细胞焦亡在狼疮性肾炎发病机制中的研究进展_王晨.pdf

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81860131,82060133);广西 自 然 科 学 基 金资助项目(2017GXNSFAA198288,2019GXNSFDA245004)作者单位:533000百色,右江民族医学院附属医院肾内科通信作者:林栩,教授,硕士生导师,电子信箱:linyyfyy 细胞焦亡在狼疮性肾炎发病机制中的研究进展王晨林栩摘要细胞焦亡(pyroptosis)是一种程序性细胞死亡方式,其经典途径表现为炎性小体激活,半胱天冬酶-1(caspase-1)活化,Gasdermin D 蛋白(GSDMD)切割细胞膜,炎性介质白细胞介素(interleukin,IL)-1 和白细胞介素-18(IL-18)释放;近年来研究也发现鼠的半胱天冬酶-11(caspase-11)和人的半胱天冬酶-4/5(caspase-4/5)经非经典途径可以直接识别细菌脂多糖类脂 A 组装的炎性小体导致细胞焦亡。狼疮性肾炎作为一种复杂的自身免疫性疾病,多种细胞死亡过程与狼疮性肾炎的发展相关,在狼疮的组织损伤及免疫失调中发挥作用。近年来有研究表明,焦亡也参与狼疮性肾炎的发生、发展,在狼疮性肾炎进展过程中,肾组织中 NLRP3、caspase-1 等参与焦亡的基因表达显著增加,且临床上使用的激素联合治疗方式的内在机制被证明也是通过抑制狼疮性肾炎患者 caspase-1 及 GSDMD 的基因表达。为了进一步了解细胞焦亡在狼疮性肾炎发病机制中扮演着什么样的角色。本文就细胞焦亡的发生机制及其参与狼疮性肾炎疾病的治疗研究做一综述,旨在为狼疮性肾炎靶向诊疗提供理论依据。关键词细胞焦亡狼疮性肾炎Nod 样受体蛋白 3半胱天冬酶-1Gasdermin D 蛋白中图分类号R593文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.02.005系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种复杂自身免疫性疾病,累及全身多器官系统,有多种免疫细胞如 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的参与,以多种抗体以及免疫复合物的形成、补体激活为特征。狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是 SLE患者的常见并发症。临床上以免疫抑制剂合并糖皮质激素为主要治疗手段,虽然病死率及肾脏存活率有所改善,还是有 10%30%的狼疮性肾炎发展为肾衰竭,需要肾脏替代治疗1,2。因而早期诊断及规范化治疗对提高狼疮病人生活质量以及改善预后有及其重要的意义。随着学术界对细胞程序性死亡的深入了解,目前已有研究表明,细胞焦亡这种新型细胞死亡方式与狼疮性肾炎的疾病进展密切相关。本文就细胞焦亡参与狼疮性肾炎疾病发生、发展机制的研究进展及未来应用前景展开讨论。一、细胞焦亡焦 亡 属 于 细 胞 程 序 性 死 亡(progammed celldeath,PCD)的一种,是混合坏死和凋亡特征的一种非典型细胞死亡方式,在促进人的生长发育以及维持内环境稳态方面具有重要意义3。在 1992 年,Zychlin-sky 等发现了福氏志贺菌感染的巨噬细胞发生了细胞死亡,该型细胞死亡有细胞凋亡的特征:染色质固缩及 DNA 片段化,当时认定这种细胞死亡方式为细胞凋亡;无独有偶,Hilbi 前后在 1997 年及 1998 年,在观察福氏志贺菌诱导巨噬细胞凋亡的过程中发现了激活的含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶 1(cysteinylaspartate specific proteinase 1,caspase-1)表达,且证明该种死亡方式不依赖于 caspase-3,而是依赖于caspase-14,5;1999 年,Hersh 等通过敲除巨噬细胞caspase-1 阻断巨噬细胞死亡,证明 caspase-1 可能是此种细胞死亡方式的关键蛋白6。