药学自主设计性实验：7-羟乙基白杨素的合成与表征.pdf

第 51 卷第 9 期2023 年 5 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.9May.2023药学自主设计性实验:7-羟乙基白杨素的合成与表征景临林(西安交通大学第一附属医院药剂科,陕西 西安 710061)摘 要:设计了在白杨素分子中引入水溶性羟乙基基团合成 7-羟乙基白杨素的自主设计性实验。实验涉及新药设计理论、实验方案制定、醚类化合物的合成,过滤、洗涤、柱层析纯化、重结晶等步骤。同时,实验设计中对目标产物的化学结构和纯度进行了波谱学表征,学生能够将核磁共振、红外波谱、高分辨质谱、高效液相色谱等理论知识付诸实践,提升学生的自主探究能力和科研创新能力,实现理解理论知识、掌握实验技能、发展创新思维的综合目标。关键词:药学;自主设计实验;7-羟乙基白杨素;亲核开环反应中图分类号:R914;G423 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)09-0164-04 基金项目:国家自然科学基金(No:81872796)。作者简介:景临林(1982-),男,博士,副主任药师,副教授,主要从事药物活性分子的设计、合成及药效学研究。Pharmaceutical Self-designed Experiment:Synthesis andCharacterization of 7-hydroxyethyl ChrysinJING Lin-lin(Department,Pharmacy of the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Shaanxi Xian 710061,China)Abstract:A self-designed experiment was designed to introduce water-soluble hydroxyethyl group into the moleculeof chrysin to synthesize 7-hydroxyethyl chrysin.The experiment involved using the new drug design theory to formulate theexperimental scheme,the synthesis method of ether compounds,filtration,washing,column chromatography purification,recrystallization and other steps.At the same time,the chemical structure and purity of the target product werecharacterized and detected by spectroscopy in the experimental design.The students could put the theoretical knowledge ofnuclear magnetic resonance,infrared spectroscopy,high-resolution mass spectrometry and high-performance liquidchromatography into practice,improve students independent research ability and scientific research innovation ability,soas to achieve the comprehensive goal of understanding of theoretical knowledge,mastering experimental skills anddeveloping of innovative thinking.Key words:pharmacy;self-designed experiment;7-hydroxyethyl chrysin;nucleophilic ringopening近年来,我国医药产业发展迅速,对高等院校药学专业的人才培养提出了新要求,创新型药学专业人才的培养已成为我国制药产业和医疗卫生事业发展的重要支1-2。