透明质酸-二氧化钛纳米颗粒...样硬化斑块治疗中的应用研究_曹正宇.pdf

岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期基金项目：国家自然科学基金资助项目（82100369）作者单位：中山大学孙逸仙纪念医院心血管内科（510120）*通信作者透明质酸-二氧化钛纳米颗粒介导的声动力在动脉粥样硬化斑块治疗中的应用研究曹正宇吴茂雄黄图城陈样新王景峰*摘要目的：探究透明质酸-二氧化钛纳米颗粒介导的声动力能否抑制小鼠动脉粥样硬化斑块的进展。方法：通过静电吸附法构建透明质酸-二氧化钛纳米颗粒（HATiO2NPs），并对其性质进行表征。ICP分析细胞摄取效率。CCK8及流式细胞术检测SDT诱导巨噬细胞凋亡。构建Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化斑块模型，并给予HATiO2NPs介导的SDT干预。通过H&E及油红O染色，分析动脉粥样硬化斑块面积变化。结果：成功构建HATiO2NPs。证实HATiO2NPs的细胞摄取率提高，其介导的SDT可诱导巨噬细胞凋亡（P0.05）。在动物模型中证实HATiO2NPs介导的SDT能抑制动脉粥样硬化斑块进展（P0.05）。结论：HATiO2NPs介导的SDT能有效抑制小鼠动脉粥样硬化斑块进展。关键词动脉粥样硬化；巨噬细胞；二氧化钛；透明质酸；声动力疗法DOI：10.3969/j.issn.1671301X.2023.01.003Hyaluronic AcidTitania Nanoparticles Mediated SonodynamicTherapyfor theTreatment of Atherosclerotic PlaqueCAO Zhongyu，WU Maoxiong，HUANG Tucheng，CHEN Yangxin，WANG JingfengDepartment of Cardiology，Sun Yatsen Memorial Hospital，Sun Yatsen University，Guangzhou，510120*Correspondence authorAbstractObjective：To investigate whether hyaluronic acidcoated titanium dioxide nanoparticlemediated sonodynamic therapy can inhibit the progression of atherosclerotic plaque.Methods：Hyaluronic acid titanium dioxidenanoparticles（HATiO2NPs）were constructed by electrostatic adsorption，and their properties were characterized.Theefficiency of cell uptake was analyzed by ICP.CCK8 and flow cytometry were used to detect apoptosis rate of macrophages induced by SDT.Apoe-/-mouse atherosclerotic plaque model was established，and HATiO2NPs mediated SDTintervention was administrated.The changes of the atherosclerotic plaque area were analyzed by H&E and Oil red Ostaining.Results：HATiO2NPs were successfully developed.It was confirmed that the cell uptake rate of HATiO2NPswas increased，and the SDT mediated by HATiO2NPs could induce apoptosis of macrophages（P0.05）.It was confirmed in animal models that HATiO2NPsmediated SDT could inhibit the progression of atherosclerotic plaque（P0.05）.Conclusion：HATiO2NPsmediated SDT can effectively inhibit the progression of atherosclerotic plaque in mice.Key wrodsAtherosclerosis，Macrophage，Titaniumdioxide，Hyaluronicacid，Sonodynamictherapy动脉硬化性心血管疾病是导致全球患者死亡的主要原因1。然而，目前临床上常用的治疗方法仍存在不足。例如，动脉内膜切除术通过侵入性的方式机械去除斑块，可能诱发血栓形成。他汀类药物被用于降低血胆固醇水平，需要较长时间才能实现病变消退。因此，我们迫切需要一种高效、无创的方式，靶向干预动脉粥样硬化斑块。巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块中最重要的细胞成分之一，可在局部增殖导致斑块迅速增大2。因此，靶向清除斑块内巨噬细胞是治疗动脉粥样硬化斑块的一项有力策略3。声动力疗法（Sonodynamictherapy，SDT）是一种基于超声的非侵入性靶向治疗方式。通过局部超声辐照，声敏剂可以在细胞内产生活性氧，进而诱导靶细胞凋亡4。二氧化钛（Titanium dioxide，TiO2）作为一种经典的无机声敏剂，具有较高的化学稳定性和优异的声动 8岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期力性能。