转录组测序技术在鹅产业相关研究中的应用_周迪.pdf

2022年12月摘要：鹅是一种重要的经济动物，其肉中蛋白质含量很高，脂肪含量很低，被贵州省列为重点发展的绿色健康食品之一。随着转录组测序技术的发展，应用转录组学解析鹅的繁殖性能、肉质与生长性状、宿主与病原的关系、皮肤毛囊等的分子调控机制，成为近年来研究的热点。通过研究鹅遗传资源，解析其分子调控机制，进而对鹅进行育种工作，推动鹅产业发展。笔者对近年来鹅相关的研究进行综述，旨在为后续研究提供参考资料。关键词：鹅；转录组；差异基因；性腺轴；鹅细小病毒鹅是杂食性水禽，属于鸟纲雁形目鸭科，是一种重要的经济动物。因为鹅的肉和蛋作为人类食物具有很高的营养价值，也能够控制农作物的病虫害，成为粮食安全的贡献者1。据 中国家禽遗传资源志记载，我国有 29 个地方鹅品种，1 个家鹅培育品种2。鹅品种与鸡相比较少，但其属于季节性繁殖动物，根据纬度和季节性产蛋的不同，可分为完全长日照繁殖型、部分长日照繁殖型和短日照繁殖型3。影响这一现象的因素众多，主要有遗传因素、环境因素和内分泌因素。鹅肉富含蛋白质、维生素、矿物质等，是良好的健康食品。目前，鹅产业的发展一直落后于其他家禽业，主要原因是鹅卵泡发育具有严格的等级性和选择性，与其他家禽有所不同4。其次，鹅在生长周期、繁殖等相对于其他家禽较缓慢，同时相关研究项也比其他家禽较少。近年来，随着 RNA 测序技术的发展和测序成本的逐年降低，利用 RNA-seq 获得大量未测基因组物种的转录组数据，会极大地加速相应功能的研究5。因此，近年来将转录组测序技术应用到鹅产业中，探讨基因与鹅生命现象的规律，进而推动鹅产业的发展。1转录组简介转录组学是研究基因功能及结构的基础，是解读基因组中功能元件和揭示组织、细胞中分子组成的有效手段，同时在了解机体生长发育和疾病机制研究中也有重要作用。起初以基于杂交技术的基因转 录 组 测 序 技 术 在 鹅 产 业 相 关 研 究 中 的 应 用周 迪1杨 蓉1李 俊1李建伟1赵忠海2任丽群1谭晓山1王 燕1王 府1谢玲玲1*1.贵州省种畜禽种质测定中心（贵州贵阳 550000）2.贵州省遵义市畜牧渔业站（563000）中图分类号：S818.9文献标识码：B文章编号：1002-2996(2022)12-0055-07Application of Transcriptome Sequencing Technology inRelated Research on Goose IndustryZHOU Di1，YANG Rong1，LI Jun1，LI Jian-wei1，ZHAO Zhong-hai2，REN Li-qun1，TAN Xiao-shan1，WANG Yan1，WANG Fu1，XIE Ling-ling1*（1.Guizhou Testing Center for Livestock and Poultry Germplasm，Guiyang，Guizhou 55000，China；2.Animal Husbandry and Fishery Industry Office of Zunyi City，Zunyi，Guizhou 563000，China）Abstract：Goose is an important economy of animals and belongs to seasonal breeding animals.It has high protein content and low fatcontent.Listed as one of the key development of green of healthy food.With the development of transcriptome sequencing technology，theapplication of transcriptomics to analyze the molecular