长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究_周鹤林.pdf

第 48 卷第 2 期2023 年 2 月环境科学与管理ENVIONMENTAL SCIENCE AND MANAGEMENTVol.48 No.2Feb 2023收稿日期:2023 02 09基金项目:重庆市教委科学技术研究项目(KJQN201900715)作者简介:周鹤林(2000 )，男，硕士研究生在读，主要从事市政环境微生物方面研究工作。通信作者:黎琪文章编号:1674 6139(2023)02 0119 06长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究周鹤林1，黎琪1，寇德会2(1 重庆市发改委 环境水利工程重庆市工程实验室 重庆交通大学，重庆 400074;2 贵州省毕节市水务局，贵州 毕节 551700)摘要:为研究在人类活动和水流运动影响下的长江微生物群落结构稳定性，选取长江及嘉陵江在重庆城区的河段为研究对象，采用 16S rNA 高通量测序 QPC 技术进行分析。结果表明:研究河段的细菌总数为 5 22 1051 38 106copies/mL。长江和嘉陵江细菌群落在门水平上群落组分差异不大，但嘉陵江细菌群落多样性与丰富度较低。废水排放与流态变化对水质、细菌群落多样性指数、细菌总数均没有显著影响。但是污水厂排水对细菌群落结构有显著影响，引起 Sporichthyaceae 显著增加和 Burkholderiaceae 显著减少。研究河段细菌群落具有丰富的降解外源物质的功能基因，污水厂排水并未导致该类功能基因数量的变化。关键词:长江;嘉陵江;城市河流;细菌群落;功能基因中图分类号:X171文献标志码:ABacterial Community Stability of Yangtze iver inepresentative Urban each Under Influence of Multiple FactorsZhou Helin1，Li Qi1，Kou Dehui2(1 National Inland Waterway egulation Engineering esearch Center，Chongqing Jiaotong University，Chongqing 400074，China;2 Water Bureau of Bijie City，Bijie 551700，China)Abstract:In order to study the structural stability of the microbial community of the Yangtze iver under the influence of hu-man activities and water movement，the section of the Yangtze iver and Jialing iver in the urban area of Chongqing was selectedas the research object，and 16S rNA high throughput sequencing QPC technology was used for analysis The results showed thatthe total number of bacteria in the studied river section was 522 105 1 38 106copies/mL The bacterial communities of theYangtze iver and Jialing iver did not differ much in community composition at the phylum level，but the diversity and richness ofthe bacterial communities of the Jialing iver were low Wastewater discharge and flow pattern changes did not have significanteffects on water quality，bacterial community diversity index，and total bacterial total However，the drainage of sewage plants hada significant effect on the structure of bacterial communities，resulting in a significant increase in Sporichthyaceae and a significantdecrease in Burkholderiaceae The bacterial community in the river