新疆阿克苏地区手工酸乳中发...菌株的筛选及其发酵性能研究_张可铭.pdf

张可铭，段晓艳，胡露，等.新疆阿克苏地区手工酸乳中发酵菌株的筛选及其发酵性能研究 J.食品工业科技，2023，44（14）：121129.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080172ZHANG Keming,DUAN Xiaoyan,HU Lu,et al.Screening of Fermented Strains in Handmade Yogurt in Aksu Region of Xinjiang andIts Fermentation PerformanceJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):121129.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080172 生物工程 新疆阿克苏地区手工酸乳中发酵菌株的筛选及其发酵性能研究新疆阿克苏地区手工酸乳中发酵菌株的筛选及其发酵性能研究张可铭，段晓艳+，胡露，袁乐，杜林海，倪永清*，李谞*（石河子大学食品学院，新疆石河子 832000）摘要：具有良好发酵性能的乳酸菌菌株是制备发酵剂的关键因素，而发酵剂是发酵乳品质的决定因素之一，因此，筛选优良发酵性能的菌株对于制备发酵剂至关重要。本研究从新疆阿克苏的三份手工酸奶样品中分离出四株经传代接种后，仍能明显凝乳且性能稳定的菌株，经 16S rRNA 基因测序结合形态生理鉴定为 2 株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）q8-1 与 q28-2，1 株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）R22-2 和 1 株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）q4-1。对分离出的这四株菌与实验室前期筛选出具有凝乳稳定性的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）K5-2，保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）7-1，嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）A-2 在乳品中单菌的生长能力、产酸性能、后酸化性能、贮藏过程中的活菌数、感官评定、质构性能以及产香能力进行测定。结果表明，Lactobacillus bulgaricus 7-1 发酵性能最佳，其凝乳时间与达到发酵终点时间分别为 8 与 9.5 h，具有高产酸能力与弱的后酸化能力，后熟 1 d 酸度达 97.6 T，在 4 贮藏 20 d 后，酸度变化幅度20 T，活菌数维持在 1106 CFU/mL 之上；单菌发酵乳的组织状态良好、风味较佳，质构特性良好，硬度、黏稠度、内聚性、黏度指数分别为（60.260.11）g，（1209.370.62）gs，（11.810.04）g，（5.370.04）gs；产香能力突出，后熟 1 d 后其单菌发酵乳中乙醛和双乙酰含量分别为 14.48、1.23 mg/L；Streptococcus thermophilusA-2、Pediococcus pentosaceus K5-2 发酵性能较好，满足发酵剂的基本要求。综合研究结果表明 Lactobacillusbulgaricus 7-1、Streptococcus thermophilus A-2、Pediococcus pentosaceus K5-2 展现出良好的酸乳发酵能力，是具备作为制作酸奶发酵剂的优良菌株。关键词：乳酸菌，酸乳，筛选，发酵特性，产酸能力，质构本文网刊:中图分类号：TS252.1 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14012109DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022080172ScreeningofFermentedStrainsinHandmadeYogurtinAksuRegionofXinjiangandItsFermentationPerformanceZHANGKeming，DUANXiaoyan+，HULu，YUANLe，DULinhai，NIYongqing*，LIXu*（College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China）Abstract：The Lactobacillus strains with excellent fermentation performance play a crucial role in the preparation of startercultures,which has a significant impact on the quality of fermented dairy products.Therefore,to select