然而，TiO2缺乏细胞靶向性严重限制了其研究与应用。因此，本研究基于透明质酸（Hyaluronicacid，HA）的巨噬细胞靶向性，设计了透明质酸功能化的 TiO2纳米声敏剂（HATiO2nanoparticles），并探究了HATiO2NPs介导的SDT对动脉粥样硬化斑块作用效果。1材料与方法1.1实验材料HA、TiO2纳米颗粒（上海阿拉丁生 化 科 技 股 份 有 限 公 司）；小 鼠 巨 噬 细 胞 系RAW264.7（ATCC 细胞库）；Apoe-/-小鼠（江苏集萃药康生物科技有限公司）；CCK8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM、FBS（ThermoFisher Scientific）；流式凋亡试剂盒（BectonDickinson）。1.2HATiO2NPs的制备与表征基于静电吸引法制备 HATiO2NPs。在剧烈搅拌下，加入 1 mL0.1%（w/v）的透明质酸溶液，以 10 1（w/w）的比例与 TiO2NPs 分散。采用纳米粒度及 Zeta 电位仪检测动态光散射（Dynamic light scattering，DLS）及Zeta电势。1.3细胞培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基进行培养，每 2-3 天传代一次。细胞均培养于37、5%CO2环境中。1.4CCK8将细胞均匀接种于96孔板中，不同实验处理后，加入10 l CCK8溶液，孵育1小时，用酶标仪检测，记录450 nm处的吸光度。1.5流式细胞术检测细胞凋亡细胞加入无EDTA胰蛋白酶消化，离心重悬细胞沉淀，细胞悬液中加入5 l Annexin VFITC 和 5 l PI 染料，采用 BectonDickinson 流 式 细 胞 仪 检 测 样 品，BDFACSDiva软件分析处理数据。1.6小鼠动脉粥样硬化斑块模型的建立动物实验均已经过中山大学实验动物伦理委员会批准（SYSUIACUC2021B0336）。5 周龄雄性 Apoe-/-小鼠于中山大学实验动物中心屏障环境饲养，湿度 50%-60%，温度 20-26，12 h/12 h 光照与黑暗周期，给予高脂饲料喂养 12 周（胆固醇 1%，脂肪16%），建立小鼠动脉粥样硬化斑块模型。1.7SDT干预方案取TiO2NPs或HATiO2NPs孵育巨噬细胞（n=3）。将超声换能器置于细胞培养皿下方行超声进行SDT干预。干预结束后将细胞置于恒温箱内继续培养。选取成模小鼠，根据小鼠体重随机分组（n=7），尾静脉注射 TiO2NPs 或 HATiO2NPs（10 mg/kg体重），麻醉小鼠，将超声探头紧贴小鼠胸部，予超声辐照，SDT干预后继续饲养。1.8油红O及HE染色实验干预2周后，取主动脉根部动脉粥样硬化斑块组织，多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片，动脉粥样硬化斑块组织进行HE 染色。显微镜下观察并拍照，通过HE 染色计算动脉粥样硬化斑块面积。分离小鼠主动脉，进行大体油红 O 染色，观察并拍照分析阳性面积百分比。1.9统计分析细胞实验样本量每组 3 例（n=3），动物实验样本量每组7例（n=7）。计量资料以均数标准差表示。两组间比较用独立样本 t 检验，多组间比较用单因素方差分析或双因素重复测量方差分析，用Tukeys，Dunnetts或Bonferronis进行组间比较，P0.05认为有统计学差异。实验数据通过Graphpad Prism 7.0软件进行统计学分析。2结果2.1HATiO2NPs 的性质表征如图 1 所示，TiO2NPs 的平均粒径为（25.623.53）nm，Zeta 电位为-（16.132.42）mV。经过HA功能化修饰后，HATiO2NPs 的平均粒径为（47.367.18）mm，Zeta 电位为-（25.26 3.56）mV。提 示 HA 成 功 包 裹 于TiO2NPs表面。2.2HATiO2NPs的细胞摄取与毒性分析我们采用电感耦合等离子体测试巨噬细胞内Ti元素含量。如图2所示，采用100 g/ml 纳米颗粒孵育巨噬细胞 4 小时后，HATiO2NPs 组中细胞内 Ti 含量显著高于TiO2NPs组 （1.750.10）vs（1.090.13），P0.01。该结果提示，HATiO2NPs具有更好的巨噬细胞靶向性。此外，CCK8检测结果表明，随着TiO2NPs与HATiO2NPs浓度的升高，巨噬细胞存活率逐渐下降。当 TiO2NPs 浓度为 100 g/ml 时，巨噬细胞存活率显著下降（76.08%9.85）%，与对照组相比，P0.05。该结果提示 HA 修饰后，HATiO2NPs具有更好的生物相容性。2.3HATiO2NPs 介导的 SDT 诱导巨噬细胞凋亡如图 3 所示，随着超声强度与超声辐照时间的增加，巨噬细胞存活率逐渐下降。采用 1.0 W/cm2，60 s 的超声参数进行后续实验，通过流式细胞术检测不同组细胞凋亡百分比。结果同样证 9岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期实，SDT 干预后，巨噬细胞凋亡水平升高约 20%（相比于对照组P0.001）。该结果表明，SDT通过超声与声敏剂发挥协同作用杀伤靶细胞，具有良好的靶向性与安全性。2.4HATiO2NPs 介导的 SDT 抑制小鼠动脉粥样硬化斑块进展在建立小鼠动脉粥样硬化斑块模型后，给予小鼠 SDT 干预（每 2 天一次，重复 3次）。2周后取主动脉根部及胸主动脉进行检测。如图4所示，HATiO2NPs组主动脉根部斑块面积相比于对照组减小了约159103m2（P0.05），胸主动脉油红O阳性面积百分数减小了约6.2%（P0.05）。同时，单纯超声及单纯HATiO2NPs组病变面积没有明显改变。2.5HATiO2NPs的生物安全性分析为进一步图1TiO2NPs与HA-TiO2NPs的性质表征。