regulation mechanism of goose reproductive performance，meat quality and growthtraits，host-pathogen relationship，skin hair follicles，etc.Become a hot research topic in recent years.Analyze its molecular regulationmechanism，and then carry out breeding work on geese to promote the development of the geese industry.This paper mainly reviews theresearch related to goose in recent years，aiming at providing reference materials for follow-up research.Key words：Goose；Transcriptome；Differential gene；Gonadal axis；Goose parvovirus兽医科技552022年12月芯片和以标签序列为基础的方法对转录组进行研究。随着高通量测序技术的发展与市场化，RNA-Seq（RNA Sequencing）技术的推广应用极大地促进了转录组学研究的发展6。如孙永峰等通过转录组测序发现，在籽鹅卵泡发育过程中，ERK 信号通路中生长因子受体结合蛋白 GRB2 和 SOS 在等级前卵泡中均有表达7。GRB2 在小白卵泡中表达量最低，在初级卵泡中表达量最高；S0S 在大白卵泡和中白卵泡中的表达量最低，在初级卵泡中的表达量最高。杨辉等利用同样的测序手段发现，在鹅卵泡的发育过程中，脑源性神经营养因子（BDNF）和受体酪氨酸蛋白激酶受体基因 B（TkB）的表达呈现先增加后降低的趋势，在小白卵泡中显著高表达，在中白卵泡中显著低表达，表明 BDNF 及其受体 TrkB 对卵泡的发育具有促进作用8。2019 年初，美国国家科学院、工程院和医学院联合发布了题为“Science Breakthroughs to Ad-vance Food and Agricultural Research by 2030”的研究报告，描述了美国科学家眼中农业领域亟待突破的五大研究方向9。其中一个方向就是鼓励并采用具有突破性的基因组学和精准育种技术。随着基因编辑技术的出现，有针对性地对鹅繁殖、肉质、生长、免疫、皮肤毛囊等相关基因进行编辑，或许能以传统方法无法实现的方式对鹅进行改良。通过将基因组信息、先进育种技术和精确育种方法纳入提高鹅的常规育种和选择计划，可以精确、快速地改善鹅群生长繁育性能。2在鹅性腺轴中的应用2.1在垂体下丘脑水平的研究进展繁殖性能一般是体内多种激素共同作用的结果，下丘脑-垂体-卵巢轴是调节和分泌激素的主要器官，也是调控动物繁殖的主要器官。而激素又可反作用于下丘脑-垂体-卵巢轴，进而调节类固醇生成及卵巢的功能。近年来，众多学者利用 RNA-seq测序技术对鹅的性腺轴进行转录组学分析，期望发现与鹅繁殖相关的候选基因，解析下丘脑-垂体-卵巢轴-基因之间的分子调控机制。如 Gao 等利用四川白鹅预产期和产蛋期下丘脑的转录组分析，发现 48 个转录本在预产期上调，180 个转录本在产蛋期上调；一些转录本主要与疾病、癌症、信号分子和相互作用、神经系统、免疫系统有关10。Pirkowska等利用垂体-下丘脑转录组测序分析，发现 PRL、FOS 和 GH 基因差异表达，参与调节摄食行为、免疫调节、刺激细胞增殖和控制生长激素合成11。Wu 等利用高产蛋量和低产蛋量的新疆伊犁鹅的下丘脑、垂体腺转录组分析，分别鉴定出 135 和 56 个差异基因，主要富集在 ECM-受体相互作用、钙信号等通路中，在新疆伊犁鹅产蛋量发挥重要作用12。