禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因AdPAL1的克隆与表达分析_张晓东.pdf

收稿日期：2023-01-23基金项目：河南省自然科学基金面上项目（232300420027）；河南省人力资源和社会保障厅留学人员科研择优资助项目（2023039）；河南省大学生创新项目（S202110480050）作者简介：张晓东（1980），男，博士，副教授，研究方向为道地药材次生代谢与调控，E-mail：广东农业科学 2023，50（5）：1-10Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.05.001张晓东，刘勇江，沙漠，赵晶晶，李会平，张喜.禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 的克隆与表达分析J.广东农业科学，2023，50（5）：1-10.禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 的克隆与表达分析张晓东，刘勇江，沙 漠，赵晶晶，李会平，张 喜（许昌学院食品与药学院，河南 许昌 461000）摘 要：【目的】探究禹白芷中欧前胡素含量与苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 表达的相关性，并对 AdPAL1进行克隆和原核表达。【方法】使用高效液相色谱法测定禹白芷快速生长期和收获期根和叶中欧前胡素的含量，并使用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）方法测定 AdPAL1 基因在同时期根和叶中的表达情况，以观察欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达是否具有相关性。此外，以禹白芷转录组为基础，采用逆转录 PCR（RT-PCR）技术从禹白芷根中克隆 AdPAL1 基因，并在大肠杆菌中进行表达。【结果】禹白芷快速生长期根中的欧前胡素含量远高于叶，而 AdPAL1 基因在根中的表达量也远高于叶。与快速生长期相比，收获期根中欧前胡素含量略有下降，AdPAL1 基因在根中的表达量也同时下降。这些结果表明 AdPAL1 基因表达与欧前胡素含量具有相关性。此外，生物信息学分析显示，禹白芷 AdPAL1 基因（GenBank 登录号：OQ822236）开放阅读框长 1 764 bp，编码 557 个氨基酸，其蛋白相对分子质量为 61.10 kD，等电点为 5.92，且具有苯丙氨酸解氨酶保守结构域（IPR005922，1547），属于 PAL 蛋白家族成员。AdPAL1 蛋白定位于细胞质，主要由-螺旋和无规则卷曲构成，与石防风属植物 KpPAL2 蛋白亲缘关系最近，序列相似性高达 99.28%。AdPAL1 基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为 84.00 kD，与预期蛋白大小一致。【结论】初步确定禹白芷根和叶中欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达相关，并成功克隆 AdPAL1 基因，在大肠杆菌中成功表达。上述结果为进一步研究 AdPAL1 基因在欧前胡素生物合成中的作用机制提供参考。关键词：禹白芷；欧前胡素；苯丙氨酸解氨酶；组织特异性表达；基因克隆；生物信息学分析；原核表达中图分类号：S188；Q786 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2023）05-0001-10Cloning and Expression Analysis of Phenylalanine Ammonia-lyase Gene AdPAL1 in Angelica dahurica cv.YubaizhiZHANG Xiaodong,LIU Yongjiang,SHA Mo,ZHAO Jingjing,LI Huiping,ZHNAG Xi（Food and Pharmacy College,Xuchang University,Xuchang 461000,China）Abstract:【Objective】This study aimed to explore the correlation between the content of imperatorin and the expression of the phenylalanine ammonia-lyase gene(AdPAL1)of Angelica dahurica cv.Yubaizhi(YBZ).In addition,AdPAL1 was cloned and expressed in prokaryotes.