小儿解表口服液体外抗流感病毒作用的研究_齐心.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）基于“脏病及腑”理论探讨宣白承气汤对与 共感染致肺肠免疫损伤及 调控机制研究；国家中医药管理局中医药循证能力建设项目（）儿童流感中医防治方案循证评价研究作者简介：齐心（.），女，硕士研究生在读，研究方向：中医药防治儿童常见病，：.通信作者：王雪峰（.），女，博士，主任医师，研究方向：中医药防治儿童常见病，：.小儿解表口服液体外抗流感病毒作用的研究齐 心 王雪峰 赫 昊（辽宁中医药大学，沈阳，；辽宁中医药大学附属医院，沈阳，）摘要 目的：研究小儿解表口服液对感染 的 细胞的疗效及可能的药效机制。方法：通过不同浓度的小儿解表口服液对 细胞的毒性实验及抗病毒实验，并采用 法结合 法得出药物的半数细胞毒性浓度（）、半数细胞抑制浓度（）及治疗指数（）。应用间接免疫荧光法检测小儿解表口服液作用于感染 的 细胞神经氨酸酶的变化。利用酶联免疫吸附试验检测小儿解表口服液对 病毒模型干扰素（）、表达的影响。结果：小儿解表口服液.，.，.。与模型组比较，小儿解表口服液组在 、均减少流感病毒神经氨酸酶的表达。在、个时间点中，与模型组比较，小儿解表口服液组均减少 、的释放，差异有统计学意义（均 .）。结论：小儿解表口服液对感染 的 有疗效，并且其降低、的表达，可能是产生疗效的作用机制。关键词 小儿解表口服液；流感病毒；细胞实验；法；间接免疫荧光；抗病毒指数；神经氨酸酶；型干扰素 ，（，；，）：，（），（），（）（）（）：.，.，.，（.）：，；中图分类号：.文献标识码：流感病毒在世界范围内传播，对人类健康、公共卫生、社会经济等方面造成了许多负面影响。流感病毒分为 种类型，分别为甲（）、乙（）、丙（）、丁（）型，其中甲型是季节性流感以及流感大流行的主要类别。最近的一次流感大流行发生在 年，造成了全球 的人死亡。据相关资料显示，该病毒株继续在人类中季节性传播。针对流感病毒的感染，常常采用奥司他韦等西药治疗，但却有报道称存在耐药性的问题。而有越来越多的研究表明中药有抗流感病毒的作用，并且还具备不良反应少等优点。有研究表明中成药中的抗病毒口服液、柴胡退热颗粒，中药提取物中的栀子提取物、板蓝根多糖、细辛多糖、刺五加苷等等均有抗甲型流感病毒的作用，并且有研究对相关机制进行了探讨。小儿解表口服液是由多种中药组成的中成药，用于治疗小儿外感风热引起的感世界中医药 年 月第 卷第 期冒。风热感冒在现代医学中属于急性呼吸道感染，多为病毒性感染。由此想研究小儿解表口服液对抗流感病毒的疗效。本研究建立感染 的 细胞模型，根据相关实验说明小儿解表口服液抗流感病毒的作用。材料与方法.材料.细胞与病毒人肺癌肺泡基底上皮细胞（）（广 州 赛 库 生 物 技 术 有 限 公 司，批 号：）。细胞用含 胎牛血清 于 、培养箱培养。毒株 （），由辽宁中医药大学附属医院病毒室提供。使用前接种于 日龄鸡胚尿囊腔，传代培养，血凝实验滴定病毒效价，血凝效价在 以 上 者，保存。本研究经过医学伦理委员会审批（伦理审批号：）。.药物 小儿解表口服液（威海人生药业有限公司，批号：）；可威（磷酸奥司他韦颗粒）（宜昌 东 阳 光 长 江 药 业 股 份 有 限 公 司，批 号：）。.