section was studied to have abundant functional genes for de-grading foreign substances，and the drainage of sewage plant did not lead to the change of the number of such functional genesKey words:Yangtze iver;Jialing iver;urban river;bacterial community;functional gene;pathogenicity前言细菌在水体中降解转化污染物，改善水体环境，同时水环境变化变化会对菌群的构成和多样性造成影响1。因此细菌群落组成常被用作监测和预测一911第 48 卷第 2 期2023 年 2 月周鹤林等长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究Vol.48 No.2Feb 2023个水生生态系统健康与否的标准。长江流域是中国重要的水资源2，沿岸污水的排入会引相关水质参数的变化，可能导致菌群的改变。水体自净作用中的物理净化、悬浮颗粒的吸附与河流水动力特性有关3，因此流态变化可能导致水质和菌群改变。此外，研究发现污水厂排水是河流致病菌的重要来源。对国内外多条河流的致病菌调查显示，污水厂排水增加了受纳水体中多种致病菌的丰度4。长江、嘉陵江两岸人口密集，排污量大，两江的菌群稳定性关系到该区域的水环境质量。目前对长江微生物群落的研究内容主要针对特定区域微生物群落的构成和分布特征，对于人类活动和水流运动的影响研究较少。研究于 2019 年 8 月下旬在长江和嘉陵江部分河段采样，基于 16S rNA 高通量测序和 QPC 技术，分析水体细菌群落特征及其与环境因子的关系，探究水流运动和污水厂排水影响下菌群的变化;借助 PICUSt 功能预测分析，研究细菌群落功能基因的构成，为评估长江水生态状况和合理规划人类活动提供科学理论依据。1材料与方法1 1研究区域样品采集与水质理化指标测定2019 年 8 月 22 日在重庆城区长江与嘉陵江汇合河段至鸡冠石污水厂下游共设置 11 个采样点，如图 1 所示。鸡冠石污水厂是重庆市最大、全国第五大污水厂，日处理能力为 80 万吨，污水处理量占重庆主城污水处理量的 55%。在每个采样点采集 2 L表层水体，其中 1 L 用于高通量测序，1 L 用于水质指标测定。采样现场记录水温和采样点坐标，同时，使用 ST300D 型便携式溶解氧仪检测溶解氧(DO)，PHB 4 型便携式 pH 计检测 pH。水样采集后冷藏运回实验室进一步处理分析。1 L 水样经孔径为0.22 m 的无菌微孔滤膜过滤，滤膜在 20下冷冻保存。总氮(TN)、总磷(TP)和化学需氧量(COD)按 水和废水监测分析方法(第四版)进行检测。采用 tecplot 软件对河段流场数据进行模拟得出各采样点流速。图 1采样点分布图(注:采样点在河道处位置示意图，S1S11 为采样点位置，代表污水厂位置。)1 2样本 DNA 提取、PC 扩增及高通量测序滤膜样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，采 用 FastDNASPINkitforsoil(MPBiomedicals，USA)试剂盒提取样本 DNA。DNA 完整性检测使用 1%琼脂糖凝胶电泳，DNA 浓度、纯度检测均采用 NanoDrop2000(ThermoFisherScientific，USA)。送检的样本经检验满足:有明显条带，且清晰完整，无降解;OD260/280 在 1 58 2.08 之间。采用细菌通用引物 338F 806 对 16SrNA 基因的 V3 V4 区进行 PC 扩增5。扩增的反应条件:95预变性 5 min;95变性30 s，60退火30 s，35 个循环;72延伸 1 min。PC 扩增反应体系为 20 L，其中含:5 FastPFuBuffer4 L，2 5 mMdNTPs2 L，正反向引物各 0.8 L(5 M)，FastPFu 聚合酶 0.4L，牛血清蛋白(BSA)0.2 L，模板 DNA10 ng，用双蒸水补至 20 L。采用上海美吉生物医药科技有限 公 司 的 MiSeqPE300 测 序 仪(IlluminaInc，SanDiego，CA，USA)进行序列测定。原始数据已上传至美国国立生物技术信息中心(National Center021第 48 卷第 2 期2023 年 2 月周鹤林等长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究Vol.48 No.2Feb 2023for Biotechnology Information，NCBI)序列读取存档(sequence read archive，SA)，数据所属登录号为:PJNA663032。