A：DLS结果；B：Zeta电位结果120100806040200G（d）TiO2NPsHATiO2NPs1101001000Diameter（nm）TiO2NPsHATiO2NPs100-10-20-30-40Zeta potential（mV）A AB B图2TiO2NPs与HATiO2NPs的细胞摄取与毒性分析。A：细胞内Ti元素含量；B：细胞存活率。ns,无统计学差异；*P0.05,*P0.01。2.01.51.00.50.0Ti content（g/106cells）TiO2NPsHATiO2NPs050100500TiO2NPsHATiO2NPs150100500A AB B*Cell viability（%）200Concentration（g/mL）ns*HATiO2NPsA AC CQ20.51*3020100Apoptosis rate（%）ControlUltrasoundSDTQ11.07Q319.1Q479.3100101102103104105105104103102101100Q21.28Q12.67Q34.68Q491.4100101102103104105105104103102101100Q20.99Q13.98Q34.47Q490.6100101102103104105105104103102101100Q20.41Q13.76Q30.93Q494.9100101102103104105105104103102101100Annexin VPI150Cell viability（%）100500B B06030120Time（s）0 W/cm20.5 W/cm21.0 W/cm21.5 W/cm2图3HATiO2NPs介导的SDT诱导巨噬细胞凋亡。A：细胞存活率；B：流式细胞术检测凋亡；C：细胞凋亡率统计图。*P0.001。10岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期评估HATiO2NPs的生物安全性，我们对注射HATiO2NPs后小鼠的体重及血常规进行了检测。如图5所示，HATiO2NPs不会对小鼠的体重及外周血细胞计数产生显著影响。6004002000Plaque area（103m2）*2520151050Oil red O positive area（%）HATiO2NPsControlUltrasoundSDTHATiO2NPsControlUltrasoundSDTHATiO2NPsControlUltrasoundSDTA AB BC CD D图4HA-TiO2NPs介导的SDT抑制小鼠动脉粥样硬化斑块进展。A：主动脉根部H&E染色结果；B：斑块面积统计结果；C：主动脉油红O染色结果；D：油红O染色阳性面积百分比。标尺=0.1 mm。*P0.05。图5HATiO2NPs的生物安全性分析。A：小鼠体重变化；B：血常规结果。ns:无统计学差异。3432302826Body weight（g）0Time（wk）HATiO2NPsA AConrtol12345151050Count（1012/L）nsRBC2.01.51.00.50.0Count（109/L）nsWBC0.80.60.40.20.0Count（1012/L）nsPLTB BC CD D3讨论本研究设计了一种基于TiO2纳米颗粒的新型声敏剂。采用 HA 包裹 TiO2NPs，赋予了声敏剂巨噬细胞靶向性。通过细胞及动物实验，证实了HATiO2NPs 介导的 SDT 能够诱导巨噬细胞凋亡，进而抑制小鼠动脉粥样硬化斑块进展。TiO2是近年来SDT领域的研究热点。在超声激活下，TiO2发生电子空穴分离，与周围的水或氧分子反应产生活性氧5。相比于传统声敏剂，TiO2纳米颗粒介导的SDT能产生更多单线态氧6。但TiO2在动脉粥样硬化领域的应用少有研究。本研究证实基于TiO2新型声敏剂在动脉粥样硬化斑块治疗领域显示出了良好的应用潜力。HA是细胞外基质重要组成部分，具有优良的生物相容性和生物可降解性，在无机材料的表面修饰中广泛应用7。研究发现，在促炎型巨噬细胞中显著高表达跨膜糖蛋白 CD44，其可以与 HA特异性识别并结合8。有研究者设计了一种 HA纳米颗粒，实现了动脉粥样硬化斑块的精准PET/MRI 成像9。因此，本研究中我们采用 HA 包裹TiO2NPs，构 建 了 具 有 巨 噬 细 胞 靶 向 性 新 型 声敏剂。综上所述，HATiO2NPs 介导的 SDT 是一种具11岭南急诊医学杂志2023年2月第28卷第1期有潜力的，针对动脉粥样硬化斑块精准干预的新型疗法，具有广阔的转化应用前景。参考文献1 Wolf D，Ley K.Immunity and Inflammation in Atherosclerosis J.Circ Res，2019，124（2）：315.2 Robbins CS，Hilgendorf I，Weber GF，et al.Local proliferation dominates lesional macrophage accumulation inatherosclerosis J.Nat Med，2013，9（9）：1166.3 Chen W，Schilperoort M，Cao Y，et al.Macrophagetargeted nanomedicine for the diagnosis and treatment ofatherosclerosis J.Nat Rev Cardiol，2022，19（4）：228.4 Son S，Kim JH，Wang X，et al.Multifunctional sonosensitizers in sonodynamic cancer therapy J.Chem SocRev，2020，49（11）：3244.5 Gong F，Cheng L，Yang N，et al.Ultrasmall OxygenDeficient Bimetallic Oxide MnWOX Nanoparticles forDepletion of Endogenous GSH and Enhanced