试剂与仪器 培养基（大连美仑生物技术有限公司，批号：）；胎牛血清（公司，美国，批号：）；无菌磷酸盐缓冲液（，）（公司，美国，批号：）；胰蛋白酶消化液（苏州新赛美生物科技有限公司，批号：）；二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；噻唑蓝（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；羊抗兔 （）（公司，美国，批号：）；（北京博奥森生物技术有限公司，批号：）；，二脒基苯基吲哚（，）（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；封闭山羊血清（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；多聚甲醛固定液（苏州新赛美生物科技有限公司，批号：）；（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；抗荧光淬灭封片液（上海碧云天生物技术有 限 公 司，批 号：）；试剂盒（公司，美国，批号：），试剂盒（公司，美国，批号：）。生物安全柜（上 海 力 申 科 学 仪 器 有 限 公 司，型 号：）；二氧化碳培养箱（公司，美国，型号：）；低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：）；倒置显微镜（公司，德国，型号：）；荧光倒置显微镜（公司，日本，型号：）；酶标仪（公司，美国，型号：）。.方法.分组与模型制备设置正常组，模型组，小儿解表口服液组，磷酸奥司他韦组。细胞长满单层后，用 组织培养感染量（，）流感病毒液吸附，后吸去病毒液，换上维持液。.给药方法将小儿解表口服液用无血清培养液稀释成 ，磷酸奥司他韦颗粒配制成 。再用无血清培养液分别作 倍稀释，即 ，稀释成 个浓度，保存备用。根据实验需求，将含药维持液加入到 细胞模型中，按照相应实验时间进行不同时间吸附。.药物细胞毒性实验取对数生长期的 细胞，胰蛋白酶消化成细胞悬液，在 孔板上，每孔加入 细胞，待 长成单层后，分别加入小儿解表口服液、磷酸奥司他韦 个稀释度的含药维持液，置于、培养箱培养 。每个浓度设 个复孔，并设正常细胞对照组。每日于倒置显微镜下观察致细胞病变（，）。后吸出孔中液体，用磷酸盐缓冲液（，）冲洗细胞 遍，每孔加入 的 溶液，孵育 ，弃上清液，每孔加入 二甲基亚砜溶液，振荡 ，置酶标测定仪上，测定 波长处的光密度（，）值。计算细胞存活率，细胞存活率 药物处理组 值 正常细胞对照组 值 。以统计软件 .对数据进行 回归分析，计算药物的半数细胞毒性浓度（，）。.药物抗 流感病毒治疗指数实验在长满单层 细胞的 孔板上，每孔接种 的 的流感病毒液，吸附 ，弃上清液。根据细胞毒性实验的结果，在小儿解表口服液和磷酸奥司他韦半数细胞毒性浓度范围内，分别加入不同浓度含药维持液，置于、培养箱 ，培养 。每个浓度设 个复孔，同时设正常细胞对照组和病毒对照组。每日于倒置显微镜下观察。后吸出孔中液体，用 冲洗细胞 遍，每孔加入 的 溶液，孵育，弃上清液，每孔加入 二甲基亚砜溶液，振荡 ，置酶标测定仪上，测定 波长处的光密度 值。计算病毒抑制率，病毒抑制率（药物处理组 值 病毒对照组 值）（细胞对照组 值 病毒对照组 值）。对各浓度组所得病毒抑制率进行 回归分析，并计算半数细胞抑制浓度（）。采用治疗指数（，）作为评价指标，用以评价药物对流感病毒的抑制效力，。.间接免疫荧光实验在细胞培养小室中分别加入 的 细胞悬液，待长成单层后，吸弃废液，每格接种 的病毒液，吸附 ，弃上清液。分别加入 的小儿解表口服液和磷酸奥司他韦含药维持液，置于、培养箱培养、。同时设置正常组和模型组。在 、个时间点分别取出小室。用的多聚甲醛室温固定，.透化，封闭山羊血清室温封闭，加神经氨酸酶一抗（）放在湿盒里 过夜，加 羊抗兔 二抗（）室温反应 ，核染，冲洗 次，蒸馏水冲洗，抗荧光淬灭封片剂封片，于倒置荧光显微镜观察。.酶联免疫吸附试验检测干扰素（，）拆除培养小室时分别收取不同组别细胞上清液于 离心管中，离心（离心半径.、转速 、时间）取上清液，使用相应的酶联免疫吸附试验试剂盒检测细胞上清液中的、，利 用 酶 标 仪 在 下 读 取 值。.统计学方法采用 .统计软件进行数据分析，软件进行图表绘制。