Zhao 等对浙东白鹅垂体转录组的季节性差异分析，在春夏秋冬分别鉴定出 704、3503、1139、33 个差异基因，其中 POU1F1、Pitx2、NR5A1、NR4A2、SREBF2、Clock、Per2、ARNTL2、Eya3、Dio2 和 NPAS2 基因的表达水平也随季节的变化而变化，表明这些基因对调节鹅的季节性繁殖13。由于下丘脑-垂体-性腺轴是一个协调的神经内分泌系统，其中下丘脑是内分泌系统的协调中心，垂体是释放大多数调节内分泌系统的激素，从而控制性腺发育和性激素，影响动物繁殖性状14，15。因此，目前解析鹅繁殖性状的候选基因，多从下丘脑-垂体-性腺轴进行研究，能够更深地挖掘鹅繁殖相关的候选基因。吴盈等在高、低产蛋量新疆伊犁鹅性腺轴（下丘脑-垂体-卵巢）组织中共筛选到3119 个新基因，差异表达新基因 64 个，其中 49 个差异新基因表达上调，15 差异新基因表达下调，主要富集在核苷酸切除修复、VEGF 信号通路、泛素介导的蛋白水解、RNA 转运、氨基酸的生物合成以及粘着斑等信号通路中16。Tang 等利用生殖器发育过程中下丘脑-垂体-性腺轴转录组分析，在下丘脑、垂体、睾丸和外生殖器中鉴定出 107、284、2192 和 1005 个差异表达基因，主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞周期、卵母细胞减数分裂和嘌呤代谢、WNT信号等通路中，从而控制雄鹅外生殖器发育17。Liu 等研究表明，在天府肉鹅的下丘脑、垂体中，有19、110 个基因在产蛋和筑巢期间有差异表达，并发现催产素-神经素（OXT）、chordin 类蛋白 1（CHRDL1）和生长激素（GH）在垂体中差异表达，表明它们可能是与鹅繁殖性能相关的新候选基因18。兽医科技562022年12月2.2在卵巢水平的研究进展鹅的繁殖性状主要表现为产蛋量，然而卵巢的生理变化影响鹅的产蛋量，其生理变化主要表现卵巢的功能、激素含量等的变化。目前，科学家利用转录组测序技术对鹅卵巢进行测序分析，希望解析卵巢的生理变化对鹅产蛋量的影响。如尹玲倩对鹅产蛋期和休产期的卵巢转录组分析，鉴定出差异表达的mRNA 90 个、80 个新的 lncRNA、21 个 circRNA 和 50 个miRNA，主要富集在雌性配子形成、卵巢发育、类固醇激素的合成、细胞周期等通路中，筛选出与鹅繁殖相关的 TPD52、ANAX2 和 RPS2 候选基因，以及 miR-205b、miR-101-3p 和 miR-365b-5p 等重要的 miRNA，均在调控季节性繁殖的鹅卵巢功能中可能发挥着重要的作用19。Qin 等利用 RNA-seq 对溆浦鹅卵巢在不同阶段的转录组变化进行分析，鉴定出共 258 个差异表达基因，主要富集在炎症、繁殖、细胞粘附、细胞骨架的形成等通路中，发现 MRP126、TXNIP、FZD2基因对鹅产卵、卵巢的生长发育具有重要影响20。Hu 等研究发现，SF1、NR5A2、ESRR、NF1、THR、GATA、SMAD 和 LHX 基因在整个鹅卵巢早期发育过程中均有表达，富集在 FoxO 信号通、脂质代谢、卵泡形成和发育、Wnt 等信号通路中21。Xu 等为识别鹅的育雏与产蛋性能，以卵巢进行转录组分析，鉴定出 355 个差异表达基因，参与了类固醇激素的合成、Wnt 信号通路、钙信号通路、GnRH 信号通路和卵母细胞减数分裂等过程，并发现多巴胺-羟化酶、腺苷酸环化酶相关蛋白 2 基因与鹅卵泡发育和繁殖性能密切相关22。Luan 等对鹅产蛋期和停产期卵巢转录组研究，发现 344 个上调基因和 344 个下调基因，ADCY7、ADCY2、PRKX、PRKCB、PGR、LHCGR 基因富集在类固醇激素生物合成，GnRH 信号通路，卵母细胞减数分裂，孕酮介导的卵母细胞成熟，类固醇生物合成，钙信号通路，G 蛋白偶联受体等信号通路中23。