【Method】The content of imperatorin in the roots and leaves of YBZ during its rapid growth stage and harvest stages was measured using high-performance liquid chromatography(HPLC),and the expression of the AdPAL1 gene in the roots and leaves during the same stages was detected using real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR)to observe whether there was a correlation between imperatorin content and the expression 2【研究意义】禹白芷（Angelica dahurica cv.Yubaizhi）是河南道地药材，为伞形科当归属植物白芷的干燥根。禹白芷富含香豆素类、挥发油类和黄酮类化合物，具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓等功效，常被用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等病症1。禹白芷位于禹药之首，被收录于历届中国药典1。根据地理标志产品保护规定，我国自 2006 年 12月 28 日起对禹白芷实施地理标志产品保护。由于其独特的香气和优质的特性，禹白芷被广泛用于中医临床饮片配方、保健品、化妆品和香料等领域2。然而，禹白芷生产面临连作障碍和道地产区耕地面积逐年减少的问题。因此，利用合成生物学方法生产禹白芷的主要药效成分香豆素具有重要的前景。【前人研究进展】在植物中，香豆素的生物合成起源于苯丙素途径3。苯丙氨酸解氨 酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）是苯丙素生物合成途径的第一个酶（图1），能够催化 L-苯丙氨酸中氨的氧化，生成反式肉桂酸，并释放氨气4。在植物中，PAL 由其多基因家族编码5。如拟南芥有4个PAL基因6、石防风属植物（Kitagawia praeruptora）有 3 个PAL 基因7-8、不同品种咖啡中发现 36 个 PAL基因9、生菜有 5 个 PAL 基因10、马铃薯基因组中发现多达 14 个 PAL 基因11，在禹白芷转录组中预测有 4 个 PAL 基因。目前，PAL 基因已从拟南芥12、孜然芹13、罗勒5等许多植物中分离。PAL 基因的表达具有组织特异性，并被生物和非生物因素诱导。例如，在前胡中，PpPAL基因主要在根中表达，茎和叶中也有少量表达，且茉莉酸甲酯、紫外线和冷处理均能够上调该基因的表达，而过氧化氢、热处理则下调该基因的表达7；抽薹后，叶中 PpPAL1 基因表达量急剧上升，而叶中 PpPAL2 基因表达量急剧下降8。在咖啡中，叶锈病真菌可诱导 PAL 基因表达，与易感品种 Caturra 相比，抗性品种 Hbrido de Timor的诱导率更高9。在孜然芹中，CcPAL 在芽中表of the AdPAL1 gene.Furthermore,the AdPAL1 gene was cloned from the root of YBZ based on its transcriptome using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)technology,and it was expressed in Escherichia coli.【Result】During the rapid growth period of YBZ,the content of imperatorin in the roots is much higher than that in the leaves,and the expression level of AdPAL1 in the roots is also much higher than that in the leaves.Compared with the rapid growth stage,the content of imperatorin in the roots slightly decreases during the har vest stag e,and the expression level of AdPAL1 gene in the roots also decreases at the same time.These results indicate a correlation between the expression of AdPAL1 gene and the content of imperatorin.In addition,bioinformatics analysis show that the AdPAL1 gene(GenBank accession number:OQ822236)of YBZ has an open reading frame length of 1 764 bp and encods 557 amino acids.The relative molecular weight of AdPAL1 protein is 61.10 kD,and its