值，然后影响对 pH 值敏感的钙离子通道 CatSper14 15。线粒体膜电位的异常可促使线粒体产生过量活性氧162广东医学2023 年 2 月 第 44 卷第 2 期Guangdong Medical JournalFeb 2023，Vol 44，No 2(reactive oxygen species，OS)，诱导自由基链锁反应，又进一步损伤线粒体结构和功能，ATP 合成减少。Favia 等 16 发现，经小分子 VX 809 和4，6，4 三甲基当归素(4，6，4 trimethylangelicin，TMA)处理后的 CF 细胞作为 F508del CFT 的“校正剂”，通过增加细胞表面的功能性 CFT 和拯救 F508del CFT 依赖的氯离子分泌，显著改善所有线粒体参数，使其达到表达野生型 CFT 的细胞中的值。这表明，“校正剂”对 CF 细胞恢复线粒体功能和恢复氯离子通道活性有关。1 4CFT 调节剂CFT 氯离子通道的功能缺陷能够诱发多种疾病，例如囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)、特发性慢性胰腺炎(idiopathic chronic pancre-atiti，ICP)、干眼病(keratocon junctivitis sicca，KCS)、多囊肾病(polycystic kidney disease，PKD)、分泌性腹泻(secretory diarrhea，SD)等疾病。现有数据表明，CFT 突变已经超过 1 600 种，其中有 1 300 多种突变能够导致 CF。因此，CFT 作为治疗相关疾病的药物靶标受到了越来越多人的重视。14 1CFT 激活剂目前已发现的 CFT 激活剂主要有三羟基黄酮(genistein)、异鼠李素(isorham-netin)、毛喉素(forskolin，FSK)等。三羟基黄酮激活氯离子通道的方法有两种:一是通过提高细胞内cAMP 水平;二是通过改变 CFT 蛋白构象17。异鼠李素作为天然产物黄酮醇苷类化合物之一，可以显著增加 CFT 氯离子通道活性且呈剂量依赖性，如测量细胞顶膜电流以验证异鼠李素对表达 WT CFT 的 FT 细胞中 CFT 氯离子通道活性的影响，结果显示在 30 mol/L 时异鼠李素可充分激活CFT18。1 4 2CFT 抑制剂目前对于 CFTinh 172、异甘草素(ISLQ)、羟基酮等 CFT 抑制剂的研究相对较多。噻唑烷酮类化合物 CFTinh 172 作为研究CFT 功能的金标准，其特 点 是 通 过 靶 向 结 合NBD119，抑制氯离子的外流，能够有效抑制 CFT氯离子通道的活性。ISLQ20 作为植物衍生的查尔酮类化合物中的一员，不仅能够抑制 CFT 的氯离子通道活性，而且可使细胞活力和其细胞内 cAMP水平无法得到提高，因此被作为治疗 CFT 突变导致的相关疾病的主要药物。2自噬2 1自噬概述细胞自噬是一种十分重要的生物学现象，是一个将细胞内受损、变性、衰老的蛋白质或细胞器清除的过程。自噬机制的构成部分与多种信号通路以动态的形式相互作用，以增强细胞对细胞自主或环境应激信号的适应性21 22。自噬的发生23 始于细胞质成分和细胞器被自噬小体的双膜囊泡包围而形成的双膜结构，随后自噬小体捕获需降解的某些物质将其运输到溶酶体并在溶酶体内降解以完成自噬。LC3 作为自噬的分子标志物在哺乳动物中被 ATG7 和 ATG3 所修饰加工，产生 LC3，并将活化的 LC3 转移到 ATG3 上，最后与含脂质的膜结合。含有 LC3 脂质的膜可作为支架，构建吞噬细胞的早期自噬元件，该元件可生长成封闭的自噬体。自噬体外膜与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体，这意味着溶酶体内被包裹的物质被降解并输出到细胞质中而后进行自我修复，如此循环利用以实现细胞更新24。2 2自噬调节剂2 2 1自噬诱导剂目前已经发现了许多自噬诱导因子，但它们的诱导机制仍然不太清楚，可能是因为自噬信号通路之间高度多样化和复杂的相互作用。例如，AZD 8055(ATP 竞争性 mTO 抑制剂)可以在多种癌细胞株中诱导自噬并抑制增殖25;SMK 17 以时间依赖性方式诱导 MAP1LC3B /LC3 (微管关联蛋白 1 轻链 3)的产生，其是自噬体形成的指标26。在存在溶酶体抑制剂巴弗洛霉素 A1(Bafilomycin A1)的情况下，SMK 17 对LC3 的转化进一步增加，表明 SMK 17 激活了自噬通量。2 2 2自噬抑制剂常用的抑制药物如下:巴弗洛霉素 A1 和羟氯喹等药物可以通过抑制自噬溶酶体的形成来精细调节自噬通量。氯喹(CQ)及其衍生物羟氯喹(HCQ)27 作为经典的自噬抑制剂，通过增加 p62 的表达，抑制自噬。DCZ5248 是一种新型的自噬抑制剂，其原理跟氯喹相似;实验结果显示DCZ5248(0.3 mol/L)在结肠癌细胞中可诱导细胞株胞浆空泡形成，LC3 转化，p62 蛋白上调，并抑制晚期自噬28。3CFT 与自噬的关联线粒体膜电位异常可由 CFT 功能障碍所致，进而损伤线粒体结构，导致 ATP 合成减少以及 OS生成增加。