相关数据采用均值 标准差（?）表示。多组数据间的比较用单因素方差分析。细胞存活率和病毒抑制率与药物浓度之间的关系用 回归分析。结果.药物细胞毒性实验结果不同浓度的药物作用于 细胞后，随着药物浓度的降低，细胞存活率逐渐升高。经 回归分析得出小儿解表口服液.，磷酸奥司他韦.。见表。表 细胞毒性实验结果组别药物浓度（）细胞存活率（）（）小儿解表口服液组.磷酸奥司他韦组.药物抗 流感病毒治疗指数结果在范围内的药物作用于 细胞感染流感病毒模型后，随着药物浓度的降低，病毒抑制率逐渐降低。经 回归分析得出小儿解表口服液.，磷酸奥司他韦 .。经过计算，小儿解表口服液 .，磷酸奥司他韦 .。见表。表 药物抗 流感病毒治疗指数结果组别药物浓度（）病毒抑制率（）（）小儿解表口服液组.磷酸奥司他韦组.间接免疫荧光实验结果正常组在 、均没有流感病毒神经氨酸酶的表达；与正常组比较，模型组、小儿解表口服液组以及磷酸奥司他韦组在 、有明显的神经氨酸酶的表达；与模型组比较，小儿解表口服液组以及磷酸奥司他韦组在 、这 个时间点神经氨酸酶的表达均减少。见图。.酶联免疫吸附试验检测，实验结果与正常组比较，其他组 上清液中，的表达含量均有增多（均 .）；与模型组比较，小儿解表口服液组以及磷酸奥司他韦组在、的，表达均减少（均 世界中医药 年 月第 卷第 期.）；小儿解表口服液组各时间点，的表达与磷酸奥司他韦组比较，差异均有统计学意义（均 .）。见表 。图 更直观地表现了，不同时间点组间的差异。图 间接免疫荧光检测流感病毒神经氨酸酶的表达（间接染色法，）注：蓝色部分为 细胞核，绿色部分为流感病毒神经氨酸酶表 各组细胞上清液中 含量（?，）组别 正常组.模型组.小儿解表口服液组.磷酸奥司他韦组.注：与正常组比较，.；与模型组比较，.；与磷酸奥司他韦组比较，.表 酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中 含量（?，）组别 正常组.模型组.小儿解表口服液组.磷酸奥司他韦组.注：与正常组比较，.；与模型组比较，.；与磷酸奥司他韦组比较，.图 细胞上清液中 不同时间点的表达 注：与正常组比较，.；与模型组比较，.；与磷酸奥司他韦组（西药组）比较，.，图 细胞上清液中 不同时间点的表达 注：与正常组比较，.；与模型组比较，.；与磷酸奥司他韦组（西药组）比较，.讨论感冒一词首次提出是在北宋杨士瀛的仁斋直指方论中，“感冒风邪，发热头痛，咳嗽声重，涕唾稠黏”。此描述与流感症状相似。风热感冒即风热之邪侵犯肺卫所致。小儿解表口服液可用于治疗儿童恶寒发热、头痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痒痛等风热感冒症状。其主要成分包括金银花、连翘、牛蒡子、蒲公英、黄芩、防风、紫苏叶、荆芥穗、葛根、牛黄，各药联合起来，有宣肺解表、清热解毒的功效。人类肺癌肺泡基底上皮细胞 已被广泛用于体外研究甲型流感病毒复制，因此本实验选用 细胞进行流感病毒造模。本实验发现小儿解表口服液作用于 细胞之后，随着药物浓度的降低，毒性越来越小。当小儿解表口服液作用于 细胞流感病毒模型时，发现该药确实有抗流感病毒的作用，并且随着 范围内的药物浓度的增加是逐渐有效的，并得出当病毒抑制率为 的时候，小儿解表口服液浓度为.，在此浓度下药物对细胞不存在过度抑制现象，因此选用此浓度用于后续实验作为最佳药物浓度。又经计算得出小儿解表口服液对流感病毒的抑制效力指数为.，这是用具体数值说明了小儿解表口服液对抗流感病毒的效力。甲型流感病毒具有血凝素和神经氨酸酶 种表面蛋白，这 种蛋白在流感病毒感染过程中发挥重要的作用。其中神经氨酸酶的经典作用是促进子代病毒从细胞中脱颗粒、释放。而且其还介导流感病毒与细胞受体的结合。近期有实验研究表明，通过中药相关物质治疗，可以抑制神经氨酸酶。