isoelectric point is 5.92.It has a conserved domain of phenylalanine ammonia lyase(IPR005922,1-547),which belongs to the PAL protein family and it is located in the cytoplasm and is mainly composed of-helixes and irregular coils.AdPAL1 has the closest genetic relationship with the KpPAL2 protein in Kitagawia praeruptora,with a local sequence similarity of up to 99.28%.The relative molecular weight of the recombinant protein of AdPAL1 gene expressed in E.coli is about 84.00 kD,which is consistent with the expected protein size.【Conclusion】The correlation between the content of imperatorin in roots and leaves of YBZ and the expression of AdPAL1 gene was preliminarily determined,and the AdPAL1 gene was cloned and successfully expressed in E.coli.These results provide a reference for further research on the mechanism of AdPAL1 gene in imperatorin biosynthesis.Key words:Angelica dahurica cv.Yubaizhi;imperatorin;phenylalanine ammonia-lyase;tissue specific expression;gene cloning;bioinformatics analysis;prokaryotic expression图 1 植物香豆素生物合成途径Fig.1 Coumarin biosynthesis pathway in plants3达量最高，其次是种子，根中的表达量最低，且镉、受伤、水杨酸和冷处理均可促进其表达13。生产上，PAL 基因具有广泛用途。研究发现，PAL 基因是鉴别金针菇颜色的关键基因14。改造后的拟南芥 PAL 可用于光学纯 L-苯丙氨酸的大规模生产12。喷洒壳聚糖纳米颗粒在水稻中可以提升 PAL 酶活性、降低水稻种子中苯丙氨酸的含量，为苯丙酮尿症患者提供低苯丙氨酸的稻米15。【本研究切入点】目前，禹白芷的研究主要集中在化学成分鉴定16、含量测定17以及主要药效成分的药理作用18等方面。然而，禹白芷 AdPAL1 基因尚未有相关报道。为实现在工程菌中高效生产禹白芷中的高价值香豆素成分，必须对香豆素生物合成途径的基因进行克隆和功能解析。【拟解决的关键问题】本研究拟首先测定禹白芷快速生长期和收获期根和叶中主要香豆素成分欧前胡素的含量，并同时测定 AdPAL1 基因同期的表达情况，探究它们之间的相关性。随后，根据禹白芷转录组中 AdPAL1 基因序列，设计特异性引物，利用 RT-PCR 技术从禹白芷根中扩增 AdPAL1 基因，并进行序列分析和原核表达，以期为禹白芷 AdPAL1 基因的功能及其在欧前胡素生物合成中的作用机制解析提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料供试材料为禹州市中药材标准化中心提供的禹白芷（Angelica da hurica cv.Yubaizhi）种子。2020 年 9 月 5 日，在许昌学院道地药材种植基地播种；并于 2021 年 6 月 29 日（快速生长期）和2021 年 7 月 29 日（收获期）采样。基因克隆所用材料为禹白芷的根，基因组织特异性表达分析所用材料为一年生禹白芷的根（顶端 1/5 处）和成熟的大叶片。1.2 试验方法1.2.1 欧前胡素含量测定 采用安捷伦 1260 高效液相色谱（HPLC）仪，按照中国药典1的方法测定白芷干燥根和干燥叶中欧前胡素的含量。使用梯度浓度绘制标准品的标准曲线，所有样品均重复 3 次。1.2.2 根 总 RNA 提 取 及 AdPAL1 基 因 开 放阅 读 框（ORF）克 隆 按 照 张 玲 等19的 方法 提 取 禹 白 芷 根 总 RNA、合 成 cDNA 和 克隆 AdPAL1 基 因 ORF，获 得 重 组 质 粒 pMD19-AdPAL1。AdPAL1 基 因 引 物 为 AdPAL1NdeI-F：CATATGCTTGTGAGGATCAACACACT（下划线为NdeI 酶切位点），AdPAL1HindIII-R：AAGCTTAGAAATTGGTAGAGGAGCTCCAT（下划线为 HindIII酶切位点），退火温度为 61。