OS 阻挡细胞的能量代谢链，诱导谷氨酰胺转移酶 2(TGM2)的翻译后修饰，TGM2 作为多功能酶可催化靶蛋白的几种翻译后修饰，而后活化的 TGM2 靶向自噬体形成必需的自噬蛋白 Beclin1(BECN1)等多种底物29 30。Beclin1 与 TGM2 交联后的复合物被隔离在细胞质基质中以形成凝聚体。值得一提的是，CFT、TGM2 和自噬参与了一个前馈环路。这意味着 CFT 功能障碍激活了 TGM2，使自噬失活，而抑制 TGM2 和恢复自噬在细胞表面重新建立了 CFT 功能。CFT、TGM2 和自噬之间的262广东医学2023 年 2 月 第 44 卷第 2 期Guangdong Medical JournalFeb 2023，Vol 44，No 2这种密切联系可以被认为是监测细胞内稳态的共同平台。从这个角度来看，CFT 可以被视为应激的主要传感器，当应激事件有干扰细胞生理的风险时，它会提醒自噬机制。因此，可以通过刺激 CFT 功能、抑制 TGM2 和刺激自噬来治疗囊性纤维化患者。cAMP 作为真核细胞生物中重要的第二信使，通过下游分子对细胞的各项生理活动起双向调节作用。CFT 与蛋白激酶 A(PKA)、AMP 依赖的蛋白激酶 AMPK(AMPK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)均为 cAMP 的下游效应物，CFT 与 cAMP 的其他下游效应物也可互相作用。PKA 通过与 CFT 调节域的结合并使其磷酸化以增强其活性，而 AMPK 则与CFT 的核内结合域结合，降低其活性31，这与PKA 对 CFT 的影响正好相反。抑制 CFT 则降低细胞 PKA 活性32、提高 AMPK 活性33。PKA 和AMPK 也与细胞自噬互相反馈和调节34。此外，第二信使钙离子 Ca2+是细胞生存与死亡过程中最重要的调节因子之一。当其与 CFT 协同作用时，细胞内流离子 Ca2+浓度升高，自噬的特异性基因 Bec-lin 1 活性增强，自噬相关蛋白 ATG2A 表达水平升高，可诱导自噬发生35。有研究显示36，对携带类 CFT 突变的患者使用表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，自噬抑制乙酰转移酶的抑制剂 EP300)进行治疗可以延长半胱胺对自噬诱导的有益作用，并恢复 CFT 功能上皮细胞。NBD1 结构域第 508 位苯丙氨酸残基(F508del)的缺失是囊性纤维化中最常见的类突变，导致 F508del CFT 折叠缺陷。而涉及 F508delCFT 的小鼠在经过上述联合治疗(半胱胺加 EGCG)后 37，在 Becn1 单倍体功能不全(Becn1+/)的情况下失去了恢复 CFT 功能的能力。因此，自噬是维持细胞表面功能性 CFT 所必需的过程。Liu等3 用 GFP CFT F508del 转染自噬缺陷 IB3 1细胞 24h，Western blotting 结果显示，经 p62 敲低处理后的 CFTF508del 与 GFP CFT F508del 单独转染的细胞相比蛋白含量更高;共聚焦显微镜结果显示，与仅用 GFP CFTF508del 转染的 IB3 1 细胞相比，用胱胺处理以及 p62 敲低处理后质膜上的GFP CFT F508del 增加。以上结果表明通过 Bec-lin 1 过表达、胱胺或抗氧化剂来拯救细胞免于自噬，可改善 CFT 转运，减少 OS 形成和炎症。该研究结果同上述观点一样证实了自噬对于 CFT 的重要性。线粒体自噬(mitophagy)38 是一种特异性靶向受损线粒体的自噬反应，可以说是最具特征性的选择性自噬类型，可作为调控线粒体质量的一种机制，因此线粒体自噬可能具有细胞毒性。清除受损线粒体的关键是线粒体自噬，线粒体在线粒体毒性条件下受到损害，毒性条件包括缺氧和胞质 Ca2+超载。CFT 在线粒体处有表达，但其与线粒体自噬的关系目前尚无相关文献报道，仍需要广大学者对其进行深入探究。4小结迄今为止，CFT 基因突变已高达 2 000 余种，其临床表现多样化。CFT 不仅是 ABC 大家族中唯一具有通道功能的成员，而且其在癌症进程相关的多个信号通路中也起到了重要的调节作用，它的突变会增加患癌风险并严重威胁人民生命健康。因此，CFT 是许多组织单位持续探索的重要课题，越来越多的研究者投入到对 CFT 的结构、功能、信号通路、小分子调节剂等的研究中。但是，目前对于CFT 与细胞自噬的研究鲜有报道，CFT 在细胞自噬中的作用及机制仍未明。我国有学者发现，在精子活力低下的患者中，低 CFT 表达水平是精子前向运动的有害因素39。由此可推测深入对 CFT与精子细胞自噬的关系研究或许可为提高精子活力提供新思路。期待更多具有说服力的临床试验数据对 CFT 相关疾病的预防与治疗以及提出新的药物靶点等研究提供可靠的理论和实践的支撑。利益相关声明:本文作者和单位未曾接受第三方资金或服务支持，无相关利益冲突。作者贡献说明:本文由刘晗进行文献检索及撰写成文;刘良肇、莫林烽、王娜进行资料收集整理;何永华指导论文修改。