新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落组成与分布格局研究.pdf

第 卷第 期 年 月干 旱 地 区 农 业 研 究 .文章编号:():./.新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落组成与分布格局研究王慧楠唐琦勇顾美英张志东朱 静(.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室新疆 乌鲁木齐.农业农村部盐碱土改良与利用(干旱半干旱区盐碱地)重点实验室新疆 乌鲁木齐.新疆师范大学生命科学学院新疆 乌鲁木齐)摘 要:为揭示盐碱环境下盐爪爪内生菌群落结构组成及其多样性以新疆 个典型盐碱地区的盐爪爪为研究对象采用高通量测序技术分别对其根部和地上部分样品的内生菌进行分析 结果表明:获得的 个细菌操作分类单元()共涉及 个门 个目 个属以变形菌门()、厚壁菌门()、放线菌门()为主要菌门 获得的 个真菌 共涉及 个门 个目 个属以子囊菌门()、担子菌门()、油壶菌门()为主要菌门 其中嗜盐单胞菌属()和链格孢属()占绝对优势 不同地区和不同组织的内生细菌群落和内生真菌群落组成及群落丰富度差异显著 土壤中的钠离子()、氯离子()和电导率()与内生菌主要门的分布呈显著正相关关系表明不同地区内生群落的构成差异主要与土壤盐碱化相关 研究初步揭示了新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落结构组成与分布格局对阐明内生菌在生态系统的演替、生物多样性及其生态功能具有科学意义关键词:盐爪爪内生菌盐碱环境高通量测序群落组成和分布中图分类号:.文献标志码:(.().):.().()()().收稿日期:修回日期:基金项目:新 疆农业 科学院 科技创 新重 点培育 专项()国家 自然科 学 基 金()国 家 重 点 研 发 计 划()作者简介:王慧楠()女吉林长春人硕士研究生研究方向为微生物生态学:.通信作者:朱静()女云南昆明人研究员主要从事特殊环境微生物学研究:.:土壤盐碱化是当今世界旱地农业面临的重大生态环境问题 新疆被称为世界盐碱地博物馆该地区盐碱土面积占中国盐碱土总面积(万)的.其中受不同程度盐渍化危害的耕地面积占总耕地面积的.土地盐渍化已严重限制和阻碍了旱区农业开发及可持续发展盐爪爪()为藜科多年生灌木多分布于南北新疆极端盐碱的荒漠沙土中 作为一种典型盐生植物盐爪爪可在盐渍化环境中生长能不断从外界吸收大量盐离子具有改良盐碱地土壤性质、降低土壤含盐量和增加土壤有机质的作用在干旱半干旱地区的水土保持、农作物的耐盐育种以及盐渍化土壤的改良等方面有重要的生态和经济价值植物内生菌是指存活于健康植物组织内部不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群 内生菌可改善植物生长状况提高其抵抗盐碱、干旱和病虫害等环境胁迫的能力 目前关于盐爪爪的研究多集中于其形态解剖特点、适盐特性以及耐盐分子机理等方面新疆特殊环境微生物资源挖掘创新团队前期对新疆干旱荒漠及核辐射污染环境中的盐爪爪内生群落构成进行了初步研究而新疆盐碱环境下盐爪爪内生菌的相关报道仍较为有限 因此本研究采用高通量测序技术通过研究新疆 个不同地区的盐爪爪内生群落结构组成与分布格局以期阐明内生菌在生态系统的演替规律、生物多样性及其生态功能旨在为开发和利用相关功能微生物提供理论依据 材料与方法.