1.2.3 AdPAL1 基因原核表达载体构建 通过酶切连接的方法19构建原核表达载体 ProS2-AdPAL1。1.2.4 AdPAL 蛋白生物信息学分析 按照张玲等19的方法对 AdPAL1 蛋白进行生物信息学分析。利用 ProtComp v9.0 软件预测蛋白的亚细胞定位情况。使用 STRING 网站对 AdPAL1 蛋白与其他蛋白间的互作进行预测20。多序列比对和进化树构建所使用蛋白的 GenBank 登录号分别为：绿竹 Bambusa oldhamii，BoPAL（AAR24505.1）；水稻 Oryza sativa indica group，OsPAL（CAA61198.1）；青稞 Hordeum vulgare subsp.vulgare，HvPAL（CAA89007.1）；小 麦 Triticum aestivum，TaPAL（CAA68036.1）；小立碗藓 Physcomitrella patens，PpaPAL（XP_001760495.1）；银杏 Ginkgo biloba，GbiPAL（ABU49842.1）；麻黄 Ephedra sinica，EsPAL（BAG74770.1）；欧洲云杉Picea abies，PaPAL（CAK22402.1）；火炬松Pinus taeda，PtaPAL（AAA84889.1）；罂粟 Papaver somniferum，PsPAL（XP_026403210.1）；毛果杨 Populus trichocarpa，PtPAL（ACC63889.1）；狭叶油茶Camellia lanceoleosa，ClPAL（KAI8012953.1）；小叶种茶 Camellia sinensis var.sinensis，CsPALd（QIH97409.1）；石防风属植物Kitagawia praeruptora，KpPAL1（UXG20228.1）、KpPAL2（UXG20229.1）；美味猕猴桃Actinidia deliciosa，AdePAL2（QED11031.1）；中 华 猕 猴 桃 Actinidia chinensis var.chinensis，AcPAL（PSS23706.1）；紫花前胡Angelica decursiva，AdecPAL（QCY50324.1）；野 胡 萝 卜 Daucus carota，DcPAL（BAC56977.1）；欧芹 Petroselinum crispum，PcPAL3（P45729.1）；当 归 Angelica sinensis，AsPAL（AJW77399.1）；金银花 Lonicera japonica，LjPAL（AGE10589.1）；灰 毡 毛 忍 冬Lonicera macranthoides，LmPAL（AZR37753.1）；蓝靛忍冬 Lonicera caerulea，LcPA（ALU09327.1）；莴苣 Lactuca sativa，LsPAL（XP_023767814.1）；雪莲 Saussurea involucrata，SiPAL（ALK02780.1）；刺苞菜蓟 Cynara cardunculus var.scolymus，CcPAL（XP_024986252.1）；青蒿 Artemisia annua，4AaPAL（AKP55356.1）；红 凤 菜 Gynura bicolor，GbPAL（BAJ17655.1）；西洋梨 Pyrus communis，PcPAL（AGL81344.1）；芝 麻 Sesamum indicum，SinPAL（XP_011077338.1）；向 日 葵 Helianthus annuus，HaPAL（KAJ0657456.1）；非洲菊 Gerbera jamesonii，GjPAL（QBC35985.1）；苹果 Malus domestica，MdPAL1（XP_008387584.2）；紫苏Perilla frutescens，PfPAL（AEZ67457.1）；禹白芷 Angelica dahurica cv.Yubaizhi，AdAPL1（WGD08245.1），AdPAL2（WGD08246.1）。1.2.5 AdPAL1 基因的原核表达 参照张玲等19的方法进行重组质粒 ProS2-AdPAL1 的原核表达与 SDS-PAGE 检测。菌体收集后，使用 1PBS洗涤菌体，使用JY92-IIDN型超声细胞破碎仪（新芝，宁波）进行细胞破碎。4、12 000 r/min 离心 30 min，分离上清和沉淀。1.2.6 AdPAL1 基因的组织特异性表达分析 分别取一年生快速生长期和收获期禹白芷的根和叶，按照张玲等19的方法进行 AdPAL1 基因的组织特异性表达分析。选择 AdSAND 基因21作 为 内 参，引 物 为 qAdSAND-F：5-TGCTGGAGGAAAGGGGAC-3 和 qAdSAND-R：5-GCCATTTCCCAGGGACCC-3，PCR条件为：95 30 s，95 5 s，60 20 s。AdPAL1 引物为 qAdPAL1-F：5-AGTGCTAGGGCTGTGCTTG-3 和 qAdPAL1-R：5-TCCTCTCCAGGCGATGTCA-3，PCR 条 件 为：95 30 s，95 5 s，60 20 s。每个反应重复3次。