参考文献 1Carlile GW，Yang Q，Matthes E，et al The NSAID glafenine res-cues class 2 CFT mutants via cyclooxygenase 2 inhibition of thearachidonic acid pathway J Sci ep，2022，12(1):4595 2Lopes Pacheco M，Pedemonte N，Veit G Discovery of CFTmodulators for the treatment of cystic fibrosisJ Expert OpinDrug Discov，2021，16(8):897 913 3Liu X，Li Y，Wang X，et al The BEACH containing proteinWD81 coordinates p62 and LC3C to promote aggrephagyJ JCell Biol，2017，216(5):1301 1320 4Pan HY，Valapala M egulation of Autophagy by the GlycogenSynthase Kinase 3(GSK 3)Signaling PathwayJ Int J MolSci，2022，23(3):1709 5Chaudary N Triplet CFT modulators:future prospects for treat-ment of cystic fibrosisJ Ther Clin isk Manag，2018，14:2375 2383 6Liu F，Zhang Z，Csandy L，et al Molecular Structure of the Hu-man CFT Ion ChannelJ Cell，2017，169(1):85 95 7Prie M，Gddeke H，Groenhof G，et al Molecular Mechanism ofATP Hydrolysis in an ABC TransporterJ ACS Cent Sci，2018，4(10):1334 1343 8Mchtel，Narducci A，Griffith DA，et al An integrated trans-362广东医学2023 年 2 月 第 44 卷第 2 期Guangdong Medical JournalFeb 2023，Vol 44，No 2port mechanism of the maltose ABC importerJ es Microbiol，2019，170(8):321 337 9Billet A，Froux L，Hanrahan JW，et al Development of Automa-ted Patch Clamp Technique to Investigate CFT Chloride ChannelFunctionJ Front Pharmacol，2017，8:195 10 asmussen LW，Stanford D，Patel K，et al Evaluation of second-hand smoke effects on CFT function in vivoJ espir es，2020，21(1):70 11 Orta G，de la Vega Beltran JL，Martn Hidalgo D，et alCatSper channels are regulated by protein kinase AJ J BiolChem，2018，293(43):16830 16841 12 Sudhakar DVS，Shah，Gajbhiye K Genetics of Male Infertility Present and Future:A Narrative eviewJ J Hum eprod Sci，2021，14(3):217 227 13 Lukasiak A，Zajac M The Distribution and ole of the CFT Pro-tein in the Intracellular CompartmentsJ Membranes(Basel)，2021，11(11):804 14 Brukman NG，Nuez SY，Puga Molina LDC，et al Tyrosinephosphorylation signaling regulates Ca2+entry by affecting intracel-lular pH during human sperm capacitationJ J Cell Physiol，2019，234(4):5276 5288 15 Bozoky Z，Ahmadi S，Milman T，et al Synergy of cAMP and cal-cium signaling pathways in CFT regulationJ Proc Natl AcadSci U S A，2017，114(11):E2086 E2095 16 Favia