样品采集地点及方法于 年 月分别对新疆克拉玛依市郊区()、吐鲁番地区艾丁湖沿岸()、巴音郭楞蒙古自治州塔什店镇水库周边()、巴音郭楞蒙古自治州轮台县野云沟乡荒漠盐碱地()、巴音郭楞蒙古自治州轮台县城外盐碱地()个地区的盐爪爪进行采集 每个地区选择 个采样点各采样点之间间隔约 (表)使用随机采样法每个采样点采集 株完整植物样品装入灭菌的牛皮纸袋内编号记录带回实验室于 储存 将每个采样点采集的植株分为地上部分(:茎叶)和根部()个地区每区 株植物每株植物分为地上部分和根部 个样本由于 采样点采集了 株植物故共计 个样本植物采样的同时采集土壤样品使用土钻从土壤表层 钻取土芯每份土壤样品由 份土芯混合而成过 筛去除土样中的石块和植物根系等杂物装袋封口并做好标记运回实验室于保存.样品表面消毒参照 等方法进行样本表面消毒将植物组织依次浸入 乙醇 、.次氯酸钠、乙醇.经无菌水冲洗后用滤纸吸干备用表 不同盐碱地区采样信息 采样区域 样品类型 经纬度 海拔/克拉玛依()地上部分 (.)根部 (.).艾丁湖()地上部分 (.)根部 (.).塔什店()地上部分 (.)根部 (.).野云沟()地上部分 (.)根部 (.).轮台()地上部分 (.)根部 (.).干旱地区农业研究 第 卷.基因组 提取和 扩增将样品的地上部分和根部分别研磨 采用 方法提取样本的基因组 使用 琼脂糖凝胶电泳检测 的纯度和浓度取适量样本 于离心管中用无菌水稀释至 以稀释后的基因组 为模板对细菌 基因 区、真菌 区进行扩增扩增产物经纯化回收交由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成测序.生物信息学分析使用 .软件对 测序平台下机数据进行质控利用(.)软件对所有样品的全部 进行聚类默认以 的一致性()将序列聚类成为()用 方法与 的 数据库进行物种注释分析(设定阈值为.)使用 软件计算、等多样性指数 利用 算法使用 .版本()的 软件包进行无度量多维标定()分析群落之间的差异性 利用 .软件使用冗余分析()评价植物内生菌群落结构与环境变量之间的相关性 使用诺和云平台(:/./)进行群落结构、物种多样性等数据分析并绘制相关图 使用 .软件对 多样性、土壤理化性质等数据进行单因素方差分析().土壤样品理化性质测定土壤样品送至新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所进行理化性质的测定 依据土壤检测系列标准(/)采用电位法测定电导率()采用电极法测定有机质()采用重铬酸钾硫酸法测定全氮()采用凯氏定氮法测定可溶性氮()采用氯化钾溶液提取分光光度法测定速效磷()采用盐酸氟化铵提取钼锑抗比色法测定速效钾()采用乙酸铵浸提火焰光度法测定土壤水溶性盐总量()采用质量法测定氯离子()采用电位滴定法测定硫酸根()采用硫酸钡比浊法测定钙离子()和镁离子()分别用原子吸收分光光度法及 络合滴定法测定水分采用重量法测定 结果与分析.测序数据分析由各样品测序信息结果(表)可知 个不同地区盐爪爪地上部分和根部样品总计测得内生细菌的原始序列 条有效序列数 条内生真菌的原始序列 条有效序列数 条 以 相似度将其聚类内生细菌共产生 个 内生真菌共产生 个 如图(见 页)所示在内生细菌中不同样品及组织间共有的 数为 占总 的.在内生细菌的 个 中地上部分仅包含 个 且主要来源于共有部分而根部包含 个 表明根部样品的 更多 其中地上部分样品 以 组最多约占地上部分总数的.根部样品则以 组 最多约占根部总数的.表 内生细菌和真菌测序数据统计 样品内生细菌 原始序列数 质控序列数 有效 内生真菌 原始序列数 质控序列数 有效 克拉玛依地上部分.克拉玛依根部.艾丁湖地上部分.艾丁湖根部.塔什店地上部分.塔什店根部.野云沟地上部分.野云沟根部.轮台地上部分.轮台根部.