显微荧光光谱采集系统的设计与可行性分析.pdf

第38 卷第3期2023年6 月光电系统光电技术应用ELECTRO-OPTIC TECHNOLOGY APPLICATIONVol.38,No.3June,2023显微荧光光谱采集系统的设计与可行性分析杜宪烜,陈和,郭磐,张寅超,陈思颖（北京理工大学光电学院，光电成像技术与系统教育部重点实验室，北京）摘要：显微荧光光谱采集常使用价格高昂的增强电荷耦合器件（ICCD)作为光探测器，为了增强快速采集信号的能力并控制成本，围绕多通道阳极光电倍增管（PMT)线阵探测器的使用需求，设计了一种可见光波段工作的显微荧光光谱采集系统。包括激光激发、物镜聚焦和采集、荧光传输等结构，并最终耦合至光纤接收信号。通过显微物镜及荧光光学系统性能分析，以及结合线阵PMT探测器特性的信噪比分析计算，在激发光源使用波长36 0 nm，功率为2 0 mW的紫外激光时，激光光斑在3.4m包围圆范围内包含8 0%以上的能量。采集范围超过5m时可获取90%以上的荧光辐射能量。采集积分时间为0.2 ms时信噪比超过10，能够得到强度足够的信号，满足显微荧光光谱采集的需求。关键词：显微光路；系统设计；光电倍增管阵列；仿真模拟；信噪比计算中图分类号：0 433.4Design and Simulation of Micro-fluorescence Spectra Detection System(Photoelectronic Imaging Technology and System Laboratory,School of Optics and Photonics,Abstract:In order to reduce the cost and enhance the ability to quickly collect signals,a falling down opticalpath spectra detecting system is designed around the use of multi-channel anode photomultiplier tube(PMT)to ob-tain micro-fluorescence spectra.Including laser excitation,objective lens focusing,fluorescence transmission and fi-ber coupling,the design and simulation of the system is presented.The simulation results are estimated through theoptical performance and the digital analysis of the system,also the characteristics of the working PMT.The resultsshow that,when the excitation power is a 20 mW ultraviolet laser(360 nm),the energy concentration of the sur-rounding circle exceeds 80%within 3.4 m.The acquisition power reaches 90%when the detection area outweighs5 m.The signal to noise ratio(SNR)at a 0.2 ms collecting integration surpasses 10,which indicates a signal withsufficient intensity being obtained to meet the requirements of micro-fluorescence spectra acquisition.Key words:microscopy optical path;system design;photomultiplier linear array;analog simulation;sig-nal-o-noise ratio simulation显微荧光光谱分析仪是生命科学领域中重要的研究工具，广泛应用于细胞生物学、微生物研究、环境科学乃至临床医学等与人类健康息息相关的领域中1-=。显微荧光分析仪由显微光路和荧光采集两部分组成。显微光路常使用暗场显微镜或组成显微镜结构的透镜组，荧光采集装置常采用价格不菲的增强电荷耦合器件(ICCD)4。收稿日期：2 0 2 2-12-2 8基金项目：国家自然科学基金（6 150 50 0 9）文献标识码：ADU Xianda,CHEN He,GUO Pan,ZHANG Yinchao,CHEN SiyingBeijing Institute of Technology,Beijing,China)文章编号：16 7 3-12 55(2 0 2 3)-0 3-0 0 30-0 6构，但图像采集器件ICCD的性能限制了显微荧光分析仪在某些场景下的应用。例如,ICCD启用制冷装置理论上能达到单光子检测的灵敏度，但制冷装置体积较大，会限制系统整体的体积和质量5；ICCD对微米级样品的图像或光谱采集频率为75%40 x380 nm:95%99%第3 8 卷路成像点列图。模拟激光通过物镜后聚焦的弥散斑。物方为人射激光，光波长3 6 0 nm，物方视场尺寸分别为0、1.7 3 2 1 和2.5 mm，成像面为激光聚焦面，即实际使用中的样品物面。