此后 Brennan在 2000 年通过沙门菌诱导巨噬细胞死亡实验中也同样发现了该死亡方式与 caspase-1 密切相关,明确提出该种细胞死亡方式不同于细胞凋亡,可以破坏细胞膜,不伴有凋亡相关 caspase-3 及 PARP 的活化,且有明显的 DNA 片段化7。2001 年 Cookson 和 Bren-nan 等正式以细胞焦亡来命名这种死亡方式8。至此关于细胞焦亡的研究开始飞速发展。2015 年 Gas-dermin D 作为焦亡关键效应蛋白被报道,焦亡的下游作用机制逐步完善9。随着对细胞死亡方式的研究以及对相关机制的了解,2018 年细胞死亡命名委员会(Nomenclature Committee on Cell Death,NCCD)定义细胞焦亡为依赖 Gasdermin 蛋白家族成员形成的质膜孔隙的一种细胞死亡方式,与炎性 caspase 的激活与否没有必然联系,至此学术界对于细胞焦亡的定02医学前沿J Med Res,February 2023,Vol.52 No.2义日趋完善10。细胞焦亡、细胞凋亡及细胞坏死三者同属 PCD,彼此之间在生化和形态学特征虽有相似也各有不同,简言之胞核固缩或断裂,胞膜完整,有凋亡小体形成,为凋亡(apoptosis)细胞形态特征;胞核固缩或断裂,胞质肿胀,胞膜不完整,且有炎性小体的形成,为焦亡(pyroptosis)细胞形态特征;胞核肿胀或溶解,胞质肿胀,胞膜不完整,且有坏死小体的形成,为坏死(nec-rosis)细胞形态特征。细胞凋亡是一种由基因调控由凋亡小体介 导的非炎 性细胞程序 性 死 亡 方 式。细胞坏死和焦亡可引起强烈的细胞炎症,质膜的完整与否是区别细胞凋亡与细胞坏死和焦亡的标志,细胞坏死中细胞膜通道成孔是由混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like pro-tein,MLKL)介导的,而细胞焦亡则 依赖于 Gasder-min 蛋白家族的非选择性打孔特性11,12。根据不同细胞死亡过程 中细胞膜通 透性的变化,可 以 通 过Yo-PRO-1 和 Eth D-2 双染证实是否发生焦亡现象13 16。Yo-PRO-1 是一种细胞膜封闭的阳离子,在凋 亡 早 期 细 胞 膜 通 透 性 轻 微 增 加,此 时 Yo-PRO-1 可以进入细胞与 DNA 结合形成绿色荧光,Eth D-2 相对分子质量则较大不能通过焦亡的细胞膜孔进入,而在坏死细胞中可呈现阳性,且有不能与其他染料共存的特性,详见表 1。表 1细胞凋亡、焦亡及坏死的比较项目细胞凋亡细胞坏死细胞焦亡细胞死亡模式属细胞程序性死亡属细胞程序性死亡属细胞程序性死亡诱因生理性病理性病理性细胞形态细胞皱缩细胞肿胀细胞肿胀细胞质胞质固缩内容物释放内容物释放细胞核固缩核染色质缺失固缩细胞膜起泡有一定完整性通道形成活性完整性丧失非选择性形成质膜膜孔完整性丧失小体形成凋亡小体坏死小体焦亡小体炎性反应没有有有炎性范围散在的单个细胞死亡大片的聚集的细胞死亡散在的单个细胞死亡关键效应蛋白依赖非炎症性 caspaseMLKL 蛋白Gasdermin 家族AnnexinV凋亡早期阳性阳性阳性PI 染色凋亡晚期阳性阳性阳性Eth D-2 染色阴性阳性阴性Yo-PRO-1 染色凋亡早期阳性阳性阳性TUNEL 染色阳性阳性阳性DNA 电泳梯状 DNA弥散性降解弥散性降解基因调控是否否二、细胞焦亡关键蛋白焦亡主要发生机制为 NOD 样受体(NLRs)或Toll 样受体(TLRs)通过识别胞内或胞外的刺激因子,从而促进炎性小体的组装,炎性小体(inflamma-some)由 3 个主要部分构成,细胞质传感器 NLR 蛋白(NOD-containing protein-like receptors)、衔接蛋白凋亡相关斑点蛋白 ASC(apoptotic-associated speck-like protein containing CARD)和炎性半胱天冬氨酸蛋白酶-1 前体蛋白(pro-caspase-1)。ASC 作为接头蛋白负责 NLR 蛋白及 pro-caspase-1 的连接。又根据炎性小体的组成受体不同,分为 NLRP1 炎性小体、NLRP3 炎性小体、AIM2 炎性小体、IPAF 炎性小体。