the Lactobacillusstrains with high fermentation performance is essential for the preparation of starter cultures.In this study,fourLactobacillus strains with high stability of milk-clotting after the 10th passage were derived from three samples of Aksuhandmade yogurt(a sort of Xinjiang specialty).By means of 16S rRNA sequencing and morphophysiological identification,收稿日期：20220818 +并列第一作者基金项目：国家大学生创新创业计划训练项目（202110759048），石河子大学创新发展专项（CXFZ202109）。作者简介：张可铭（2001），男，本科，研究方向：食品微生物学，E-mail：。段晓艳（2001），女，本科，研究方向：食品微生物学，E-mail：。*通信作者：倪永清（1969），男，博士，教授，研究方向：食品微生物学，E-mail：。李谞（1988），男，博士，副教授，研究方向：食品微生物学，E-mail：。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 q8-1 and q28-2 were identified as Lactobacillus casei,R22-2 was identified as Lactobacillus paracasei,and q4-1 wasidentified as Pediococcus acidilactici.Meanwhile,some other bacteria with the stability of milk-clotting that had beenpreviously selected in the lab including K5-2 (Pediococcus pentosaceus),7-1 (Lactobacillus bulgaricus)and A-2(Streptococcus thermophilus)were juxtaposed with these four Lactobacillus strains for performance assessment.In thisassessment,a measurement was performed to determine their single-strain growth ability,acid production performance,post-acidification performance,viable cell count(VCC)during storage in diary products,sensory analysis results,textureproperties and aroma-producing ability.Results showed that,the Lactobacillus bulgaricus 7-1 had the best fermentationperformance with coagulation time and fermentation end times of 8 and 9.5 hours,respectively.It had a high acid yield buta weak capacity for post-acidification.After 1 day of post-ripening,the acidity was 97.6 T.After 20 days of storage at4,the acidity did not vary by more than 20 T,and the number of viable bacteria remained above 1106 CFU/mL.Goodtexture characterized the fermented milk.The firmness,consistency,cohesiveness and index of viscosity were(60.260.11)g,(1209.370.62)gs,(11.810.04)g,(5.370.04)gs,respectively.In the fermented milk,the concentrations ofacetaldehyde and diacetyl were 14.48 and 1.23 mg/L,respectively.Good fermentation performance was demonstrated byStreptococcus thermophilus A-2,and Pediococcus pentosaceus K5-2,which also met the fundamental parameters of