Sonodynamic Cancer TherapyJ.Adv Mater，2019，31（23）：e1900730.6 Liang S，Deng X，Xu G，et al.A Novel PtTiO2Heterostructure with OxygenDeficient Layer as Bilaterally Enhanced Sonosensitizer for Synergistic ChemoSonodynamic Cancer Therapy J.AdvFunct Mater，2020，30（13）：1908598.7 Lei C，Liu XR，Chen QB，et al.Hyaluronic acid and albumin based nanoparticles for drug deliveryJ.J Control Release，2021，331：416.8 Hagg D，Sjoberg S，Hulten LM，et al.Augmented levels of CD44 in macrophages from atherosclerotic subjects：a possible IL6CD44 feedback loop J?Atherosclerosis，2007，190（2）：291.9 Beldman TJ，Senders ML，Alaarg A，et al.HyaluronanNanoparticles Selectively Target PlaqueAssociated Macrophages and Improve Plaque Stability in AtherosclerosisJ.ACS Nano，2017，11（6）：5785.（修回日期：2023年01月10日）化物酶和硫氧还蛋白，发挥抗氧化应激的作用6-8。本研究证实了红景天甙显著改善复苏后大鼠心功能，但具体机制尚未明确，需待进一步研究。本研究还发现红景天甙可显著改善复苏后大鼠的微循环，阻止复苏后“无复流现象”。心脏骤停复苏后，心肌细胞缺血和再灌注损伤而出现肿胀。心肌细胞毒性和组织性水肿，可引起“无复流现象”。而既往研究已经证实改善复苏后心肌微循环，可显著改善复苏后心功能。本研究采用监测复苏后大鼠舌下微循环的方法，证实红景天甙可显著逆转这一恶性循环，从而改善复苏后心功能。综上所述，红景天甙通过改善复苏后“无复流现象”，减轻心肺复苏后心功能不全的严重程度，为其临床应用提供转化医学证据。参考文献1 Girotra S，van Diepen S，Nallamothu BK，et al.Regional Variation in OutofHospital Cardiac Arrest Survivalin the United StatesJ.Circulation，2016，133（22）：2159.2 杨可慧桑，潘畅，徐峰，陈玉国.心脏骤停与复苏调查的现状及展望 J.中国实用内科杂志，2019，39（10）：842.3 Zhu Z，Li J，Zhang X.Salidroside protects against oxLDLinduced endothelial injury by enhancing autophagymediated by SIRT1FoxO1 pathwayJ.BMC complementary and alternative medicine，2019，19（1）：111.4 Xue H，Li P，Luo Y，et al.Salidroside stimulates theSirt1/PGC1alpha axis and ameliorates diabetic nephropathy in mice J.Phytomedicine：international journal ofphytotherapy and phytopharmacology，2019，54：240.5 Liang L，Zhang G，Li H，et al.Combined Therapy WithPolyethylene Glycol20k and MCC950 Preserves PostResuscitated Myocardial Function in a Rat Model of Cardiac Arrest and Cardiopulmonary ResuscitationJ.J AmHeart Assoc，2021，10（9）：e019177.6 Zhu Z，Li J，Zhang X.Salidroside protects against oxLDLinduced endothelial injury by enhancing autophagymediated by SIRT1FoxO1 pathwayJ.BMC complementary and alternative medicine，2019，19（1）：111.7 Chang X，Zhang K，Zhou R，et al.Cardioprotective effects of salidroside on myocardial ischemiareperfusioninjury in coronary artery occlusioninduced rats and Langendorffperfused rat heartsJ.International journal ofcardiology，2016，215：532.8 Mao GX，Xu XG，Wang SY，et al.Salidroside DelaysCellular Senescence by Stimulating Mitochondrial Biogenesis Partly through a miR22/SIRT1 PathwayJ.Oxidative medicine and cellular longevity，2019，2019：5276096.（修回日期：2023年02月01日）（上接第3页）12