其中 NLRP1 炎性小体及 IPAF 炎性小体可以不依赖于接头蛋白 ASC 可以直接与 pro-caspase-1 连接17。炎性小体在细胞焦亡中起承上启下的关键作用,炎性小体是一类可以在胞内识别病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)信号的受体。通过识别上游刺激,募集并活化 caspase-1,活性 caspase-1 切割下游关键蛋白 GSDMD,形成有细胞毒性的 GSDMD-N 端,激活下游炎性细胞因子IL-1、IL-18。最 终 导 致 细 胞 焦 亡。活 化 的caspase 切割 GSDMD-N 端及 GSDMD-C 端之间的柔性连接蛋白从而解除 C 端的自身抑制效应,以此激活 Gasdermin。Gasdermin 蛋白作为一种打孔蛋白可以在细胞膜上形成功能性孔隙,导致细胞肿胀破裂,胞内炎性物质释放激活并放大炎性反应。以下就caspase 家族及 Gasdermin 家族在细胞焦亡这一过程中的作用机制作简略阐述。12医学研究杂志 2023 年 2 月第 52 卷第 2 期医学前沿caspase 家族首先是作为细胞凋亡的关键蛋白而被人们熟知,随着研究的不断深入,caspase 家族的其他功能也被渐渐发掘。目前已知 caspase 家族有 16个成员,序列及结构高度相似,主要以 N 端前域结构的不同而鉴别,通常以无活性的酶原形式存在。这其中以 caspase-1 研究历史最为久远,参与多种疾病的发生、发 展。caspase-1 最 早 是 作 为 白 细 胞 介 素(IL)-1 转换酶(ICE)被发现,且与 1993 年发现的线虫凋亡相关的蛋白 CED-3 具有同源性。目前认为细胞焦亡主要是由 caspase-1/4/5/11介导的一种细胞程序性死亡。根据 caspase 的不同区分焦亡的经典与非经典途径。依赖于 caspase-1 的细胞死亡方式称为经典焦亡途径,在内源性或者外源性危险信号刺激下,炎性小体组装活化,炎性小体活化后将 pro-caspase-1 激活为活化的 caspase-1,并介导促进白细胞介素-1 和 IL-18 等炎性细胞物质的成熟及释放,从而招募更多的炎性细胞一步放大炎性反应。依赖人源 caspase-4/5 和鼠源的 caspase-11 的细胞死亡方式称为非经典焦亡途径,脂多糖(li-popolysaccharide,LPS)不依赖与 TLR4 可以直接通过与 CARD 域(caspase 募集结构域)结合激活caspase-4/5/119,18,19。活化后的 caspase-4/5/11 同样可以通过切割下游 GSDMD,使后者 C 端结构域与 N 端结构域分离,暴露 N 端结构域,解除 GSDMD 的自身抑制作 用。2015 年 有 研 究 者 发 现 缝 隙 连 接 蛋 白 1(pannexin-1,Panx-1)及膜通道嘌呤能受体蛋白P2X7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion chan-nel 7)在非经典途径中发挥不可或缺的作用20。也有研究发现 caspase-3 可以通过切割 GSDME 并引发焦亡。Gasdermins 家族是一类在细胞焦亡的下游通路发挥活性的具有打孔功能的蛋白家族。包括括 Gas-dermin-A(GSDMA)、Gasdermin-B(GSDMB)、Gas-dermin-C(GSDMC)、Gasdermin-D(GSDMD)、Gas-dermin-E(GSDME/DFNA5)和 Pejvakin(PJVK/DFNB59)。其中 GSDMD 及 GSDME 在细胞焦亡中发挥主要作用,GSDMD 的 N 端具有细胞毒性,C 端与 N端在 静 息 状 态 下 结 合 抑 制 不 发 挥 毒 性 作 用。当caspase 活化后,可激活 GSDMD 解除自身抑制。该 N端结构域具有在膜上打孔的作用,可导致细胞膜孔洞形成,细胞不断膨胀直至破裂,细胞内容物 IL-1和 IL-18 等释放,从而激活并放大炎性反应,引发细胞焦亡21。