前人通过转录组测序技术筛选出了一些与卵巢发育、激素合成、卵母细胞生长和发育等相关的候选基因，表明转录组测序技术对研究鹅繁殖性能相关的候选基因具有一定的推动作用。2.3在卵泡水平的研究进展卵泡经过一段时间的成长，最终形成蛋，而卵泡发育是一个复杂的生物过程。家禽卵泡的生长、发育与成熟直接影响其产蛋率。因此，卵泡的质量直接影响家禽的繁殖性状。而卵泡的质量又受多因素控制，但主要由激素、基因的调控所决定。Yu 等对浙东白鹅的卵泡转录组分析，发现有 92 个上调和 84 个下调的转录因子以及 101 个上调和 51 个下调的激素相关基因，这些差异基因参与了激素反应、卵泡发育等过程，使卵泡中孕酮和雌二醇的含量发生改变24。Lei 等利用转录组分析揭示马岗鹅卵泡发育的基因表达谱，发现 374、1117、791 和 593 个基因分别在大白卵泡（直径6 mm）到小黄卵泡（直径 68 mm）、小黄卵泡（直径 68 mm）到大黄囊卵泡（直径 1012 mm）、大黄囊卵泡（直径 1012 mm）到直径 34 cm 卵泡、直径 34 cm 卵泡到成熟卵泡阶段差异表达，参与了生物调控、发育过程、代谢过程、刺激反应等过程。检测发现，FN1、MMP2、MMP9、ADAMTS1 和PLAU 对卵泡发育，排卵和类固醇合成具有重要影响25。Hu 等对鸭和鹅早期卵泡（原始、初级和次级卵泡）发育过程中的组织形态学和基因表达谱分析，发现在孵化后的早期发育过程中，鸭子的卵巢卵泡比鹅的生长速度更快。在发育过程中，FSHR、AMH 和CASPASE3 基因被认为是诱导鸭子卵泡更快生长的机制之一26。张克山等通过转录组测序分析，共筛选到 267 个差异表达基因（119 个下调，148 个上调），这些差异基因主要富集在生物节律过程、繁殖进程等生物学过程中。经验证发现差异基因 AMH 的表达显著下调，而 NPFFR1 基因可从激素、细胞凋亡和生物节律等多个环节影响卵泡颗粒细胞，参与调控卵泡的时序等级发育27。在非编码 RNA 方面，Li等对鹅的卵泡进行 mRNA 和 miRNA 转录组分析，在颗粒层中共鉴定出 2782 个差异表达的 mRNA 和 117 个差异表达的 miRNA，并且发现随着卵泡的发育 FSHR、CYP11A1、STAR、3-HSD 和 AMH 基因的表达水平显著上调或下调，表明它们对卵泡的发育具有重要的影响28。有研究表明，miRNA 可通过靶标基因对卵泡进行调控作用，如 MiR-181a-5p 通过靶向 SIRT1 抑制鹅颗粒细胞活力，进而影响卵泡发生、卵泡发育和闭锁29。此外，在颗粒细胞自噬的研究中，自噬正调节因子 miR-7、miR-29、miR-100、miR-181 以及自噬负兽医科技572022年12月调节因子 miR-34b、miR-34c 也对鹅卵泡发育、激素合成、卵泡内环境和颗粒细胞自噬有重要影响，并可能影响鹅的产蛋量30。3在鹅细小病毒中的应用鹅细小病毒病（GPV，又被称为小鹅瘟）是一种由细小病毒引起的传染病，具有传染性强、发病率和死亡率高等特点，会给养殖者带来重大的经济损失，危害养殖业的发展。因此，确定该病的宿主与病原体相互作用，解析该病的致病因素及免疫应答机制，对于健康养鹅来说具有重要的意义。有研究表明，鹅细小病毒既可感染鹅，又可感染番鸭，对雏鹅有高度的致病性，尤其 10 日龄以内雏鹅感染后，发病率和死亡率在 90%以上，甚至可达 100%。康复鹅生长缓慢，产蛋种鹅感染后产蛋率明显下降31。目前，科研工作者也加快对鹅细小病毒的研究，致力寻找快速检测鹅细小病毒的方法，已建立了 TaqMan 荧光定量PCR 方法并应用到临床中，其准确、稳定、灵敏和特异可以用于鹅细小病毒临床定性与定量检测，检出率比普通 PCR 高 10%32。曹旭阳等应用 TaqMan 荧光定量 PCR 方法对鹅细小病毒进行检测，其检出率为78%，而普通 PCR 方法为 50%，表明荧光定量 PCR 方法的敏感性明显高于普通常规 PCR 方法33。