五节微生物中的转座因子.doc

第五节 微生物中的转座因子
转座因子（transposable element，TE）是一类广泛存在于细菌、病毒和真核生物DNA分子中一段可自主改变自身座位的DNA片段，它可以在同一细胞内DNA复制子间转移，也可以在一个复制子内部转移。
转座因子是20世纪40年代由Barbara McClintock在进行玉米的遗传学研究时首先发现的，她因此而荣获了1983年度的诺贝尔奖。尔后在细菌中得到了广泛和深入的研究。
转座因子的共同特征是：插入寄主DNA后，导致基因失活；插入时在靶DNA位点产生一个短的正向重复顺序。
一 转座子的发现和分类
转座因子：是基因组内一段相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转（transposition）。
转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）。
转座子的转座特点（1） 基因组内移动； （2） 不依赖于供体与受体间的序列关系； （3） 一般仅移动转座子序列本身。
根据转座因子的转座机理，将转座因子分为两类：
第一类是DNA转座子(DNA transposon)，其转座过程是从DNA→DNA，这类转座因子存在于原核生物和真核生物中，如细菌的转座子和插入序列；
第二类是反转座子(retrotransposon)，其转座过程是以RNA为中间体，即从DNA→RNA→cDNA → DNA转座。
二、 细菌转座因子的类型和结构
细菌转座因子分为四个类型：插入序列（insertion sequence，IS）转座子（transposon，Tn）转座噬菌体（Mu）
接合型转座子
一）、插入序列
插入序列也称IS因子，它是最简单的转座因子。 IS因子的长度一般为0.7-2.5 kb。
n 最简单的转座因子，不含任何宿主基因的可转座的DNA序列（insertion sequences, IS）。
n IS元件是独立的结构单位，每个元件只编码为自身转座所需要的蛋白质。
n IS元件的末端为短的反向末端重复序列（inverted terminal repeats）。
插入序列的结构有以下3个特点：
① 在IS的两端含有长度为10～40bp反向重复序列（inverted repeat sequence，IR），两端的反向重复序列在IS的切割和DNA链转移中起作用。
② 大多数IS都含有一个编码转座酶（Transposnase 简称Tnp）的长编码区，其启动子位于一端的反向重复序列之内，而刚好终止于另一端的反向重复序列之前或之内。
转座酶负责识别切割转座子的两端以及在靶位点造成切口。有些IS含有2个或2个以上的开放阅读框架，它们除编码转座酶外，还编码用于调控转座酶活性的调节蛋白。
③ 在IS插入时，在靶DNA位点产生一个短的、长度一般为3-9bp正向重复顺序(direct repeat sequence，DR)，分布在IS的两侧。
n 插入位点一般是随机的，很少是位点专一的。
n 转座是罕见事件，与自发突变率处于同一数量级，约为每代10-6一10-7。插入片段精确切离后，可使IS诱发的突变回复为野生型，但这种概率很低，每代只有10-6一10-10。不精确切离可使插入位置附近的宿主基因发生缺失。

二）、细菌转座子
几乎就在发现IS因子的同时，微生物学家和遗传学家注意到细菌中某些对抗抗生素的基因能从一种DNA分子转移到另一种DNA分子。因此，将带有抗性基因并能在不同的DNA分子之间移动的遗传单位叫做细菌转座子(bacterial transposon，Tn)。Tn分子一般在2000~25000 bp，两端反向重复序列
Tn与IS的主要区别是携带与转座无关的药物抗性或其他特性的基因。Tn一般具有抗生素抗性的基因，因为这些基因容易鉴别，故研究得较为广泛和深入。
n 某些Tn的反向重复序列是已知的IS，带有IS的Tn也称为复合型转座子，如Tn5、Tn10、Tn903
n 不含有IS的Tn称为简单转座子，如Tn3