三、细胞焦亡在 LN 的炎性进展中发挥重要作用无菌性炎性反应是许多临床肾脏疾病的特征,SLE 及 LN 中炎症机制的失调,可以促进 LN 的器官损害,已有研究表明细胞焦亡在 SLE 和 LN 疾病发展过程中起重要作用,细胞焦亡可能成为系统性红斑狼疮的一种重要发病机制22。研究证实,NLRP3 炎症体的激活以及其介导下游 caspase-1 依赖的细胞因子 IL-1 和 IL-18 的释放,导致 Gasdermin D 介导的致死性细胞焦亡23。在 LN 患者和狼疮易感小鼠的足细胞中 NLRP3 炎性小体及 caspase-1 的活性片段 p20 被激活,且抑制 NLRP3 的激活可以减少狼疮性肾炎 IL-1、caspase-1 的表达、足细胞损伤和蛋白尿的产生24。2011 年 Kahlenberg 等在狼疮性肾炎活检组织中检测到 NLRP3、caspase-1 和血清 IL-18 表达的增加25。提示这一组织为炎性小体的激活及细胞焦亡的发生做准备。2013 年该课题组又发现 SLE 患者中发现中性粒细胞胞外杀伤网格(neutrophil extracellu-lar traps,NETs)增多,可激活巨噬细胞中的 NLRP3小体,促进 caspase-1 的活化及 IL-1 和 IL-18 的释放,诱导细胞焦亡的产生,IL-18 能够再次诱发NETs,循环加重 SLE 的发展及器官损害26。2014 年Kahlenberg 等27通过进一步构建狼疮小鼠模型,发现缺乏炎性小体中枢 caspase-1 的小鼠不表现出SLE 和 LN 的症状。在 LN 中,Pim-1 可以激活 NL-RP3 炎性小体导致焦亡通路的进一步活化,而在沉默Pim-1 基因的足细胞中 NLRP3、caspase-1、p20 及IL-1 的活性则明显降低,这同样提示了细胞焦亡通路激活在 SLE 及 LN 发病机制中的重要作用28。也有研究者提出在 LN 中不仅有焦亡通路活性的增强,焦亡细胞的清除障碍可能会导致狼疮患者长期暴露自身抗原从而破坏免疫耐受进一步推动 SLE 的发病29,30。但这 一 观 点 还 需 要 更 多 临 床 研 究 数 据证实。四、展望细胞焦亡发现以来,研究者通过对细胞焦亡的定义、打破、再定义、再打破。随着对细胞焦亡的了解不断深入,作用机制也逐渐明朗。大量研究表明细胞焦亡在许多肿瘤免疫及心血管疾病发病机制中发挥了重要作用。学术界关于狼疮与焦亡的研究空间很大,其中抑制细胞焦亡的过度激活并加速焦亡细胞的清除有可能是一种有力的狼疮治疗措施。未来的研究可以针对 caspase 的激活机制及与 GSDMD 的直接作22医学前沿J Med Res,February 2023,Vol.52 No.2用关系,实现精准用药,使导入体内的细胞焦亡关键蛋白 caspase-1 及 GSDMD 等抑制剂直接作用于狼疮关键靶点。参考文献1 Parikh SV,Almaani S,Brodsky S,et al.Update on lupus nephritis:core curriculum 2020J.Am J Kidney Dis,2020,76(2):265-2812 Hoi AY,Morand EF.Treatment update in systemic lupus erythema-tousJ.Rheum Dis Clin North Am,2021,47(3):513-5303 Kroemer G,Galluzzi L,Vandenabeele P,et al.Classification of celldeath:recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death2009J.Cell Death Differ,2009,16(1):3-114 Hilbi H,Chen Y,Thirumalai K,et al.The interleukin 1beta-con-verting enzyme,caspase 1,is activated during Shigella flexneri-in-duced apoptosis in human monocyte-derived 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