有了更准确、更稳定、更灵敏的检测方法，能够让养鹅业准确地切断感染源，提前做出防控措施，但还需从根本上解决。肖世峰等通过研究鹅细小病毒 VP2 病毒样颗粒，制备了病毒样颗粒油佐剂疫苗，给感染鹅细小病毒 130 日龄的番鸭胸部肌肉注射，免疫后抗体效价逐渐升高，表明番鸭源鹅细小病毒蛋白形成的病毒样颗粒具有良好免疫原性34。Gough 等研究表明，细小病毒疫苗对小鹅无致病性，并在长达 20 周内显著刺激病毒中和抗体水平，在易感雏鹅中具有良好的免疫反应35。在分子研究方面，Yan 等研究表明，鹅细小病毒感染后以及 NS1 蛋白显著促进鹅胚胎成纤维（GEF）细胞细胞凋亡，并且成纤维细胞的凋亡伴随着细胞中病毒载量的增加；同时，组织蛋白酶 D 活性也增加，表明 AIF 介导的通路是一种新的线粒体凋亡通路；线粒体去极化、活性氧含量和组织蛋白酶D 活性是影响 GEF 细胞凋亡的关键因素36。Li 等通过 7 种新型鹅细小病毒（NGPV）全基因组测序和 NGPV基因组的综合分析，7 个 NGPV 分离株中发现了 5 个核苷酸突变，在 6 个 NGPV 分离株中发现了 2 个 14 核苷酸缺失在反向末端重复序列中，在 NGPV 的复制蛋白和衣壳蛋白中分别发现了 12 个和 8 个同步氨基酸变化，这对病毒基因调控、体液免疫反应和宿主转移具有重要意义37。在转录组测序方面，Chen 等通过 GPV 感染鹅脾脏转录组分析，鉴定出 2604 个差异表达基因，主要富集在抗原加工、免疫、NF-B 通路和JAK-STAT 等信号通路中，发现免疫相关基因 TLR7、TRAF3、Mx、TRIM25、CD4、CD8 的 高 表 达 显 著 增 加GPV 的含量38。王璐瑶对感染 NGPV SD 株的肝、胸腺和回肠进行转录组分析，均检测出多个差异表达基因。这些差异基因主要参与免疫效应过程、淋巴细胞介导的免疫等多个免疫相关生物学过程，富集在 JAK-STAT、NF-B、PI3K-Akt 等信号通路中，表明NGPV 感染激活了机体免疫反应和宿主细胞的相关抗病毒信号通路39。应用转录组测序技术对鹅细小病毒相关的研究目前鲜见报道；因此，对于鹅细小病毒的分子调控有待深入研究。4其他方面的应用为推动鹅产业的发展，转录组测序在鹅的育种也进行相关研究，如张蕾等对开产前后泰州鹅肝脏组织 RNA-Seq 分析表明，筛选出 202 个差异基因，其中上调差异表达基因 100 个，下调差异表达基因102 个，泰州鹅开产前后肝脏组织中的差异基因多集中于脂质代谢以及生殖过程40。章杰等对不同体重鹅肝脏转录组的功能分析，发现 435 个差异表达基因，主要富集于细胞凋亡、蛋白重折叠、营养反应、细胞增长、氨基酸转运等过程中，初步确定 ACSL1、NDRG1、CAT、SORD、PSPH、RPL13 等为肝调节营养物质吸收转化影响鹅体重的分子机制41。Xu 等研究 m6A在鹅胸肌发育中的作用，鉴定出 228 个差异表达的miRNA，397 个 mRNA 中发现了 26 个肌肉相关基因，均对鹅胚胎骨骼肌发育具有重要的影响42。Deng 等研究发现 592 个基因和 952 个基因分别在结节皮肤和骨中差异表达，在神经活性配体-受体相互作用、代谢通路、ECM-受体相互作用、钙信号通路、细胞因兽医科技582022年12月子-细胞因子受体相互作用中显著富集，其中 DIO2基因影响鹅骨骼肌发育，也是鹅瘤表型相关的关键基因43。在毛囊、皮肤方面，Hu 等对鹅皮肤中毛囊转录组分析，鉴定出 409 个差异表达基因，发现 FZD1、LEF1、DKK1 基因在毛囊间皮肤和毛囊原基中均有表达，在羽毛原基中表达最高，表明 DKK1、FZD1 和 LEF1是在鹅皮初级毛囊诱导中发挥作用的重要调节因子44。Liu 等运用 RNA 测序在鹅胚胎第 13、18 和 28 天3 个阶段的胚胎背侧皮肤中寻找羽毛毛囊的转录组谱，分别鉴定出 3001、6634 和 13780 个基因，发现IL6R、IL-1R1、WNT3A、IGFBP3、BMP7、SFRP2 基因在皮肤和羽毛毛囊发育和生长过程中发挥重要作用45。