M，Mancini MT，Bezzerri V，et al Trimethylangelicin pro-motes the functional rescue of mutant F508del CFT protein incystic fibrosis airway cells J Am J Physiol Lung Cell Mol Physi-ol，2014，307(1):L48 L61 17 Conger BT，Zhang S，Skinner D，et al Comparison of cystic fi-brosis transmembrane conductance regulator(CFT)and ciliarybeat frequency activation by the CFT Modulators Genistein，VT 532，and UCCF 152 in primary sinonasal epithelial cultures J JAMA Otolaryngol Head Neck Surg，2013，139(8):822 827 18 Lee HK，Park J，Kim B，et al Isorhamnetin Ameliorates DryEye Disease via CFT Activation in MiceJ Int J Mol Sci，2021，22(8):3954 19 Edlund A，Esguerra JL，Wendt A，et al CFT and Anoctamin 1(ANO1)contribute to cAMP amplified exocytosis and insulin se-cretion in human and murine pancreatic beta cellsJ BMCMed，2014，12:87 20 Muanprasat C，Sirianant L，Soodvilai S，et al Novel action of thechalcone isoliquiritigenin as a cystic fibrosis transmembrane con-ductance regulator(CFT)inhibitor:potential therapy for choleraand polycystic kidney diseaseJ J Pharmacol Sci，2012，118(1):82 91 21 de la Cruz Ojeda P，Flores Campos，Navarro Villarn E，et al The ole of Non Coding NAs in Autophagy During Carci-nogenesis J Front Cell Dev Biol，2022，10:799392 22 Levine B，Kroemer G Biological Functions of Autophagy Genes:A Disease Perspective J Cell，2019，176(1/2):11 42 23 Bagherniya M，Butler AE，Barreto GE，et al The effect of fastingor calorie restriction on autophagy induction:A review of the liter-atureJ Ageing es ev，2018，47:183 197 24 Behera J，Ison J，Tyagi A，et al Mechanisms of autophagy andmitophagy in skeletal development，diseases and therapeutics J Life Sci，2022，301:120595 25 Chresta CM，Davies B，Hickson I，et al AZD8055 is a potent，selective，and orally bioavailable ATP competitive mammaliantarget of rapamycin kinase inhibitor with in vitro and in vivo antitu-mor activityJ Cancer es，2010，70(1):288 298 26 Klionsky DJ，Abdel Aziz AK，Abdelfatah S，et al Guidelinesfor the use and interpretation of assays for monitoring autophagy(4th edition)1 J Autophagy，2021，17(1):1 382 27 Li F，Chen T，Wang F，et al Enhanced Cancer Starvation Thera-py Enabled by an Autophagy Inhibitors Encapsulated BiomimeticZIF 8 Nanodrug:Disrupting