反应在 Archimed X4 荧光定量 PCR 仪（鲲鹏基因，北京）上进行扩增，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量 PCR 仪软件自动生成。使用内参基因校准后，分别计算根和叶中 AdPAL1 基因相对表达量。采用 2-Ct的方法进行数据分析。1.2.7 数据分析 使用 Origin 2018C 对欧前胡素含量和 AdPAL1 基因的表达量进行显著性分析。使用 Excel 2019 中的 CORREL 函数计算快速生长期与收获期欧前胡素变化量、AdPAL1 基因表达变化量的相关系数。2 结果与分析2.1 欧前胡素含量测定分别对禹白芷快速生长期和收获期根和叶中的欧前胡素含量进行测定，结果（图 2）表明，两个时期根中的欧前胡素含量均显著高于叶，并且在快速生长期根和叶中的欧前胡素含量均略高于收获期。2.2 AdPAL1 基因的组织特异性表达分析取禹白芷快速生长期和收获期的根和叶，通过 qRT-PCR 分析 AdPAL1 基因在不同组织中的表达情况。结果（图 3）表明，快速生长期根中AdPAL1 基因的表达量显著高于叶，约是叶中表达量的 21 倍；收获期根中 AdPAL1 基因的表达量约为叶中的 50.21%。此外，根中 AdPAL1 基因表达变化量与欧前胡素累积变化量的皮尔逊相关系数为 0.46（中度相关），而叶中 AdPAL1 基因表达变化量与欧前胡素累积变化量的皮尔逊相关系数为 0.17（弱相关），综合以上研究结果，初步判断在根中AdPAL1基因参与欧前胡素的生物合成。2.3 禹白芷 AdPAL1 基因序列克隆以禹白芷幼叶 cDNA 为模板，使用特异性引*、*分别表示 0.01、0.001 水平上差异显著；NS 表示差异不显著*,*indicate significant differences at 0.01,0.001 levels,respectively;NS indicates that the difference is not significant图 3 不同生长时期根和叶中的 AdPAL1 基因相对表达Fig.3 Relative expression of AdPAL1 gene in roots and leaves at different growth stages*、*分别表示 0.01、0.001 水平上差异显著；NS 表示差异不显著*,*indicate significant differences at 0.01,0.001 levels,respectively;NS indicates that the difference is not significant图 2 不同生长时期根和叶中的欧前胡素含量Fig.2 Content of imperatorin in roots and leaves at different growth stages5物扩增出约 2 000 bp 的片段（图 4）。通过 TA 克隆获得重组质粒 pMD19-AdPAL1，酶切检测结果显示双酶切获得的 2 个 DNA 片段大小之和等于单酶切片段大小，表明 AdPAL1 基因已成功插入到pMD19T 载体中。2.4 AdPAL1 蛋白生物信息学分析利用 Genetyx 和 DNAMAN 软件对 AdPAL1 基因 ORF 序列进行分析，结果表明 AdPAL1 基因ORF 长 1 764 bp，编码 557 个氨基酸。本研究中所克隆到的 AdPAL1 基因与二代转录组拼接获得的 AdPAL1 核苷酸序列并不完全一致，二者相似性为 99.64%。将该序列上传至 GenBank 数据库，获得 GenBank 登录号为 OQ822236。使 用 GenBank 数 据 库 中 的 BLASTp 程 序对 AdPAL1 蛋 白 进 行 比 对 分 析，结 果 发 现 禹白 芷 AdPAL1 与 石 防 风 属 植 物 KpPAL2 蛋 白序列相似性最高（99.28%），与紫苏（Perilla frutescens）PfPAL 蛋白相似性稍低（88.31%）。利用 DNAMAN 将 AdPAL1 蛋白序列与从 NCBI 中挑选的相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果表明 AdPAL1 蛋白与已知蛋白相似性很高，在第 3954 位氨基酸残基之间含有保守基序“GTITASGDLVPLSYIA”和 Ala-Ser-Gly 催 化三联体，这被预测为典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶（HAL）特征模式22-23（图 5）。