Field height/mm01.732 1RMS radius/m0.5180.522图2 显微物镜的模拟点列图由图2 可知，视场从中心到2.5 mm边缘处的RMS变化较小，物镜系统接近衍射极限。激光以2.5mm人射时，聚焦的弥散光斑物理尺寸约为3m,满足显微系统荧光激发的需要。因光学系统无法完全消除各种像差和衍射，激光光束通过物镜后聚焦的像斑存在一定的能量分散和损失5 。通过ZEMAX模拟分析像面处某尺寸几何圆内的光能与总入射光能的百分比，可以确定像斑的能量是否满足使用需求。图3 为显微物镜的包围圆能量图，反映包围圆半径与包围圆内能量占比的关系。1.00.899%0.60.40.20.0036912.1518 21 24 27Radial Distance/m图3 显微物镜的包围圆能量图2.50.5330.90.80.70.6卡3Field Height/mm一0-1.7321.2.569第3 期根据显微物镜的视场和激光聚焦的光斑尺寸，设计采集包围圆尺寸为5 m，对应的包围圆内能量占比由中心到边缘依次为8 3.3 5%、8 3.3 4%和83.32%。根据斯特列尔判据,设计的显微物镜具有良好的能量集中度与信号传递功能。3.2信号采集分析将物镜设计中的像面作为系统整体的物面进行正向光路分析和光纤耦合仿真，数值孔径为0.4，视场范围取0、2 0 m和5 0 m分析系统的成像质量。图4为显微荧光光学系统的模拟点列图。Field height/mm00.02RMS radius/m1.3531.413图4显微荧光光学系统的模拟点列图由图4可知，弥散斑的均方根半径随视场高度增加而变大，边缘处RMS半径达1.8 3 8 m，实际的光斑尺寸达到5.49 1 m，需选择光芯较大的光纤进行采集。显微荧光光学系统的荧光信号强度包围圆能量图如图5 所示。在包围圆尺寸界限为3.4m内，能量占比达到0.8,使用5 m以上接收光纤纤芯可采集9 0%以上能量，符合显微荧光光学系统的使用需求。1.00.80.60.40.20.0+0图5 显微荧光光学系统的包围圆能量图3.3信噪比分析首先计算激光聚焦在物面上的激发能量强杜宪等：显微荧光光谱采集系统的设计与可行性分析式(2)给出计算方式。A+9()SL,=JL(o,)d入4元0.0521n(2)L(o,)TT然后，根据荧光特性并结合光学系统传输效率计算探测器所采集的荧光辐射总量，使用光粒子数1.838表达。为了便于计算，认为短距光纤传输的损失为0，自光纤出射端到光探测器表面的光程不再引入背景噪声误差。荧光辐射总强度由式(3)给出。N,=nhcR式中，N，为光粒子数表达的荧光辐射总量；E。为激发激光强度；为探测器的量子效率；h为普朗克常量；c为光速；R为光程；A。为显微物镜横截面积；$为系统的几何重叠因子；T指不同波长在系统中的光学透过率；C，可视为受激发荧光物质的密度。再次，计算采集系统的噪声。显微荧光光谱采集系统的噪声主要有两个来源,其一是显微光路中的背景光干扰,与信号混同，在进入采集光纤前有Field Height/mm0.0200.05510Radial Distance/m33度。认为8 0%的包围圈内能量能有效激发荧光,且激光在系统中不因光程损失能量。根据表2 中的透过率参数，计算2 0 mW可调谐激光光源聚焦后的最大功率约为1 3.8 5 6 4mW。其次计算受激荧光的发光强度。激光诱导荧光的发光强度由式(1)给出。式中，L,为荧光受激特性；入。和入，分别为激光波长和荧光波长；入为荧光光谱线形的半高宽度；(入。)为荧光量子产率；S为平均作用面积；L(o,)为归一化光谱线形,由(1)入一(2)(3)类似的衰减。其二是探测器的暗电流噪声，与线阵PMT的工作电压和光信号采集的积分时间相关。暗电流噪声的计算由式(4)给出。式中，Na为暗电流噪声的光粒子数表达；i为线阵PMT工作模式下暗电流典型值；R,为探测器阳极信号响应度；hu为1520单光子能量；t为单次采集的工作时间。N,=R.huN,LSJN,+2(N,+N.)(4)(5)34最后，计算显微荧光光谱采集系统的信噪比Rsv，计算方法由式(5)给出。其中背景噪声的等效光粒子数N,由晨昏时室内场景下亮度的典型值计算得出。通常以采集系统的信噪比是否超过1 0 为系统能否正常工作的判定标准。系统信噪比计算中使用的部分参数取值和信噪比计算结果由表3 给出。可以看到，当激发激光波长为3 6 0 nm时，在荧光信号典型值46 0 nm处，光纤耦合效率为0.8 2 7 9,满足正常工作的需求1 8-1 9 。O采集积分时间为0.2 ms时，显微荧光采集系统的信噪比为1 3.0 7 42，能够有效完成采集任务，也符合该系统的设计指标。表3 显微荧光光学系统信噪比仿真的参数取值ItemE入。入AoRT()SR,SNR4结论使用显微荧光光路并结合线阵PMT，设计了一种用于微米尺度下生物单粒子激光诱导荧光光谱的采集系统，由3 6 0 nm激光光源激发，荧光信号波长覆盖可见光波段，中心波长为46 0 nm。数值模拟结果表明，当显微光学系统的激光功率为2 0 mW时，激光光斑聚焦范围内系统包围圆能量的集中度超过8 0%，采集光纤纤芯超过5 m可获取信号9 0%以上能量。线阵PMT在积分时间为0.2 ms时,对荧光信号采集的信噪比约为1 3.0 7 42,符合显微系统正常工作的条件。参考文献1DROR R,DIRKS R,GROSSMAN J P,et al.Biomo-lecular simulation:a computational microscope for mo-光电技术应用lecular biologyJ.Annual Review of 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