starterculture.Results showed that Lactobacillus bulgaricus 7-1,Streptococcus thermophilus A-2,and Pediococcus pentosaceusK5-2 had good yoghurt fermentation abilities and could be employed as yoghurt starter cultures.Keywords：lactic acid bacteria；yogurt；screening；fermentation characteristics；acid-producing capacity；texture 乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类发酵糖类生成产物为乳酸的耐酸、无芽孢的杆状或者球状革兰氏阳性细菌1。数千年来在自然选择与进化作用下，不同地理环境等因素造就了乳酸菌的多样性24。世界各地均具有地域特色的手工发酵食品，意大利传统奶酪中乳酸菌菌株以 Lactobacillusplantarum、Lactobacillus paracasei 为主5；青藏高原 5 个生态区的传统发酵牦牛奶中，乳酸菌菌株以Lactobacillus delbrueckii、Streptococcus salivarius和 Stretpococcus thermophilus 为主6；新疆地区西南部的传统酸牛乳中分离纯化的乳酸菌菌株以 Ente-rococcus faecium 为主7；内蒙古自治区传统发酵乳制品嚼克中分离纯化的乳酸菌菌种以 Lactococcuslactis 为主8。目前世界上许多科研机构成立了微生物菌种库，大型乳制品和发酵剂企业也通过收集区域性的乳酸菌资源，开发了优势乳酸菌和发酵剂，如Lactobacillus rhamnosus GG（LGG），Lactobacilluscasei strain Shirota（LcS）9，是知名度较高的益生菌品牌。我国新疆聚居着众多的少数民族，依赖于其独特的地理、环境、气候条件，畜牧养殖业多样、丰富的原奶为牧民手工加工各种乳制品提供了充足的原料，孕育了多样的乳酸菌资源，是筛选优良菌种的宝贵资源库。特别是新疆地区生活着世代游牧的民族群体，保留着自制酸乳的习惯，手工酸乳具有鲜明的地域特色和独特的风味10，通常采用简单消毒后的牛奶加入天然发酵剂（保留的酸乳）在适当温度下发酵1012 h 制作而成11。由于自然发酵的酸乳其质量与安全难以控制，从酸乳中筛选出性状优良的乳酸菌发酵剂对新疆地区乳品行业的发展很有必要。乳酸菌发酵牛奶生产酸乳的过程中发生了许多变化，如酸度降低，质构特性升高，代谢物的产生等1213，对反映这些变化的指标进行测定，是筛选良好发酵性能的乳酸菌的关键。因此本研究从新疆阿克苏地区采集手工乳制品，分离野生乳酸菌菌株，测定其在乳品中单菌的生长能力、产酸性能、感官评定、后酸化性能、贮藏过程中的活菌数、质构性能以及产香能力，从而研究乳酸菌的发酵性能，为开发优良的酸乳发酵剂菌株奠定基础。1材料与方法 1.1材料与仪器三份手工酸奶制品采自新疆阿克苏；3 株菌株：戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）K5-2、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）7-1、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）A-2自新疆阿克苏地区手工酸奶制品分离出；伊利脱脂乳粉蛋白质含量 50%市售；无水乙醇（AR）天津市致远化学试剂厂；琼脂糖（AR）美国 BBI 公司；氢氧化钠（AR）天津市福晨化学试剂厂；琼脂（AR）鹏程生物技术有限公司；甘油（AR）天津市化学试剂三厂；10TaqE Buffer（BR）TAKARA 公司；其余试剂均为国产分析纯；MRS 培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉浸粉 10.0 g，酵母提取物 5 g，柠檬酸二铵 2.0 g，乙酸钠 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，K2HPO4 2.0 g；MgSO47H2O0.58 g，MnSO44H2O 0.25 g，吐温 80 1000 L，每1 L；M17 培养基：大豆蛋白胨 5 g、蛋白胨 2.5 g、酪蛋白胨 2.5 g、酵母提取物 2.5 g、牛肉浸粉 5 g、乳糖 5 g、抗坏血酸钠 0.5 g、-甘油磷酸钠 19 g、硫酸镁 0.25 g，每 1 L天津市光复精细化工研究所，北京奥博星生物技术有限责任公司，天津市巴斯夫化学试剂厂。