n 没有IS序列，体积庞大的转座子称为TnA家族
细菌抗药性转座子一般可分为两类：复合转座子 (composite transposon) 复杂转座子 (complex transposon)
1.复合转座子：复合转座子是由两个完全相同或类似的插入序列IS和某种抗药性基因组成的复合因子，IS作为Tn的两个臂或称两个末端，两个IS在Tn中做正向或反向排列。在这类转座子中，IS可以带动整个Tn的转座，也可单独进行转座。

上表是一些复合转座子的基本特征，可以看出，Tn9、Tn903和Tn1681中两个IS完全相同，而Tn10的左臂(1S10L)和右臂(IS10R)之间有2.5％的碱基序列差异，不过IS10L和IS10R的末端反向重复序列是完全相同的。
一般来说，一个IS结构单位能转座它本身或整个转座子。当一个复合转座子的两个IS不同时，该转座的转座子主要依靠其中一个IS的功能(如Tn10中的IS10R和Tn5中的IS50R)；当两侧IS完全相同时，其中任何一个都能行使该复合转座子转座的功能。
2. 复杂转座子(TnA转座子)
三）、细菌转座因子的插入机制、转座模型
转座因子不同于噬菌体和质粒，它们不是独立的复制子，不能独立存在。所有转座因子，包括插入序列、复合转座子、TnA等的转座机制都很相似。
转座模型
Ø 根据转座子在转座过程中是否复制而分为两种类型：非复制型转座和复制型转座；
Ø 根据转座过程中是否有共整合体可分为：剪-贴型转座、保守型转座和复制型转座等。
剪-贴型转座（cut and paste transponsition）：它是一种简单的插入，是一种非复制型转座。在该过程中转座酶识别转座因子的两个末端并进行平端切割，完整的转座因子从供体DNA中释放出来。同时转座酶在特殊序列（一般为5-9碱基对）的靶DNA部位进行交错切割，然后转座因子与靶部位的切口末端相连接。
复制型转座（replicative transpositon）：是指在转座过程中供体分子上的转座子首先被转座酶在其两端交错切开，使转座子DNA链两端都带有游离的3’-OH末端，同时也对靶位点的两条链进行交错切割。
然后转座子DNA上的3’-OH分别与靶DNA链上的5’-磷酸基团连接而产生一种交叉结构，其交错末端都含有单链区，该单链区为DNA的合成提供了模板，称为假复制叉（pseudoreplication fork）。
如果复制从两个单链区继续进行，则形成两个拷贝的转座子。此时，供体和受体形成的结构称为共整合体（cointegate），即两个或两个以上的复制子通过共价键连接在一起。
l 在复制型转座过程中，转座子被复制，一个拷贝仍保留在原来的位置上，另一个拷贝则插入到新的位点上，这种类型的转座伴随着转座子拷贝数的增加。
l 另外，在转座过程中有共整合体的出现。同时，复制型转座涉及到两种类型的酶：一种是转座酶，它作用于原位点的转座因子的两端序列；另一种是解离酶（resolvase），它作用于复制拷贝的拆分。
保守型转座（conservative transposition）：为非复制型转座。在转座过程中也有交叉结构的出现，但不形成共整合体。在转座过程中，转座酶对转座子两端及靶位点进行交错切割，然后供体和靶链在切口处连接，从而产生一种交叉结构。接着，转座酶通过交错切割，将转座子从供体分子上切割下来。反应的结果为转座子被插入到受体的靶位点DNA中，并且其两侧为由原来的单链切口所产生的重复序列。
非复制型转座：转座子的切除导致了双链断裂的产生，在绝大多数情况下，转座子被切除后留下的两个断裂末端是通过末端连接修复的。
四）、Mu噬菌体的转座
转座噬菌体是具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体。这类噬菌体不论是进入裂解循环还是处于溶源状态，均可整合到寄主染色体上。其中研究得较多的是Mu噬菌体。
Mu噬菌体(mutator phage)，即突变者的意思，是由Taylor在1963年发现的一种大肠杆菌的温和噬菌体。
但它不同于一般的温和噬菌体：
