细菌-多肽纳米颗粒复合体的超微结构表征_卿光超.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）细菌多肽纳米颗粒复合体的超微结构表征卿光超，郭宏博，张宇轩，李宪磊，甘雅玲，罗 阳，梁兴杰（国家纳米科学中心，北京；重庆大学医学院，重庆）摘 要 细菌感染严重危害人类健康和公共卫生安全。基于抗菌肽（）的多肽纳米颗粒在对抗细菌耐药中展现出巨大潜力，在多肽纳米颗粒与细菌相互作用的过程中，其超微结构形态的变化对阐明多肽纳米颗粒的抑菌机制至关重要。本文开发了一种对细菌具有较好亲和力的多肽纳米颗粒（），并利用扫描电子显微镜（）和透射电子显微镜（）观察了金黄色葡萄球菌（）和铜绿假单胞菌（）在结合 前后的超微结构形态。结果显示，与 共孵育后，细菌表面覆盖着明显的凸起状物质，表明 可以有效结合在 和 表面。关键词 微观形貌；多肽纳米颗粒；细菌中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家重点研发计划项目（）；国家自然科学基金重点项目（）；国家自然科学基金面上资助项目（，）；国家杰出青年科学基金资助项目（）作者简介：卿光超（），男（汉族），四川人，在读博士研究生：通讯作者：梁兴杰（），男（汉族），河北人，教授，博士研究生导师：罗阳（），男（汉族），重庆人，教授，博士研究生导师：细菌感染对人类健康和全球公共卫生安全构成严重威胁，耐药细菌的出现进一步加剧了这一状况。研究表明，全球每年约有 万人死于耐药细菌感染，其中近 的耐多药或极度耐药细菌是由于过度使用或滥用抗生素而产生的。有研究指出，随着后抗生素时代的到来，到 年，预计每年将有 万人死于耐药细菌感染，经济损失预计将达到 万亿美元。因此，迫切需要开发新的且不易引起细菌产生耐药性的抗菌策略。抗菌肽（）能够通过不可逆地破坏细胞膜的方式实现对病原体的破坏。天然和合成的 具有广谱活性好、作用机制广、杀伤细菌快、耐药倾向低等特点，在先天免疫中发挥着关键作用，是治疗多药耐药细菌感染的潜在候选药物。研究表明，可以通过促进跨膜孔的形成、破坏膜的完整性、抑制细菌细胞壁的合成、破坏胞内蛋白和核酸的活性等方式破坏细菌细胞或进入细菌细胞内部，从而诱导细菌死亡。此外，诸如 防御素 和贻贝防御素等 还可通过在细菌表面自组装成纳米纤维网络结构实现对细菌的捕获，进而阻止其入侵宿主细胞且不易产生耐药性。这种非杀伤的抗菌机制为开发新型抗菌策略提供了新的思路，在此基础上开发的仿生自组装多肽纳米材料已在抑制小鼠皮下感染和菌血症中取得积极进展。然而，受限于自身理化特性和易被血清中各类蛋白酶降解，临床上还没有较为经典的 药物得到大范围应用。近年来，随着纳米技术的不断发展，基于抗菌肽的多肽纳米颗粒在对抗病原微生物感染和降低耐药性方面展现出较大潜力。多肽纳米颗粒可通过与细菌细胞膜的相互作用实现对细菌生命活动的影响。在多肽纳米颗粒与细菌发生相互作用的过程中，对其超微结构形态的观察有利于阐明多肽纳米颗粒的抑菌机制，从而为多肽纳米颗粒用于细菌感染治疗提供微观机理支持。本文作者团队开发了一种多肽纳米颗粒（），并利用电镜技术对金黄色葡萄球菌（）和铜绿假单胞菌（）在结合 前后的超微结构形态进行了表征。结果显示，能够有效结合在两种细菌表面，并呈现明显的凸起状结构，且不会显著损害细菌细胞。这与 防御素 或贻贝防御素捕获细菌后呈现的结构相似，预示着 可能通过类似的方式捕获细菌，从而阻断细菌侵袭宿主细胞、进而抑制细菌感染。电子显微学报 第 卷 实验方法 细菌培养与多肽纳米颗粒制备 将单菌落细菌置于 牛肉膏蛋白胨培养基中，在 恒温摇床中振摇过夜。