BS224S 型万分之一天平美国 Mettler Toledo公司；Fresco 21 型高速冷冻离心机Thermo 公司；LAC-5040S 型全自动高压灭菌锅韩国 LabTech公司；BC d-265F 型冷藏冷冻箱荣事达集团；Labcycler PCR 扩增仪（德国）圣欧/SensoQuest 公 122 食品工业科技2023 年 7 月司；Power Pac Universal 水平电泳仪、Gel dOC XR凝胶成像系统、SUBCELL GT（20 cm25 cm）电泳槽美国 BioRad 公司；85-2 型精密磁力搅拌器金坛市恒丰仪器厂；dG520 型厌氧培养箱英国dWS 公司；B250 型智能数显恒温油水浴锅上海予卓仪器有限公司；SPX 智能生化培养箱宁波市江南仪器厂；TA.XTPlus 质构仪英国 SMS 公司；LAB DANCER S25 型旋涡振荡器IKA 公司；CX21 型光学显微镜Olympus 公司；MiniBea dbea-ter-16 16 珠磨式组织研磨器美国 Biospec 公司；UVmini-1240 型紫外分光光度计日本岛津公司。1.2实验方法 1.2.1 乳酸菌的分离纯化MRS 培养基常用于乳酸杆菌的分离，M17 培养基可用于乳球菌的分离14。使用无菌生理盐水对样品进行梯度稀释，吸取 105、106、107稀释液 100 L，用涂布棒在 MRS 琼脂平板、M17 琼脂平板进行涂布，在 37 恒温厌氧环境中培养 48 h。在每个平板上挑取不同菌落形态的菌落进行 3 次转接划线后，进行革兰氏染色以及镜检，从而使乳酸菌初步分离纯化，将得到的纯菌株进行凝乳遗传稳定性实验，测定方法参考崔琴15，活化菌株后，将乳酸菌接种至灭菌脱脂乳中，观察凝乳色泽，组织状态，乳清析出情况等，筛选凝乳状态稳定和传代培养后性能稳定的菌株。1.2.2 16S rRNA 基因的测序分析对菌株进行 16SrRNA 基因进行测序分析，确定菌株的种属。使用玻璃珠法提取 DNA，并使用通用扩增引物 27F（5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3）和 1492R（5-TAC CTT GTT ACG ACT T-3）对 DNA 进行基因扩增。扩增条件参考张亚川16的条件。对 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并送往苏州金唯智生物科技有限公司测序。在 NCBI 数据库中使用BLAST 分析所测基因序列的序列同源性，并使用MEGA v.7.0 建立乳酸菌系统发育树。1.2.3 发酵菌种的筛选测定分离出的四株乳酸菌与实验室前期从新疆阿克苏地区手工酸奶中筛选出具有凝乳稳定性的戊糖片球菌（Pediococcus pento-saceus）K5-2，保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgar-icus）7-1，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）A-2 的发酵性能。1.2.3.1 菌株生长规律将菌株按接种量 3%转接至 MRS 培养基中，并在 37 恒温箱中培养。32 h内每隔 2 h 取菌液测 OD600，并根据测得的 OD600值绘制生长曲线，观察菌株的生长规律。1.2.3.2 凝乳时间、发酵终点及酸度的测定活化菌株后，使用生理盐水洗涤并重新悬浮，按 3%的接种量转接至脱脂乳中，混合均匀后在 37 下恒温发酵，发现凝乳后立即记录各菌株的凝乳时间，待达到发酵终点（视 pH 达 4.5 为发酵终点）时记录时间，并在 4 下冷藏 1 d，取后熟 1 d 后的样品测定酸度，酸度测定方法参考 GB 5009.239-201617。取 10.0 g后熟 1 d 后发酵乳混匀样品，加入 20 mL 蒸馏水，混合均匀，加入 2 mL 0.5%的酚酞指示剂，用 0.1 mol/L的标准氢氧化钠溶液在 45 s 内滴定至粉红色，且30 s 颜色不消退，并记录实验消耗氢氧化钠的体积以及发酵乳的质量。计算公式如下：X1=C1(V1V0)100M10.1式中：X1表示试样的酸度，吉尔涅尔度（T）；C1表示氢氧化钠浓度，mol/L；V1表示滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0表示空白实验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为 mL；100 表示 100 g 试样；M1表示试样的质量，g；0.1 表示酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，mol/L。1.2.3.3 菌株产酸能力的测定将 2 株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）q8-1 与 q28-2，1 株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）R22-2 和 1 株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）q4-1，1 株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）K5-2，1 株保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）7-1，1 株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）A-2 活化后，使用生理盐水在 8000 r/min 条件下离心洗涤 5 min 并重悬，按 3%的接种量转接至脱脂乳中，37 发酵培养。