and Harnessing Dual Pro SurvivalAutophagic esponsesJ ACS Appl Mater Interfaces，2022，14(19):21860 21871 28 Chen XL，Liu P，Zhu WL，et al DCZ5248，a novel dual inhibi-tor of Hsp90 and autophagy，exerts antitumor activity against coloncancer J Acta Pharmacol Sin，2021，42(1):132 141 29 Villella V，Esposito S，Bruscia EM，et al Targeting the Intra-cellular Environment in Cystic Fibrosis:estoring Autophagy as aNovel Strategy to Circumvent the CFT DefectJ Front Pharma-col，2013，4:1 30 Villella V，Esposito S，Bruscia EM，et al Disease relevantproteostasis regulation of cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator J Cell Death Differ，2013，20(8):1101 1115 31 Siwiak M，Edelman A，Zielenkiewicz P Structural models ofCFT AMPK and CFT PKA interactions:domain flexi-bility is a key factor in CFT regulation J J Mol Model，2012，18(1):83 90 32 Puga Molina LC，Pinto NA，Torres odrguez P，et al Essentialole of CFT in PKA Dependent Phosphorylation，Alkaliniza-tion，and Hyperpolarization During Human Sperm Capacitation J J Cell Physiol，2017，232(6):1404 1414 33 Calle Guisado V，Hurtado de Llera A，Gonzlez Fernndez L，et al Human sperm motility is downregulated by the AMPK activa-tor A769662 J Andrology，2017，5(6):1131 1140 34 Torres Quiroz F，Filteau M，Landry C Feedback regulationbetween autophagy and PKAJ Autophagy，2015，11(7):1181 1183 35 Liu J，Liu W，Lu Y，et al Piperlongumine restores the balance ofautophagy and apoptosis by increasing BCL2 phosphorylation in ro-tenone induced Parkinson disease modelsJ Autophagy，2018，14(5):845 861 36 Izzo V，Pietrocola F，Sica V，et al Metabolic interactions be-tween cysteamine and epigallocatechin gallateJ Cell Cycle，2017，16(3):271 279 37 Tosco A，De Gregorio F，Esposito S，et al A novel treatment ofcystic fibrosis acting on target:cysteamine plus epigallocatechingallate for the autophagy dependent rescue of class mutatedCFT J Cell Death Differ，2017，24(7):1305 38 Galluzzi L，Baehrecke EH，Ballabio A，et al Molecular defini-tions of autophagy and related processesJ EMBO J，2017，36(13):1811 1836 39 万洪磊，谭超，刘升学，等 阴离子通道 CFT 表达水平与双酚 A 损伤小鼠精子活性的关系J 毒理学杂志，2017，31(6):471 473，482(收稿日期:2022 04 18编辑:杜冠辉)462广东医学2023 年 2 月 第 44 卷第 2 期Guangdong Medical JournalFeb 2023，Vol 44，No 2