1 3测序数据分析对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，然后在 97%相似度下用 Usearch(version7.0)进行OTU 聚类6，并将 OTU 代表序列比对 SILVA 数据库(elease132，http:/www arb silva de)进行物种分类学分析。利用 Mothur(version1 30.1)计算样本 的 多 样 性 指 数(Shannon、Simpson、ACE、Chao1 和 Coverage)。采用 QIIME 计算样本的 un-weightedUniFrac 多样性矩阵，然后用 语言绘制PCoA 图，ANOSIM 分析检验组间差异显著性。为探究细菌群落与环境因子的关系，利用 语言进行冗余分析(edundancyAnalysis，DA)。功能预测采用PICUSt 软件进行分析，将 OTU 表与 KEGG(Kyo-toEncyclopediaofGenesandGenomes)数据库进行比对，获得功能预测信息，具体分析步骤基于在线分析平台(http:/picrust github io/picrust/)。1 4细菌总数 qPC 定量细菌总数通过 qPC 进行计数，总细菌数的 DNA 片段扩增使用正向引物 1369F:5 CGGTGAATACGT-TCYCGG 3，反向引物 1492:5 GGWTACCTTGT-TACGACTT 3，退火温度为 55。qPC 反应采用三个平行样，每个反应体系为 10 L，包括 5 L 的 2 PremixExTaq，200 nM 每种引物，0.1 L 的 50 OX 作为参照染料以及 1 L 的 DNA 模板。空白对照包含所有相同的反应试剂，但是用 1 L 的无菌水替代 DNA 模板。制备 DNA 标准品每次上样同时做标准曲线(r2 0.99)。记录标准品扩增效率，每次扩增效率相似，为 91%99%，具体数值取决于实际试验。1 5统计分析利用 IBMSPSSStatistics26 进行统计分析。Sha-piro Wilk 检验用于检验数据是否符合正态分布。t 检验用于检验符合正态分布的两组数据的差异显著性。Mann WhitneyU 检验用于检验不符合正态分布的两组数据的差异显著性。2结果与分析2 1水体理化指标分析表 1各采样点坐标和水体主要理化参数采样点东经()北纬()温度()溶解氧(mg/L)酸碱度pH总氮(mg/L)总磷(mg/L)化学需氧量(mg/L)流速(m/s)S1106 579 31429548 33922.06 698502350.06531 12S2106 566 12729 572 9729.06258 152430.036.01.04S310659 46329 609 09527.06658251840.06270.67S4106 629 33129618 18527.07.018383860.03220.74S5106 651 39429592 18426 57.078 421780.04410.45S6106 664 68929602 73627.06 738371810.04280.21S7106 665 04829599 34526 86638 381640.054.00.18S8106 675 75629578 17626 87198 351450.04450.76S9106 681 86429579 74726 97298 341550.04370.18S10106 674 82129572 64827.07 348361580.03290.22S11106 682 08029570 44927.07 448351540.02210.64121第 48 卷第 2 期2023 年 2 月周鹤林等长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究Vol.48 No.2Feb 2023各采样点水质理化参数如表 1 所示。各水质参数随采样点位置不同而有所差异，水温的变化可能主要来自于采样时间的不同(采样时间跨度为早上到下午)。pH 较为稳定。总氮浓度较高，总磷浓度低。COD 的最高值出现在长江和嘉陵江未汇合前，随着二者的汇合，COD 下降了 49%，这可能是由于水量的增大稀释了 COD 浓度。COD 在 S5、S7 和 S8均出现升高，前者可能是由于污水厂的排水，后两者可能由于河道的突然变窄，而后随着水流，COD 值总体呈下降趋势。t 检验结果表明，污水厂上下游的水质参数不存在显著差异(p 0.05)。一些采样点(S7、S9)的流速较低(0.2 m/s 左右)，但并未出现有机物和营养盐的浓度高值。近年来，氮磷，尤其是磷，已成为影响长江水质的主要污染物质7。而在研究河段，除了总氮的浓度较高外，其它水质参数均达到类水质标准。2 2细菌群落多样性指数分析11 个样品共得到617 952条高质量序列，每个样品32 858 74 136条序列。依据 97%相似度划分，共得到1 278条 OTUs，每个样品的 OTU 数目为 644 897。