每隔 2 h 取样，测定可滴定酸，测定方法见发酵酸度的测定，并绘制产酸曲线。1.2.3.4 冷藏期间发酵乳酸度的变化分别取凝乳后在 4 条件下冷藏保存 1、5、10、15、20 d 的发酵乳样品测定其可滴定酸，测定方法见 1.2.3.2 发酵酸度的测定，并绘制产酸曲线。1.2.3.5 冷藏期间发酵乳中活菌数的测定将在4 条件下冷藏保存 1、5、10、15、20 d 发酵乳样品分别系列梯度稀释，用平板计数法测其活菌数，并绘制活菌数随时间变化的曲线图。1.2.3.6 发酵乳的感官评价组织 10 名培训后的食品专业学生对单菌发酵乳样品的感官特性进行评定，感官评定标准及方法参考文献 1819，具体评价标准见表 1。1.2.3.7 发酵乳质构特性测定评价发酵乳质构特性的重要指标有硬度、粘稠度和内聚性20，可通过质构分析仪测定。制备好的样品在 4 条件下后熟24 h，使用质构仪测定酸乳样品的硬度、粘稠度、内聚性、粘度指数。测定条件：选用 A/BE 探头，压力盘直径：45 mm。设置参数：测试前速度 2.00 mm/s，测试中速度 1.00 mm/s，测试后速度 2.00 mm/s，测试深度 30.00 mm，感应力：Auto（Force）-2 g。1.2.3.8 菌株产香能力的测定取后熟 1 d 发酵乳测定乙醛和双乙酰的含量。测定方法参照万金敏21的方法进行测定。第 44 卷 第 14 期张可铭，等：新疆阿克苏地区手工酸乳中发酵菌株的筛选及其发酵性能研究 123 a.乙醛含量的测定：取适量样品与等体积的TCA（16%）混合均匀，在3500 r/min 条件下离心10 min，取上清液 25 mL 与 5 mL NaHSO3溶液（1%）混匀，在黑暗环境中放置 1 h，后加入 1 mL 淀粉溶液（1%），使用 0.1 mol/L 的碘液滴定至近无色，再使用0.01 mol/L 的碘液进行滴定，直至出现淡蓝色且 30 s不褪色。加 20 mL 1mol/L 的 NaHCO3溶液，振荡混匀后再用浓度为 0.01 mol/L的碘液进行滴定直到再次出现淡蓝色，记录消耗碘液的体积，同时做空白实验。乙醛含量计算公式如下：乙醛(g/mL)=(V1V2)C0.02225式中：V2表示空白对照滴定消耗 I2标准溶液的体积，mL；V1表示样品滴定消耗 I2标准溶液的体积，mL；C 表示 I2标准溶液的浓度，mL；25 表示称取乙醛样品的重量，mL；0.022 表示乙醛化学反应基本单位，g。b.双乙酰含量的测定：双乙酰标准曲线的绘制：取 15 L 双乙酰溶于无菌水中，定容至 500 mL。分别取双乙酰标准溶液 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL各加入 2 支试管中，使用无菌水补足至 10 mL。向不同浓度的 6 支试管中加的邻苯二胺溶液（1%）0.5 mL，另外 6 支试管不加邻苯二胺溶液，混匀后在黑暗环境中放置 30 min，加入 4.0 mol/L 浓盐酸进行终止反应（加入邻苯二胺的试管加 2.0 mL，不加入邻苯二胺的试管加 2.5 mL），混匀后以不加入邻苯二胺的试管为空白对照，使用紫外分光光度计于 335 nm波长下测定 OD 值。以双乙酰浓度为横坐标，OD 值为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线回归方程y=0.1095x+0.0614，R2=0.9997，计算双乙酰含量。双乙酰含量的测定：取适量样品与等体积的TCA（16%）混合均匀，在 3500 r/min 条件下离心10 min，取上清液 20 mL，等体积加入两个试管中，一管加入邻苯二胺溶液（1%）0.5 mL，另一管不加，震荡均匀后放置在黑暗环境中 30 min，加入 4.0 mol/L 的浓盐酸溶液终止反应（加入邻苯二胺的试管加2.0 mL，不加入邻苯二胺的试管加 2.5 mL），以不加入邻苯二胺的试管为空白对照，测定在波长 335 nm下的 OD 值。1.3数据处理每个指标平行测定三次以上，利用 Excel 2021和 Spss 26 软件对实验数据进行处理，结果表示为平均值标准偏差。使用 Origin 2021 绘制图表并对结果进行分析。在 NCBI 数据库中使用 BLAST 分析所测基因序列的序列同源性，并使用 MEGA v.7.0 建立乳酸菌系统发育树。2结果与分析 2.1乳酸菌的分离以 3 个酸奶样品为分离源，利用传统分离方法共分离出 53 株培养物，通过对菌落形态，镜检，革兰氏染色确定 29 株疑似菌株，其中具有凝乳遗传稳定性的菌株 4 株，4 株菌的表型特征、显微镜检图片以及凝乳状态的比较如图 1、表 2 和图 2 所示。ABCDEFGH图 1 筛选菌株的菌落形态和细胞显微结构特征Fig.1 Colony morphology and cell microstructurecharacteristics of screening strains注：A、B、C、D 分别为干酪乳杆菌 q8-1、干酪乳杆菌 q28-2、副干酪乳杆菌 R22-2、乳酸片球菌 q4-1 菌落图情况；E、F、G、H 分别为干酪乳杆菌 q8-1、干酪乳杆菌 q28-2、副干酪乳杆菌 R22-2、乳酸片球菌 q4-1 革兰氏染色显微镜镜检图像。