药物化学是一门实践性很强的学科,实验课对于学生加深和巩固药学的基本理论和基本知识具有重要作用,使学生能够熟练掌握实验的基本操作,提高学生的动手能力,尤其是可促进学生发现问题、分析问题和解决问题能力的提高,为学生将来从事药物研究与生产提供实践基础3-5。但目前药学专业实验教学还存在如下矛盾,学生在实验过程中的主体性体现不突出,学生多是根据既定实验步骤按图索骥,被动地完成实验,独立思考的空间不足;实验内容较为传统,对开发和启迪学生创新思维的程度不足,学生发现问题及解决问题的能力训练不够充分。因此,为适应药学创新型人才培养的目标,亟需进行实验教学的改革探索6-8。白杨素(5,7-二羟基黄酮,Chrysin)是一种很有应用前景的黄酮化合物,广泛存在于植物、蜂胶、蜂蜜等天然产物中,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、神经保护和心血管保护等广泛的药理活性9。然而,由于白杨素溶解性差、代谢快、生物利用度低,限制了其在药物领域的应用10。因此,通过化学合成手段对白杨素进行结构修饰与改造,获得药理活性和理化性质都优异的分子,是获得新型候选药物的重要手段11。研究表明:在分子结构中引入羟乙基基团后可有效改善溶解性12。由此,本实验设计开展了 7-羟乙基白杨素(结构见图 1)的合成、表征与纯度检测的自主设计性学生实验,实验主要分为三个阶段,第一阶段涉及到利用新药设计理论来制定实验方案;第二阶段为实验的具体实施过程,包含合成 7-羟乙基白杨素需要用到的醚类化合物的合成方法,过滤、洗涤、柱层析纯化、重结晶等步骤。同时,实验设计中对目标产物的化学结构和纯度进行了波谱学表征,学生能够将对核磁共振、红外波谱、高分辨质谱、高效液相色谱的理论知识付诸实践,提升学生的自主探究能力和科研创新能力13;第三阶段为实验总结与反思阶段,强化学生对实验数据的分析处理,规范撰写实验报告,并第 51 卷第 9 期景临林:药学自主设计性实验:7-羟乙基白杨素的合成与表征165 提出实验中存在问题及改进方法。本文依据以学生为主体的教学理念,积极开展“自主设计性实验”课程,将以理论验证为主的观察性实验扩展为具有一定创新性的研究性实验14,以实现学生扎实理解理论知识、充分掌握实验技能、积极发展创新思维的综合目标。图 1 白杨素和 7-羟乙基白杨素的化学结构Fig.1 Chemical structure of chrysin and7-hydroxyethyl chrysin1 实 验1.1 实验目的通过 7-羟乙基白杨素的合成,了解新药设计的理念,学习亲核取代方法的原理和成醚反应的基本操作,掌握有机合成反应的主要影响因素;掌握用薄层层析法监测反应进程的操作;熟悉粗产物后处理的方法如过滤、洗涤、真空干燥、减压蒸馏等操作;熟悉产物的柱层析和重结晶的纯化方式、有机化合物化学结构的表征方法和基于 HPLC 的化合物纯度检测方法;了解核磁共振波谱仪、质谱分析仪、红外光谱仪和高效液相色谱仪等仪器的原理和基本操作。1.2 主要试剂与仪器试剂:白杨素(纯度95%),陕西慈缘生物技术有限公司;环氧乙烷(纯度99.0%)上海麦克林生化科技股份有限公司;氢氧化钠(NaOH)、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、盐酸均为国产分析纯;色谱乙腈、200 300 目柱层析硅胶,GF254 型高效薄层层析硅胶板。仪器:HWCL-3 集热式恒温磁力搅拌器、R-1001VN 旋转蒸发仪和 DL-400 循环冷却器,郑州长城科工贸有限公司;X-4B 显微熔点仪(温度计未校正),上海精科实业有限公司;ALPHA 红外光谱仪(溴化钾压片),德国 Brucker 公司;APEXII 型傅立叶变换离子回旋共振质谱仪,德国 Brucker 公司;APEX II 型傅立叶变换离子回旋共振质谱仪,德国 Brucker 公司;Ulimate 3000 超高效液相色谱仪,美国 Thermo 公司。1.3 实验方案1.3.1 实验合成路线和原理本实验以白杨素和环氧乙烷为原料,通过一步反应合成 7-羟乙基白杨素(合成路线和反应机理见图 2a),并进行结构表征和纯度检测。环氧乙烷是醚中比较特殊的化合物,由于存在大张力的三元环,性质较普通醚活泼地多。环氧乙烷开环反应在碱性条件下按照 SN2 反应机制进行的15,见图 2b。碱性条件下,白杨素以负离子的形式存在,直接带一个负电荷,可以直接对环氧乙烷中与氧相连的缺电子碳发动亲核进攻:进攻过程中,亲核试剂与碳原子间成新键,同时断开旧的 C-O 键。C-O 这根极性共价键断键时一对电子都被氧拿走,得到阶段性产物烷氧基氧负离子,继续酸化后生成醇类分子。