此外，AdPAL1 蛋白还包含 PAL 保守催化活性位点，如 GLALVNG（96102）、NDN（223225）和M：Marker，DNA 分子量标准；1：AdPAL1 基因扩增结果M:Marker,DNA standard;1:AdPAL1 gene amplif ication result图 4 AdPAL1 基因的 PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplification result of AdPAL1 gene黑色：相似性=100%；粉红色：75%相似性 100%；浅蓝色：50%相似性 75%；保守的基序使用红框标记，保守的活性位点基序使用三角形标记，催化活性位点使用蓝框标记Black:Similarity=100%;Pink:75%Similarity 100%;Light blue:50%Similarity 75%;Conservative motif,active site motif,catalytic active site are marked with a red box,a triangle,and a blue box,respectively图 5 AdPAL1 蛋白与其他植物 PAL 蛋白的多序列比对结果Fig.5 Multiple sequence alignment results of AdPAL1 protein with other plant PAL proteins6相对分子质量为61.10 kD，理论等电点（pI）为5.92；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）为 62，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）为 54。蛋白不稳定指数为 36.77，属于稳定蛋白；脂肪指数为 93.68，总平均疏水性（GRAVY）为-0.124，为亲水蛋白。AdPAL1 蛋白含有 20 种基本氨基酸，其中亮氨酸含量最高、为 11.10%；其次是丙氨酸和谷氨酸，分别为7.90%和7.50%；色氨酸含量最低、为0.4%。利用 SSpro 方法对 AdPAL1 蛋白进行二级结构分析，结果发现该蛋白二级结构中-螺旋（H）占58.53%，无规则卷曲（C）占38.78%，延伸带（E）占 2.69%。利用 Swiss-Model Workspace 使用自动模式预测 AdPAL1 蛋白的三级结构，发现该模型为同源四聚体（图 7），是以欧芹苯丙氨酸解氨酶 6f6t.1.A 为模板，在第1557位氨基酸处建模，序列相似度为 94.23%。使用 SMART 软件进行蛋HNQDV（327331）8,24（图 5）。利用 IQTREE2将 AdPAL1 蛋白序列与已发表文献中相似性较高的序列进行系统发育分析，结果进化树分为 4 个进化枝，分别为单子叶植物、苔藓植物、裸子植物和双子叶植物，其中禹白芷 AdPAL1 蛋白与伞形科植物当归、欧芹、野胡萝卜、紫花前胡、石防风属植物的 PAL 蛋白聚为同一大进化枝，尤其是与石防风属植物 KpPAL2 蛋白处于同一小进化枝（图 6），表明二者亲缘关系较近，具有相似或相同的结构与功能。使用 ExPASy ProtParam tool 对 AdPAL1 蛋白进行理化性质分析，结果表明 AdPAL1 蛋白单体图 6 AdPAL1 蛋白与其他植物中 PAL 蛋白的系统发育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of AdPAL1 protein and other plant PAL proteins红色：-螺旋；黄色：-折叠；绿色：环Red:-spiral;Yellow:-fold;Green:Ring图 7 AdPAL1 蛋白四聚体的三维结构预测Fig.7 3D Structure prediction of AdPAL1 protein tetramer72.6 AdPAL1 基因原核表达将重组质粒 ProS2-AdPAL1 转化大肠杆菌BL21（DE3）后，使用IPTG进行诱导表达。在15、终浓度为0.5 mmol/L IPTG下，分别诱导表达0、2、4、6、8 h后，提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明，与对照相比，ProS2-AdPAL1 转化菌经IPTG 诱导后，在相对分子质量 84 kD（含 Protein S 标签蛋白 23 kD）左右有 1 条蛋白条带，并且随诱导时间增加其蛋白含量逐渐增加，表明重组质粒 ProS2-AdPAL1 在大肠杆菌 BL21（DE3）中成功诱导表达了 AdPAL1 蛋白。当温度为 15、诱导时间为 6 h 时，蛋白表达量最高（图 10）。为检测 AdPAL1 融合蛋白的存在形式，对诱导表达8 h 的菌体进行超声破碎，然后使用 SDS-PAGE白保守结构域预测，结果表明 AdPAL1 蛋白在第1338 氨基酸位置具有芳香族氨基酸裂解酶结构域。使用 InterPro 在线工具对 AdPAL1 蛋白进行蛋白家族归类分析，结果表明 AdPAL1 蛋白属于芳香族氨基酸裂解酶（IPR001106，1556）家族、苯丙氨酸解氨酶（IPR005922，1547）亚家族成员。使用 SignalP 6.0 服务器分析 AdPAL1 蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用 TMHMM 工具预测 AdPAL1 蛋白的跨膜螺旋区，结果表明 AdPAL1 蛋白不含跨膜螺旋区域，为非膜蛋白。利用亚细胞定位软件 ProtComp 9.0 预测AdPAL1 蛋白，结果显示其定位于细胞质。