随后，将 的菌液分别加入至 的 和 溶液中，于 恒温摇床中振摇 。随后 离心 ，弃去上层清液，并用磷酸盐缓冲液（）清洗三次。细菌多肽纳米颗粒复合体的扫描电镜样品制备与表征 将 中所得产物分散于 的戊二醛溶液中。固定过夜后，离心 ，弃去上清，清洗三次，并使用梯度浓度的乙醇溶液对所得产物进行脱水处理。最后，取 样品滴至干净的硅片上，并于冷冻干燥机中冻干过夜。喷金处理后，上机观察。细菌多肽纳米颗粒复合体的透射电镜样品制备与表征 取 中经 清洗第三次后所得样品，弃去上清，随后向管中小心加入 的戊二醛溶液。固定过夜后，清洗三次，每次；弃去 后，向管中加入 的锇酸固定液，室温固定 ，弃去固定液后，清洗三次，每次 。用梯度浓度的乙醇溶液对所得样品进行脱水处理，然后依次使用 乙醇、乙醇和丙酮的混合溶液（）、丙酮对样品进行脱水，每次 。依次使用体积比为 和 的丙酮环氧树脂包埋剂（）溶液浸透所得样品各 。继续使用体积比为 的丙酮环氧树脂包埋剂溶液和 环氧树脂包埋剂对所得产物进行浸透过夜处理。将浸透的样品依次放置于 、和 的恒温孵箱中聚合各 后形成包埋块。用超薄切片机将包埋块切成超薄切片并置于电镜载网上，经 的醋酸铀枸橼酸铅染色后，用透射电镜观察。结果与讨论 可以通过其表面的抗菌肽（）结合到细菌表面，从而呈现出较强的细菌结合能力。作为对照，作者以 替换 中的，从而得到对细菌基本没有结合能力的。首先采用扫描电子显微镜（，日立）对 和 结合了 和 前后的结构进行观察。如图 所示，在与 和 孵育后，仍为球状结构；类似的，也保持着与 组中的细菌相一致的杆状结构，表明 和 均不会对细菌造成明 显 损 伤。与 孵 育 后，和 的表面均覆盖着凸起状物质，说明 已结合到两种细菌表面。值得注意的是，相比于，表面结合了更多，这可能是由两种细菌本身的结构差异导致的。而与 孵育后，和 的表面形貌与 组无明显差异。图 不同多肽纳米颗粒处理后细菌的扫描电镜图。，第 期卿光超等：细菌多肽纳米颗粒复合体的超微结构表征 为进一步探究细菌在结合 后的结构变化，本研究使用透射电子显微镜（，日立）对其进行观察研究。如图 所示，与 共孵育后，其结构形态与 组中的细菌一致，其细胞壁边界清晰，外层无附着物。而与 共孵育后，的细胞壁外呈现出清晰的虚拟边缘层（如图 白色虚线圈外），表明 结合并包裹在了 的表面。与 共孵育后，被凸起状物质包裹（如图 白色箭头所示），而在 组和 组中没有观察到类似的结构，表明 能有效地结合在 表面。图 不同多肽纳米颗粒处理后细菌的透射电镜图。，结论 本研究利用电镜技术对与 孵育后的 和 的超微结构进行了观察。结果显示，能够有效结合在两种细菌表面，且不会对细菌细胞造成明显损伤。该作用方式与 防御素 和贻贝防御素捕获细菌的方式相似，预示着 能够以类似的方式结合在细菌表面，从而阻断细菌侵袭宿主细胞，进而抑制细菌感染。因此，如果将 同传统抗生素联合使用，将有望提高传统抗生素杀伤某些耐药细菌的能力，从而为治疗耐药细菌感染提供新的思路。此外，同细菌的作用方式也为新型抗菌策略的开发提供了一定参考。本研究也为后续利用 治疗细菌感染奠定了一定的基础。参考文献：，：，（）：，（）：，：，（）：；，（）：电子显微学报 第 卷 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：赵晓欢，吕洋，巩志伟，等 纳米银对三种纤毛虫超微结构的影响 电子显微学报，（）：，“”，（）胡西学，郭宏博，宫宁强，等 一种简单的光电关联方法 电子显微学报，（）：，：，（）：，（，；，），（）（）（），；