Sello 等研究发现，在鹅胚胎皮肤羽毛毛囊共有14227 个基因家族，共鉴定出 20715 个特定基因家族，其中 Anser asnser 在钙信号通路中显著富集，而Anser cygnoides 显著富含甘油脂代谢46。王惠影对鹅羽绒再生分子机制进行研究，共筛选到 2023 个差异表达基因，其中上调基因总数为 1184 个，下调基因总数为 839 个，主要富集在 MAPK、Wnt、TGF-be-ta/BMP、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等通路中，经验证，VDR 为绒再生过程中重要的调控基因，与鹅羽绒的毛重、绒重、羽枝长度和胸部羽枝细度等显著相关，而 DKK2、SHH、AHCY、MATIA 基因对鹅绒毛的调控也具有重要作用，可作为鹅绒毛再生过程的候选基因47。5展望关于鹅的相关研究已经持续多年。近年来，随着转录组测序技术的发展，利用转录组测序技术解析我国地方鹅的相关研究逐渐深入，转录组测序在鹅的繁殖性能方面的研究较多，但在鹅细小病毒、肉质/生长性能、鹅毛等领域鲜见文献报道，需更深入研究。另外一方面，目前，在其他动物中已发现了非编码 RNA 参与动物体生物现象的调控，而在鹅产业中也鲜见文献报道；因此，这也是一个研究切入点，通过 mRNA 与非编码 RNA 的网络调控机制，更能解析鹅遗传相关问题，进而改善传统的育种方式，提高鹅产业的经济效益，促进鹅产业链的发展。参考文献1Pingel H，Germany L.Waterfowl production for food securi-tyJ.Lohmann Information，2011，46（2）：32-42.2刘向萍，王晓峰.家禽事业发展的里程碑记 中国家禽遗传资源志 第三次审稿会J.中国家禽，2010（2）：69-73.3周丽媛，袁琪，龙江松，等.鹅繁殖特性及其影响因素研究进展J.中国畜牧杂志，2020，56（10）：1-6.4吴慧英，贾汝敏，刘铀，等.鹅繁殖就巢机理研究进展J.中国草食动物，2009，29（10）：56-58.5Xu Y，Shan G，Yang Y，et al.Transcriptome sequencing andwhole genome expression profiling of chrysanthemum un-der dehydration stressJ.Bmc Genomics，2013，14（1）：662-662.6王坤，刘丽仙，谷大海，等.RNA-seq 在家禽中的应用研究进展J.中国家禽，2017，39（15）：50-56.7孙永峰，李书哲，王子遒，等.利用转录组测序分析 GRB2 和 SOS基因在籽鹅等级前卵泡中的 mRNA 表达J.中国家禽，2017，39（9）：5-10.8杨辉，王子遒，路洪涛，等.利用转录组分析鹅等级前卵泡中脑源性神经营养因子及其受体基因的差异表达J.吉林农业大学学报，2018，40（1）：115-119.9NATIONAL ACADEMIES OF SCIENCES E，MEDICINE.Science bre-akthroughs to advance food and agricultural re-search by2030M.WashingtonD.C.：Nationalacade-miespress，2019.10 Gao G，Li Q，Zhao X，et al.Transcriptome profiling of thehypothalamus during prelaying and laying periods inSichuan white geese（A nser 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