蛋白相互作用预测结果表明，AdPAL1 蛋白与 C4H、4CL1、4CL2、4CL3、4CL5、HISB6B、AAS、ACOS5（类4CL酶）、CCoAMT1、AT4G05160等 10 个蛋白存在互作，其中 PAL、C4H、4CL、CCoAMT 是简单香豆素生物合成的催化酶，AAS参与细胞氨基酸代谢，AT4G05160 参与脂肪酸的激活，HISN6B 为参与组氨酸生物合成的组氨酸磷酸转氨酶（图 8）。C4H：反式肉桂酸 4-单加氧酶；4CL1、4CL2、4CL3、4CL5：4-香豆酸CoA 连接酶；ACOS5：类 4-香豆酸 CoA 连接酶；HISB6B：组氨酸磷酸氨基转移酶；AAS：芳香醛合酶；CCoAMT1：咖啡酰CoA 3-O-甲基转移酶；AT4G05160：AMP 依赖性合成酶和连接酶家族蛋白C4H:Trans cinnamic acid 4-monooxygenase;4CL1,4CL2,4CL3,4CL5:4-coumaric acid CoA ligase;ACOS5:4-coumaric acid CoA ligase like;HISB6B:Histidine phosphate aminotransferase;AAS:Aromatic aldehyde synthase;CCoAMT1:Coffee acyl CoA 3-O-methyltransferase;AT4G05160:AMP dependent synthase and ligase family proteins图 8 AdPAL1 蛋白互作网络预测结果Fig.8 AdPAL1 protein interaction network prediction resultsM：Marker，DNA 分子量标准；12：质粒 ProS2-AdPAL1 的 NdeI、HindIII 双酶切和 HindIII 单酶切；3：质粒对照M:Marker,DNA standard;1:NdeI and HindIII double digestion;2:HindIII single digestion results of plasmid ProS2-AdPAL1;3:plasmid control图 9 质粒 ProS2-AdPAL1 酶切检测结果Fig.9 Enzyme digestion detection results of plasmid ProS2-AdPAL1M：Marker，蛋白分子量标准；12：15、IPTG 终浓度为 0.5 mmol/L下 ProS2 转化菌分别诱导 0 和 8 h 的总蛋白；37：相同条件下 ProS2-AdPAL1 转化菌分别诱导 0、2、4、6 和 8 h 的总蛋白M:Marker,protein standard;1-2:Total proteins of ProS2 transformed bacteria induced for 0 and 8 h under 0.5 mmol/L of IPTG at 15 ;3-7:Total proteins of ProS2-AdPAL1 transformed bacteria induced for 0,2,4,6,and 8 h under the same conditions图 10 15 下不同诱导时间对 AdPAL1 蛋白表达的影响Fig.10 Effects of different induction times on AdPAL1 protein expression at 15 2.5 AdPAL1 基因原核表达载体构建使 用 NdeI 和 HindIII 双 酶 切 质 粒 ProS2-AdPAL1，可切出目的片段和载体，且两片段之和等于单酶切片段长度（图 9），表明 AdPAL1 基因已成功插入原核表达载体 ProS2 中。8检测，结果表明 AdPAL1 蛋白全部以包涵体形式存在（图 11）。3 讨论植物 PAL 在介导和协调初级到次级代谢的碳通量方面发挥着关键作用，这对于植物应对不同的环境条件以适应和优化生长至关重要25。禹白芷的主要药效成分为香豆素类化合物，通过苯丙素途径合成3。在植物中，PAL 是苯丙素途径的第一个限速酶26。因此，禹白芷 AdPAL 基因的表达情况直接或间接影响香豆素的生物合成。本研究中，不同生长时期禹白芷根和叶中欧前胡素变化量与 AdPAL1 基因表达变化量具有中度相关性，判断 AdPAL1 基因可能参与欧前胡素的生物合成。因此，对禹白芷 AdPAL1 基因进行克隆和生物信息学分析，结果表明所克隆的 AdPAL1基因 ORF 全长 1 764 bp，编码 557 个氨基酸，pI为5.92，其与番红花CsPAL蛋白（559 aa，pI为5.7）类似，但比白花前胡 PpPAL1（718 aa，pI 为 6.25）和PpPAL2 蛋白（705 aa，pI为6.16）5 端要短8，比孜然 CcPAL 蛋白（116 aa，pI 为 5.85）要长得多13。蛋白保守结构域预测结果显示，AdPAL1蛋白在第 1338 位氨基酸位置具有芳香族氨基酸裂解酶结构域。InterPro 软件则将 AdPAL1 蛋白归类为芳香族氨基酸裂解酶（IPR001106，1556）家族、苯丙氨酸解氨酶（IPR005922，1547）亚家族成员。事实上，芳香族氨基酸裂解酶家族包含苯