通过评估各样品的细菌群落多样性指数(如表2 所示)，表明嘉陵江(S2)水体中细菌群落多样性(Shannon 指数:344)和丰富度(Chao1 指数:643.04)都低于长江水体(除 S2 号点以外的 10 个样本点)细菌群落的多样性(Shannon 指数:4 31 4 72)和丰富度(Chao1 指数:942 52 1 17260)。长江水体的细菌群落多样性(Shannon 指数:0.56 5.42)和丰富度(Chao1 指数:137 12 601)在较大范围变动，该河段的细菌群落多样性和丰富度较为稳定。t 检验结果显示，污水厂上下游水体的细菌群落多样性指数不存在显著性差异(p 0.05)，各流态、流速不同的采样点细菌群落多样性指数也不存在显著性差异(p 0.05)。表 2细菌群落多样性指数采样点OTU香农指数辛普森指数ACEChao1覆盖度(%)S17654 430.0311 06268942 520.990S26643 440.138674 16643.040.993S38974 560.0261 275831 031110.988S46444 550.0281 06749959 970.990S57194 560.0261 279891 026220.988S67054 540.0281 313481 080.350.988S77214 310.0461 01724998 810.988S87304 470.0341 102351 057160.987S97764 720.0201 275581 109.000.987S107164 440.0321 358881 078220.987S117664 560.0291 399331 172600.9862 3细菌群落组成分析长江水体中优势细菌门类有:放线菌门(Acti-nobacteria，41.02%54 15%)、变 形 菌 门(Pro-teobacteria，22 51%35 18%)、拟杆菌门(Bacte-roidetes，9 56%14 60%)和蓝细菌门(Cyanobacte-ria，4 70%13 30%)(如图 2 所示)。嘉陵江水体中细菌群落构成与长江水体相似，差异在于放线菌所占比例更高(68 78%)。这些细菌都是河湖等淡水水体中的典型细菌，长江和嘉陵江的细菌群落已被发现主要由这些细菌门类以及厚壁菌门(Firmi-cutes)构成，但各门类的比例随采样时间和位置存在差异8。221第 48 卷第 2 期2023 年 2 月周鹤林等长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究Vol.48 No.2Feb 2023图 2样品门分类水平的细菌群落组成2 4细菌群落构成相似性分析利用 PCoA 分析各样本的细菌群落构成相似度(如图 3 所示)。对鸡冠石污水厂排水口上下游样品进行分组，上游 S1、S3、S4 为 G1 组，下游 S5 至S11 为 G2 组。PCoA 分析表明，G2 组样品(S5 S11)成聚集状态，说明 G2 组各样本的细菌群落构成较为相似，不受流速、流态变化的影响。G1 组 S2和 S3 聚集，而 S1 与 S2、S3 较为分散，可能是因为S1 在嘉陵江汇入前，S2、S3 在嘉陵江汇入后，嘉陵江的汇入引起了细菌群落结构的变化。通过 ANOSIM相似性分析进一步发现，污水厂排水口上下游的细菌群落结构存在显著差异(p 0.05)。沈杰等9 也研究发现污水厂上下游的微生物群落构成存在显著性差异，表明污水厂排水对河流微生物群落有影响。图 3样品 PCoA 分析(注:G1 代表分组 1;G2 代表分组 2。)2 5细菌群落构成与环境因子关系应用 DA 分析细菌群落构成与环境因子的关系(如图 4 所示)。结果表明，对研究河段细菌群落影响最大的环境因子是 pH，其次是 COD，然后是温度，总磷(TP)对细菌群落的影响最小。pH 与 COD、温度呈负相关，COD 与温度呈正相关。放线菌门(Actinobacteria)与水温、流速和 COD 呈正相关关系，与 TP、DO、pH 呈负相关关系。变形菌门(Pro-teobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)与 pH、DO、TP 正相关，与 COD、流速、水温负相关。蓝细菌门(Cyanobacteria)与 COD、pH、DO 呈正相关关系，与TP、TN、水温、流速负相关。河流微生物群落受到气候、水文、营养物质等众多环境因子的共同影响。研究没有水文气象条件变化，主要分析水质指标对河流微生物群落的影响。图 4门分类水平下细菌群落与环境因子的 DA 分析2 6显著性差异物种分析对鸡冠石污水厂上下游丰度差异显著的物种进行分析。在科分类水平上，共有 2 个科的细菌存在显著丰度差异，主要为孢鱼菌科(Sporichthyaceae)和伯克氏菌科(Burkholderiaceae)。相比污水厂上游，Sporichthyaceae 在污水厂下游显著增加，而 Burk-holderiaceae 显著减少。