1) Mu DNA几乎可插入到宿主染色体的任何一个位点上，而一般的温和噬菌体在宿主染色体上有特定插入位点，如λ噬菌体。
2) Mu噬菌体DNA的两端没有黏性末端，插入到基因中引起该基因突变。说明它的整合方式不同于λ噬菌体，而类似于转座因子的作用。当Mu噬菌体发生转座插入到宿主染色体上时，可像其他转座因子一样引起突变。
与IS因子和转座子相比较，转座噬菌体Mu具有以下两个优点：①它不是细菌基因组的正常组分，因而易于识别；
②它可经诱导产生，易于制备。
五）、细菌接合型转座子
Ø 不具有反向重复序列；
Ø 在转座时不引起靶DNA上核苷酸序列产生正向重复；
Ø 转座过程通过“切除-插入”机制实现；
Ø 转移过程中形成共价、闭合、环状的中间体；
Ø 在同一个细胞中的不同DNA位点进行整合或是通过接合作用进入受体细胞后整合到受体细胞的DNA上。
Tn916有24个ORF，可分为转座区（Tn）、转移区（Tra）和抗性区（Tetr）
转移机制：
转座子从染色体上切割下来，形成共价、闭合、环状的转座中间体；
中间体在同一细胞内的不同DNA位点进行整合或向其它细胞转移：中间体双链DNA的一条单链上产生缺口，并以单链DNA向受体细胞转移，转移完成后再行环化，然后以供体和受体细胞中的单链为模板进行复制形成双链，环状双链DNA分子再分别整合到供体和受体细胞的染色体上。
接合型转座子综合了转座子、质粒、噬菌体三方面的特征，是真正的基因转移因子，能引起抗性基因在许多重要细菌中的扩散。
Ø 接合型转座子在切割和整合上类似于转座子，但其机理不同于典型的转座子如Tn5、Tn10：接合型转座子可以形成ccc中间体，且整合部位不产生正向重复序列；
Ø 与质粒相似，都能形成ccc转移中间体，靠接合作用转移，但不能独立复制；
Ø 切割和整合上类似于温和噬菌体，其整合酶属于λ整合酶家族，不同的是不形成病毒颗粒，不依赖于噬菌体进行转移。
三、 细菌转座因子的遗传效应和应用
一）、转座因子的遗传效应
转座因子能引起许多遗传变异，如插入突变和基因重排等。
1.插入突变：各种IS、Tn都可以引起插入突变。当它们插入到一个基因时，该基因的功能受到破坏，其表型和一般突变体相同，如营养缺陷型、酶活性丧失等。另外，由于Tn总是带有抗药性基因，所以转座子插入后除能引起基因突变外，还具有转座子带来的抗药性。
2.DNA重排(缺失、倒位和扩增)：几乎所有的转座因子都能促进它们相邻基因的缺失。当转座因子插入某一基因后，一方面引起该基因的失活，另一方面也引起插入部位邻近片段的不稳定而产生缺失。
缺失：当转座子以相同方向转座到邻近位置上，在两个正向重复转座因子之间发生同源重组，就导致宿主染色体DNA缺失。
倒位：当转座因子以相反方向转座到邻近位置上，然后发生重组，则引起染色体DNA倒位。
扩增：转座子之间的同源重组，可使两个不同的DNA片段连接在一起，从而引起DNA的扩增。使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，形成一个操纵子或表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。
3.极性效应
当转座因子插入到一个操纵子的上游基因时，不仅能破坏被插入的基因，而且也能大大降低位于远离启动子一端的基因的表达。
现已发现绝大多数转座因子都有极性效应，而且正、反向插入都有这种现象。几乎所有IS的可阅读框内(除IS1外)，都含有依赖于Rho的转录终止信号和终止密码子，这是造成极性突变的根本原因。
极性效应：一个转录单位中的一个无义突变能抑制转录单位中随后基因的转录。
二）、转座子的应用
转座子通常在一些被称为靶序列(target sequence)的特定序列上插入，这些短序列在基因组上的排列是相对随机的，它的插入导致被插入基因的突变。因此，可以利用转座子的这一特性进行基因诱变。
用于诱变的转座子一般都是复合型转座子，如：Tn5、Tn9、Tn10等，其中用的较多的是Tn5和Tn10。它们的转座频率高，对目标序列特异性要求低，而且转座子不需要与细菌的基因组存在同源性等优点，因而被广泛用于许多革兰阴性菌的转座诱变中。利用转座子可进行随机诱变和定位诱变。