本实验通过标记流感病毒的神经氨酸酶，发现在、这 个时间点中，小儿解表口服液均减少流感病毒的表达，这是用最直观的方式说明小儿解表口服液治疗流感病毒感染有效。流感病毒感染宿主细胞后，天然免疫系统被启动，通过相应通路产生型干扰素，进而激活下游干扰素刺激基因（，），激活机体细胞转变为抗病毒状态以清除流感病毒。包括多种类别，主要为 和。有实验研究表明，流感病毒感染会导致 和 增加，经过治疗会减少分泌。本实验通过对各组细胞上清液中的 和 的含量进行检测，发现流感病毒感染会导致 细胞产生免疫反应，导致 和 的含量增加。经过小儿解表口服液治疗后，明显抑制了，的产生，说明小儿解表口服液通过抑制型干扰素来抑制细胞的免疫反应从而达到抗流感病毒的作用，这可能是小儿解表口服液的药效机制。综上所述，小儿解表口服液能有效对抗甲型流感病毒的感染，并且可以通过免疫反应调节型干扰素的产生以达到抗病毒的作用。利益冲突声明：无。参考文献 ，（）：，（），（）：，：，（）：毛鑫，姚荣妹，包蕾，等 抗病毒口服液防治甲型流感病毒感染的药效学研究 西部中医药，（）：王丽丽 基于 信号通路探究柴石退热颗粒对机体感染甲型流感病毒机制研究 宜春：宜春学院，李菲，赵新亚，赵雪梅，等 银花青蒿栀子方抗 型柯萨奇病毒活性成分的分离 中草药，（）：，（）：（下接第 页）世界中医药 年 月第 卷第 期 概要 中国循环杂志，（）：王少卿，刘强，高颖 气虚血瘀证诊断量表编制研究 中华中医药杂志，（）：李祥，张悦，张文智，等 气虚血瘀证动物模型的研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：余景滔，周红玲，刘俊珊，等 基于斑马鱼炎症模型的凉膈散及其组分甘草不同极性部位的抗炎活性评价及作用机制 中国实验方剂学杂志，（）：任擎宇，张姗姗，刘可春，等 利用斑马鱼模型评价三消草不同提取物的抗癫痫活性 中国新药杂志，（）：陶嘉磊，袁斌，汪受传 中医证候学研究的技术方法及其运用现状 中华中医药杂志，（）：毛静远，牛子长，张伯礼 近 年冠心病中医证候特征研究文献分析 中医杂志，（）：王紫艳，李磊，刘建勋，等 血瘀证血小板改变及中医药作用研究进展 中国中药杂志，（）：，（）：，（）：陈俣祯，陈芳，朱建平，等 药食同源中药调控氧化应激防治冠心病的研究进展 中草药，（）：刘凤岚，朱梦梦，王青，等 心血管病继发认知障碍与心脑同治的中医药防治策略 中国实验方剂学杂志，（）：杨凯晶，于淼，薛一涛 中医药治疗心力衰竭及其对心肌组织 含量影响的研究进展 世界中医药，（）：，张婉勤，吕仕超，朱亚萍，等 冠心病气虚血瘀证的证候学研究现状 中医杂志，（）：，：，（）：，：，（）：？，（）：耿洪娇，谢雁鸣，王志飞 脑心通胶囊治疗气虚血瘀证脑梗死及冠心病心绞痛的临床综合评价 中国中药杂志，（）：李云，吴吉婷，姜薇薇 针刺联合益气活血方治疗慢性心力衰竭气虚血瘀证的临床疗效及对患者血清炎症指标和血流动力学的影响 河北中医，（）：，（）：（收稿 本文编辑：张雄杰）（上接第 页）杨佳，付业佩，杜宝香，等 细辛多糖对流感病毒 型感染的保护作用及对炎症因子表达水平的影响 中国中药杂志，（）：，（）：石玲婷，黄运福，李巧华 小儿解表口服液对 例风热感冒患儿的临床疗效分析 北方药学，（）：王淑梅，李凌霞 中药治疗风热感冒的研究进展 医学综述，（）：杨士瀛 仁斋直指方论 福州：福建科学技术出版社，：王雪峰，郑健 中西医结合儿科学 版 北京：中国中医药出版社，：，（）：李晶晶，徐佳伊，左浩江，等 粗壮女贞提取物抗甲型流感病毒的作用及机制初探 现代预防医学，（）：王惠娴 葛根素作为神经氨酸酶抑制剂的抗流感作用研究 广州：广州中医药大学，（）：，（）：，（）：，（）：张世鹰，何谷良，卢芳国，等 基于 介导的 蛋白表达水平探讨麻黄先煎之麻杏石甘汤抗流感病毒的机制中华中医药杂志，（）：（收稿 本文编辑：杨觉雄），