Sporichthyaceae 属于放线菌，研究发现其通过降解颗粒有机物进行生长，能够在不利条件下生存，同时对环境的变化有很好的适应能力10。Burkholderiaceae 属于变形菌，包括了很321第 48 卷第 2 期2023 年 2 月周鹤林等长江典型城区河段在多因素影响下的细菌群落稳定性研究Vol.48 No.2Feb 2023多的人类和动物致病菌以及条件致病菌。2 7功能基因预测分析利用 PICUSt 预测的各样品 KEGG 通路包括代谢、遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理等几个功能组。其中，代谢通路所占比例最高(69 5%71 2%)。代谢通路中外源物质的降解和代谢功能基因与细菌对污染物的降解有关，所有样品具有的该类别功能基因中基因数最高的包括苯甲酸盐(Benzoate)降解基因、氨基苯甲酸盐(Aminobenzo-ate)降解基因、己内酰胺(Caprolactam)降解基因以及氯代烷烃(Chloroalkane)和氯代烯烃(Chloroalk-ene)降解基因。各样品相比较，嘉陵江细菌群落(S2)具有的降解和代谢外源物质的功能基因数最多。结果表明，除了阿特拉津(Atrazine)和 DDT 降解基因外，其它各外源物质降解代谢基因的相对丰度均为嘉陵江细菌群落(S2)最高。污水厂下游除了 S7 的污染物降解功能基因相对丰度较高外，没有发现污染物降解基因的明显富集。有研究发现，有毒化学物质的存在会增加微生物的代谢酶和代谢路径。但是，污染物降解功能基因丰度和污染物浓度的关系还尚不明确，需要进一步的研究。3结语嘉陵江和长江水体均具有丰富的浮游细菌，细菌总数达到 5 22 1051 38 106copies/mL，细菌群落构成主要包括放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌门。嘉陵江菌群丰富度和多样性低于长江，但放线菌在菌群构成中具有更高的比例。污水厂排水对细菌群落结构造成了显著影响，引起 Sporich-thyaceae 显著增加和 Burkholderiaceae 显著减少。河流流速、流态变化并未引起水质、菌群多样性指数、群落结构和细菌总数的显著变化，表明细菌群落不受水流运动的影响。影响研究河段细菌群落的主要环境因子有 pH、COD 和水温。PICUSt 功能预测分析表明，嘉陵江细菌群落具有最多的外源物质降解和代谢功能基因，对于大部分外源物质，其降解和代谢的功能基因的相对丰度也最高。污水厂排水并未导致该类功能基因的富集。参考文献:1 黄燕 长江口外缺氧区海水细菌和古菌群落结构变化及影响因素研究 D 舟山:浙江海洋大学，2021 2 张楚，刘昕 长江流域水安全问题基本情势及治理分析 J 长江技术经济，2021 3 李悦，王立家 河流水动力和水环境对悬浮颗粒物吸附特性的影响研究 J 水利科技与经济，2022，28(12):36 40.4 Yang Y Z，Hou Y，MaM，et al Potentialpathogencommu-nitiesinhighlypollutedriverecosystems:geographicaldistributionand-environmentalinfluence J Ambio，2020，49(1):197 207 5 Luo S，He B，Song D，Li T，Wu Y，Yang L esponse ofBacterial Community Structure to Different Biochar Addition Dosa-ges in Karst Yellow Soil Planted with yegrass and Daylily J Sustainability，2020，12(5):2124 6 Miaow K，Lacap Bugler D，Buckley HL Identifying op-timal bioinformatics protocols for aerosol microbial community data M PeerJ，2021 7 王妍 长江流域氮磷污染物的空间分布特征及关键源区识别研究 J 常州工学院学报，2022，35(2):1 6 8 张紫薇，陈召莹，张甜娜，等 基于高通量绝对定量测序解析岗南水库微生物群落的时空分布特征及关键驱动因素 J 环境科学学报，2022，42(2):224 239 DOI:10.13671/j hjkxxb2021.0289 9 沈杰，金伟 城镇污水处理厂尾水对受纳水体影响的研究进展 J 环境工程，2020，38(3)10 CruaudP，VigneronA，FradetteMS，et al Annualbacte-rialcommunitycycleinaseasonallyice coveredriverreflectsenviron-mentalandclimaticconditions J LimnologyandOceanography，2020，65:21 37421