表 2 菌落形态以及菌株形态特征Table 2 Colony morphology and morphological characteristicsof strains菌株编号菌落形态表面状态颜色菌株形态革兰氏染色q8-1圆形扁平粗糙白色杆状阳性q28-2圆形隆起光滑乳白色杆状阳性R22-2圆形隆起光滑乳白色杆状阳性q4-1圆形隆起粗糙乳白色球状阳性 2.2乳酸菌的鉴定16S rRNA 是原核生物中的一种 rRNA,可利用恒定区序列设计引物扩增 16S rRNA，再利用不同菌株间可变区序列不同进行区分22，由此建立系统发育树可确定微生物在进化中位置。在 NCBI 数据库中 表 1 感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards项目分值（分）标准色泽2.5色泽均匀，整体呈微黄色（1.72.5）色泽稍不均匀，整体颜色较浅或过深（0.91.6）色泽黯淡无光（00.8）组织状态2.5表面平整，质地光滑细腻且不分层，有少量乳清析出（1.72.5）表面较平整，质地不分层，有少量乳清析出（0.91.6）表面凹凸，质地松散，有大量乳清析出（00.8）气味2.5发酵乳特有气味（1.72.5）发酵乳特有气味较淡（0.91.6）有异味（00.8）滋味2.5发酵乳滋味明显（1.72.5）发酵乳滋味一般（0.91.6）无发酵乳滋味（00.8）口感2.5口感润滑，酸度适中（1.72.5）口感润滑，酸度过酸（0.91.6）口感粗糙，颗粒感明显（00.8）124 食品工业科技2023 年 7 月使用 BLAST 比对 4 株菌的 16S rRNA 基因序列，选取相似性较高的菌株序列构建系统发育树见图 3。由该图可知，q8-1、q28-2、R22-2、q4-1 分别与 Lacto-bacillus casei、Lactobacillus casei、Lactobacillus para-casei、Pediococcus acidilactici 亲缘关系最近。KF971891.1 Lactobacillus caseiq8-1MZ414224.1 Lacticaseibacillus caseiAJ558112.1 Lactobacillus caseiMN759454.1 Lactobacillus caseiq28-2MT545052.1 Lactobacillus paracaseiMT544967.1 Lactobacillus paracaseiR22-2q4-1 MT573013.1 Pediococcus acidilacticiMT573012.1 Pediococcus acidilactici10099 6598650.0100图 3 基于 16S rRNA 基因建立的筛选乳酸菌菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of screened lactic acid bacteria strainsbased on 16S rRNA gene 2.3发酵性能测定 2.3.1 菌株生长特性测定当 OD 值达到最大时为菌株的最佳收获期23。由图 4 可以看出，所有菌株培养 6 h 后均进入对数期，菌株 q28-2 在 16 h 最先进入稳定期，K5-2 与 R22-2 在 24 h 左右最后进入稳定期，最终菌株 7-1 与 A-2 OD600值在 1.2 左右，其余菌株 OD600值均大于 1.5，表明菌株生长状态良好，可推断得出菌株的最佳收获时间是 1624 h。2.3.2 凝乳时间、发酵终点及酸度的测定菌株凝乳时间和达到发酵终点的时间短，可作为发酵剂乳酸菌（SLAB）用于生产中，缩短生产时间；菌株凝乳时间和达到发酵终点的时间长，可考虑其对发酵乳制品风味的作用，作为非发酵剂乳酸菌（NSLAB）用于生产中24。由表 3 可以看出，除 q4-1 与 q28-2 外，其他菌株凝乳时间均在 812 h，展现出良好的凝乳能力。菌株 7-1 在 9.5 h 达到发酵终点，展示了良好的发酵产酸能力，菌株 q8-1、A-2、K5-2 达到发酵终点时间在 1114 h 之间，能力尚可，菌株 R22-2、q28-2、q4-1 达到发酵终点的时间均大于 15 h，时间过长，发酵凝乳能力较差。表 3 筛选菌株的凝乳时间、发酵终点及单菌发酵乳后熟1 d 的酸度结果Table 3 Coagulation time,fermentation endpoint of selectedstrains and acidity of single strain fermentedmilk ripening for 1 d菌株凝乳时间（h）发酵终点（h）酸度（T）q28-21617.573.2q8-11011.583.2R22-21215.554.2q4-1151960.2A-21013.572.67-189.597.6K5-291272.92 7 株菌制备的发酵乳 4 冷藏 24 h 后的酸度见表 3，它们均在 54110 T 之间，食品安全国家标准 发酵乳中规定发酵乳酸度应大于 70 T，虽然菌株 q4-1 和 R22-2 发酵的发酵乳酸度低于 70 T，但是发酵剂为多菌株复配，如果其对质构、风味等特性起积极作用，可与产酸能力强的菌株进行复配，从而弥补凝乳时间长、酸度低的弊端25。