图 2 7-羟乙基白杨素得合成路线(a)和反应机理(b)Fig.2 The synthetic route(a)and reaction mechanism(b)of 7-hydroxyethyl chrysin1.3.2 合成步骤将 5 g(20 mmol)白杨素,30 mL 水,0.3 g NaOH 加入到100 mL 三口烧瓶中,油浴锅中加热到 65,向反应体系中缓慢通入环氧乙烷(2.5 mL,50 mol)进入反应体系,用薄层层析(TLC)监测反应进程,展开剂比例为石油醚 乙酸乙酯(体积比)=3 2。1.3.3 产物后处理与纯化反应完毕后,将反应体系降至室温后,使用50 mL G3 砂芯漏斗过滤,滤饼依次用100 mL 水、100 mL 2M 稀盐酸和 100 mL水洗涤,除去未反应的白杨素并将少量钠盐产物酸化为 7-羟乙基白杨素,真空干燥后得 7-HEC 粗品,为黄色固体。装填硅胶层析柱(外径 80 mm,硅胶高度 10 cm),对产物进行柱层析纯化,流动相组成及比例为二氯甲烷 甲醇=100 1,得淡黄色固体,最后用甲醇为溶剂进行重结晶得黄色针状晶体 4.7 g,产率 79%,熔点:163 164。通过1H NMR、13C NMR、红外光谱和高分辨质谱对产物结构进行了表征;UPLC 检测产物纯度。2 结果与讨论白杨素分子结构中存在 5 位和 7 位两个酚羟基,在碱性条件下均能够与环氧乙烷发生亲核取代反应,理论上能够生成 5-羟乙基白杨素、7-羟乙基白杨素和 5,7-二羟乙基白杨素三个产物。由于 7 位酚羟基的活性显著高于 5 位酚羟基,反应过程中只检测到了 7-羟乙基白杨素和 5,7-二羟乙基白杨素两个产物。利用它们的活性差异16,通过对反应温度、时间以及环氧乙烷用量进行优化,可以使 7-羟乙基白杨素成为主要产物。2.1 环氧乙烷用量对反应产率的影响表 1 白杨素/环氧乙烷摩尔比对产率的影响Table 1 Effect of chrysin/ethylene oxide molar ratioonchemical yield序号白杨素 环氧乙烷(摩尔比)反应时间/h温度/产率/%11 15654821 25656131 2.55657661 356568固定反应温度 65 和反应时间为 5 h,白杨素与环氧乙烷摩尔比(1 1.5、1 2、1 2.5 和 1 3)对合成产率的影响如表图所示。结果表明,随着白杨素与环氧乙烷摩尔比的不断增大,7-HEC 的产率呈现先增加后降低的趋势,在白杨素与环氧乙烷摩尔为1 2.5 时其产率最高,而当两者的摩尔比的为 1 3166 广 州 化 工2023 年 5 月时,7-HEC 的产率反而下降,这与副产物 5,7-二羟乙基白杨素的生成量增加有关。因此,白杨素与环氧乙烷适宜摩尔比为1 2.5。2.2 反应温度对反应产率的影响温度是影响化学反应速度和化学平衡最重要的因素之一17。白杨素:环氧乙烷摩尔比 1 2.5 和反应时间 5 h,不同反应温度(25、45、65、85)对反应产率的影响见表2。结果表明,25 条件下反应几乎不进行,原料白杨素大量剩余,TLC 监测只有微量 7-HEC 生成,随着反应温度的升高,7-HEC 的产率呈上升趋势,在温度达 65 时,产率最大,继续升高反应温度导致 5,7-二羟乙基白杨素的生成增加,产率反而下降。因此,合成的适宜反应温度选择 65。表 2 反应温度对产率的影响Table 2 Effect of reaction temperature on chemical yield序号白杨素 环氧乙烷(摩尔比)反应时间/h温度/产率/%11 2.5525521 2.55454531 2.55657741 2.5585662.3 反应时间对反应产率的影响最后,探究合成 7-HEC 最佳反应时间。控制白杨素与环氧乙烷摩尔比为 1 2.5,反应温度为 65 ,不同反应时间(1 h,3 h,5 h,7 h)对产率的影响,结果如表3 所示:随着反应时间的延长,产率呈上升的趋势,且在反应 5 h 时产率最高,继续反应时间会导致副产物增加,产率降低。因此,7-HEC 合成的适宜反应时间为 5 h。表 3 反应时间对产率的影响Table 3 Effect of reaction time on chemical yield序号白杨素环氧乙烷(摩尔比)反应时间/h温度/产率/%112.516599%。图 4 7-HEC 的液相色谱图Fig.4 UPLC chromatogram of 7-HEC3 实验的组织与运行本设计性实验按照三个阶段完成。第一阶段:实验方案制定阶段。