1.随机诱变
因为转座子不像质粒那样能独立存在并自主复制，因此要利用转座子进行诱变时需要先将转座子构建在适当的载体上，通常所用的载体主要是质粒。
转座子载体应具有下面两个功能：
①能通过转化或接合作用导人受体菌
②在受体菌中不能自我复制，为自杀型质粒载体，以使转座子存在转座压力，保证通过抗性筛选得到的转化子或接合子都含有转座子。
2.定位诱变
Ø 定位诱变与随机诱变的原理类似，但诱变中首先需要将转座子，如Tn5，整合在基因组上。
Ø 将要诱变的目的基因克隆到质粒如F质粒上。
Ø 将含有目的基因的F′质粒转入基因组已整合有Tn5的大肠杆菌中，再与受体菌杂交进行诱变，最后筛选突变型接合子。
3 利用Tn5-mob质粒载体研究质粒功能
四、 酵母中的转座因子
酵母转座子Ty（Transposon yeast）与果蝇中的转座子及反转录病毒原病毒类似，能插入染色体的许多位点，在插入的Ty两端靶基因产生5bp 重复。Ty的转座效率比细菌转座子要低，约为10-7-10-8。
酿酒酵母中只有Ty因子，而无其它种类的转座子。
酵母菌是低等真核生物，其转座子类似于细菌转座子。酵母转座子中研究较清楚的是Ty类转座子：如TY1和TY917。
TY结构：含约5.6 kb中心区，都有分布于两端的340 bp的同向重复序列(称为δ)，其作用与IS、Tn中的反向重复序列类似。
每个单倍体酵母基因组有30-35个TY，及至少100个单一的δ因子(solo δ elements)。
Ty1转座因子是通过一种RNA 中间产物进行的。首先以其DNA 为模板合成一个拷贝的RNA；然后再通过反转录合成一条新的Ty1因子；最后这条新的Ty1转座子再插入到新的位点上
一）、Ty因子在酵母基因组中的分布情况
酿酒酵母中有5类反转座子，即Ty1-Ty5，Ty插入占整个基因组的3.1%，其中主要是单个LTR（solo LTR），是由于LTR-LTR间的重组使Ty中间区缺少后产生的。
二、Ty因子的分子结构和转录
n 酵母中5类转座子的结构基本相同，每一结构单位约6.3kb，两端是约330bp的长末端正向重复序列LTR，中间是2个ORF---TyA和TyB；
n TyA类似于反转录病毒的gag，编码结构蛋白，如核酸结合蛋白（NA）； TyB类似于pol，编码参与反转录的酶蛋白，如蛋白酶、整合酶、反转录酶、RNase等。
n Ty因子从左侧LTR结构的启动子内开始转录，转录出两种mRNA：5kb、5.7kb（终止于右侧的LTR内）。
n TyA和TyB以两种方式表达：TyA蛋白代表TyA可读框；TyB只有连接蛋白（ TyA-TyB ）的一部分被表达。
Ty因子与反转录病毒非常相似
（1）二者之间的分子结构非常相似，如均有长末端重复序列LTR；它们转录和翻译的方式也很类似。
（2）转座是由Ty因子内的基因控制的，且要经过一个RNA阶段。
（3）虽然Ty因子不产生感染颗粒，但在经诱导发生转座的细胞中存在着Ty病毒样颗粒（VLPs,Virus-like particles）
（4）仅有某些Ty因子在任何酵母基因组中都有活性，大部分没有转座能力，此和惰性的内源性前病毒相似。
（5）反转录病毒首先被观察到的是以传染性病毒颗粒的形式存在，并能在细胞间传播；而反转座子是被当作基因组中的一部分而被发现的，它们可以在基因组内进行转座，但不能在细胞间迁移。
三）、Ty因子的转座机制：DNA RNA DNA

四）、Ty因子转座的遗传效应
1. 插入失活
2. 增强效应 有些Ty因子中含有增强子顺序所致
3. DNA重排
Ø 切离：Ty因子切离后，在原插入位点仍留有LTR顺序，这是由于其两端的LTR间发生了正反交换。
Ø 缺失：两个Ty因子之间发生正反交换，造成基因缺失。
Ø 转位（translocation）：1号染色体上的Ty912与3号染色体上的Ty912之间发生正反交换，除了在理论上可能产生的致死突变外，还发生了一条染色体上Ty912旁边的一段染色体转位到另一染色体上Ty912因子的旁边。
Ø 倒位