2.3.3 菌株产酸性能测定产酸能力高的菌株发酵时间短26，并且产酸的快慢对酸乳的风味、质构和质量有重要影响。由图 5 可以看出除菌株 R22-2 在第10 h 酸度才开始迅速增加以外，所有菌株在 6 h 前酸度增长缓慢，616 h 产酸速率增快，酸度迅速增长，16 h 后酸度增长趋于稳定。菌株 7-1 在 20 h 内酸度由 29.1 T 上升到 102.68 T，酸度增加 73.58 T，产 122334455图 2 筛选菌株的凝乳稳定性比较Fig.2 Comparison of curd stability of screening strains注：1：纯牛奶，2、3、4、5 分别为以干酪乳杆菌 q8-1、干酪乳杆菌 q28-2、副干酪乳杆菌 R22-2、乳酸片球菌 q4-1 单菌发酵的发酵乳。q28-2R22-2q8-1q4-1A-27-1K5-22.01.51.0OD600值0.50.00510时间(h)1525303520图 4 筛选菌株的生长曲线Fig.4 Growth curve of screening strains 120q28-2R22-2q8-1q4-1A-27-1K5-2100608040酸度(T)200246810时间(h)12 14 16 18 20图 5 筛选菌株发酵 20 h 乳酸菌的产酸比较Fig.5 Acid production comparison of lactic acid bacteriafermented for 20 hours of screening strains 第 44 卷 第 14 期张可铭，等：新疆阿克苏地区手工酸乳中发酵菌株的筛选及其发酵性能研究 125 酸最快；菌株 A-2、q8-1、q28-2、K5-2 次之，在 20 h内酸度分别增加了 62.9、62.5、60.2、60.02 T；菌株q4-1、R22-2 产酸速率较慢，在 20 h 内酸度仅分别增加 48.7、47.7 T，在生产中易造成产品污染，不利于节省成本，不适宜作为发酵剂乳酸菌投入使用。2.3.4 菌株的后酸化能力后酸化指发酵乳正常发酵结束后，乳酸菌利用残存的乳糖发酵产酸使发酵乳 pH 继续下降2728，导致发酵乳在贮藏过程中过酸从而使乳清析出，影响发酵乳的感官风味，从而降低消费者的感官喜好度，也会缩短产品的贮藏期29。由图 6 可以看出 7 株菌的酸度均呈上升趋势，菌株 7-1、q8-1、q28-2、K5-2、A-2 冷藏过程中酸度变化不大，冷藏过程中酸度变化20 T，后酸化能力较弱，可赋予酸乳冷藏过程中较好的稳定性；菌株 R22-2 酸度仅增加 8.8 T 但最终酸度低于 65 T，菌株 q4-1 酸度增加了 30.1 T，两者保藏过程中有大量乳清析出。1251201151101051009590酸度(T)8580757065605505时间(d)101520q28-2R22-2q8-1q4-1A-27-1K5-2图 6 筛选菌株的后酸化能力比较Fig.6 Comparison of post-acidification capacity of screeningstrains 2.3.5 冷藏期间单菌发酵乳活菌数变化据食品安全国家标准 发酵乳相关要求规定，发酵乳中的活菌数必须高于 1106 CFU/mL，并有研究表明发酵乳的活菌数高于 1106 CFU/mL 才有发挥益生功能30。因此菌株在酸乳保藏过程活性乳酸菌数也是选育发酵剂的一个重要依据。不同菌株制得的发酵乳在保藏过程中的活菌含量变化情况见图 7，后熟 1 d 时，所有菌株活菌数含量均高于 108 CFU/mL，在 15 d内，随时间的延长活菌数增加，表明菌株在贮藏前期仍具有较好的活力，仍能利用残存乳糖生长繁殖；第5 d 以后，随贮藏时间的延长，活菌数降低，与贮藏过程中酸度过高和低温抑制乳酸菌生长繁殖有关31。贾庆超等32发现，乳酸菌在贮藏早期数量增多，第 5 d后数量逐渐减少，与本实验结果一致。冷藏 20 d 后，7株乳酸菌所制得发酵乳最终活菌数在 1106 CFU/mL以上，符合相关指标要求。2.3.6 单菌发酵乳的感官评定感官评价是评价酸乳品质的重要指标之一，可反映消费者的喜好和酸乳的受欢迎情况33。由表 4 可知，7 株菌株制成的酸乳色泽较好，其色泽整体均匀且呈乳白或微黄色，其中菌株 7-1 色泽最佳；菌株 7-1，q8-1，q28-2，K5-2，A-2表面光滑平整，表面无凹凸不平和裂缝的状态出现，质地细腻并无乳清析出，菌株 q8-1，R22-2 乳清析出较多；7 株菌株均具有酸牛乳特有的气味且无异味，菌株 A-2 所制酸乳气味最佳；菌株 q28-2，7-1，A-2，K5-2 制成酸乳滋味明显，无苦涩味或其他异样滋味；在口感方面，菌株 R22-2 一般，有弱微的颗粒感。综合感官评定结果发现，菌株 7-1 感官评价总分最高，其余菌株感官评价总分均具有较好的质量品质。表 4 感官评定结果Table 4 Sensory assessment results菌株感官评价色泽组织状态气味滋味口感感官评价总分q28-22.231.901.972.131.9210.15q8-12.112.301.991.631.779.80R22-21.881.531.751.651.