教师提前布置实验研究的第 51 卷第 9 期景临林:药学自主设计性实验:7-羟乙基白杨素的合成与表征167 题目,学生2 3 人为1 个实验小组,提供与完成实验相关的网络资源目录并辅导学生查阅专业文献,学生需充分了解黄酮类化合物的来源、分类、结构修饰方法和药理作用,自行制定实验目的、实验原理、操作步骤等内容,教师组织实验小组间进行讨论,相互交流补充,最终形成完整、可行性强的实验方案。这一过程能够很好地培养学生对信息加工、整理的能力,加深学生对科研工作中实验思路确定过程的理解。第二阶段:实验实施阶段。实验包括 7-羟乙基白杨素的合成、分离纯化、结构表征和纯度检测等内容,设计课时为16 学时(其中产物合成 6 学时,分离纯化和结构表征 6 学时,纯度检测 4 学时)。依托于学校教学开放实验室,由教师有序组织学生按照实验方案完成实验。实验过程中,教师严格要求学生规范操作,认真观察、注意细节,思考每一次过滤和洗涤的目的,针对实验中出现的问题,鼓励学生自己思考并设计解决方案,通过实验进行验证,督促学生做好各项实验的原始记录,强调实验结果的可信度,如果实验失败需分析原因并重新实施。同时,本实验需用到 NMR、HRMS、IR 和 HPLC 对产物进行结构表征和纯度检测,需要学生前期在仪器分析课上学习上述仪器的原理、仪器结构、应用范围等理论知识。另外,实验过程中教师强调实验安全注意事项,尤其是危险化学品的使用,要求学生提前熟悉实验中涉及到的各类化学品的安全性能,如环氧乙烷常温下是气体,沸点为 10.7 18,可以通过降低温度使其液化从而实现量取,使用的量筒和烧瓶需要放在-20 冰箱中预冷,实验操作时应在通风橱内进行并注意个人安全防护。第三阶段:实验总结与反思阶段。实验结束后,要求学生及时整理实验数据,对所记录的实验数据进行归纳和处理,分析讨论实验过程中出现的问题,要求每位学生独立完成实验报告,实验报告要层次清晰、图表规范、数据合理、分析准确,并提出实验中存在问题及改进方法。对于完成情况比较好的小组,教师可以让其分享实验设计的心得,大家交流讨论以及学习其好的做法。4 结 语本实验通过经典的 SN2 亲核取代反应,以白杨素和环氧乙烷为原料合成了 7-羟乙基白杨素。实验过程中学生能够学会气体原料的加料方法、抽滤、洗涤、减压蒸馏等基本操作,掌握薄层层析法监测反应进程和柱层析结合重结晶分离纯化产物等基本技能,实验中还包含利用 NMR、HRMS 和 IR 等图谱对产物结构进行分析与表征等内容,强化了学生对药物研发领域常用大型仪器原理、操作流程等的掌握程度,将理论课中学习的知识运用于实践中,对学生熟悉有机化合物结构鉴定和纯度检测方式起到较强的巩固作用。本实验较好地培养了学生细致观察、深入思考的能力,深化了对理论知识的理解,提升了实验操作技能,规范了科研操作,强化了团队协作精神,让学生真正成为实验教学的主体,增强其对科学研究的积极性、主动性和创造性,为学生以后从事相关工作扎实基础。参考文献1 刘伟,文秋林,林晓,等.以创新创业教育为突破口的药学专业人才培养体系综合改革探析J.广西医科大学学报,2022,39(2):341-344.2 樊陈琳,徐晓媛,于锋,等.药学教育转型发展与药师型人才培养体系建设的研究与实践J.中华医学教育杂志,2021,41(4):305-309.3 郭茂德.有机化学实验教学改革和学生创新能力培养分析J.云南化工,2018,45(10):249-250.4 陈贵华.科研与教学相融合的化学实验教学模式探讨 以有机制备实验为例J.西南师范大学学报(自然科学版),2021,46(1):179-182.5 赵志宇.中药化学课程实验教学改革探讨J.中国医药工业杂志,2021,52(7):986.6 叶向阳,惠子,何兴瑞,等.药物合成新技术课程“三位一体”人才培养模式教学改革与实践J.中国医药导刊,2022,24(6):577-580.7 张立秋,张晓燕,胡彦武,等.药学专业创新型与应用型人才分类培养模式的改革探索J.中国药房,2020,41(7):150-150.8 王永炎.学科理念的多元化与人才培养的多模式J.北京中医药大学学报,2022,45(5):539-540.9 Mani R,Natesan V.Chrysin:Sources,beneficial pharmacologicalactivities,and molecular mechanism of action J.Phytochemistry,2018,145:187-196.10 Dong 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