总数 第 期 王慧楠等:新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落组成与分布格局研究 如图 所示内生真菌中共有的 为 占总 的.地上部分样品共包含 个根部样品包含 个 可见在内生真菌群落中地上部分样品 高于根部样品 其中地上部分 以 组最多约占地上部分总数的.其 次 为 组 约 占 地 上 部 分 总 数 的.根部 以 组最多约占根部总数的.以上结果说明在不同地区的盐爪爪中内生细菌和内生真菌群落结构组成存在显著差异.多样性及群落结构差异分析.多样性分析 多样性指标中的香农指数、辛普森指数可反映群落的多样性 和 指数则反映群落的丰富度 由表 可以看出测序深度指数 均在.以上 在盐爪爪内生细菌及内生真菌群落多样性方面不同地区及组织间香农指数及辛普森指数无显著差异 在群落丰富度方面所有地区的内生细菌基本表现为根部丰富度大于地上部分内生真菌则相反表现为地上部分丰富度整体大于根部 其中 组地上部分、组根部内生细菌群落丰富度最高 组地上部分、组根部内生真菌群落丰富度最高 方差分析表明各地区盐爪爪的内生菌群落多样性之间差异不显著而群落丰富度最高与最低组之间存在显著差异 可见不同地区的盐爪爪内生菌群落多样性状况基本一致但其群落丰富度在不同地区和不同组织间存在一定差异.菌群结构分析 将 注释到各分类水平细菌产生的 个 共涉及 个门 个目 个属以变形菌门()、厚壁菌门()、放线菌门()为主要菌门(图)进一步分析盐爪爪样品中 个主要属发现(表 见 页)不同地区、不同组织的盐爪爪内生细菌群落结构组成相近但各样品间菌群所占比例则存在显著差异 其中 地区的主要优势菌属为链霉菌属()地区以芽孢杆菌属()、沉积物杆菌属()和海球菌属()为主要优势菌属 地区的优势菌属 为 芽 孢 杆 菌 属()、嗜 盐 单 胞 菌 属()和沉积物杆菌属()地区的主要优势菌属包括 属和链单孢菌属()地区相对含量较高的菌属主要有假单胞菌属()、嗜盐单胞菌属()和拟诺卡氏菌属()地上表 内生群落多样性指数 样品内生细菌 香农指数辛普森指数 指数 指数覆盖度/内生真菌 香农指数辛普森指数 指数 指数覆盖度/克拉玛依地上部分.克拉玛依根部.艾丁湖地上部分.艾丁湖根部.塔什店地上部分.塔什店根部.野云沟地上部分.野云沟根部.轮台地上部分.轮台根部.注:同列不同字母表示处理间差异显著(.):(.).干旱地区农业研究 第 卷部分主要由嗜盐单胞菌属()、沉积物杆菌属()、叶杆菌属()、薄壁芽孢杆菌属()组成根部主要由芽孢杆菌属()、链单孢菌属()、嗜盐单胞菌属()、假单胞菌属()、属、海球菌属()、拟诺卡氏菌属()、链霉菌属()组成真菌产生的 个 共涉及 个门 个目 个属以子囊菌门()、担子菌门()、油壶菌门()为主要菌门(图)对盐爪爪样品中 个主要真菌属作进一步分析发现(表)与内生细菌的结果相同不同地区、不同组织的盐爪爪内生真菌群落结构组成相近但各样品间菌群所占比例也存在显著差异其中 地区的优势菌属主要为葡萄座腔菌属()和格孢腔菌属()地区的主要优势属为链格孢菌属()和曲霉属()地区中相对含量较高的菌属主要有链格孢菌属()和支顶孢属()地区的主要优势属为链格孢菌属()、属和茎点菌属()地区的主要优势属有链格孢菌属()和粪壳菌纲未分类属()地上部分主要由葡萄座腔菌属()、链格孢菌属()、曲 霉 属()、格 孢 腔 菌 属()、茎点菌属()组成根部主要由链格孢菌属()、属、支顶孢属()、粪壳菌纲未分类属()组成 此外研究发现新疆盐爪爪中存在着大量未分类细菌属和真菌属图 各样本内生细菌群落韦恩图.图 各样本内生真菌群落韦恩图.图 基于门水平的内生菌群落相对丰度图.第 期 王慧楠等:新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落组成与分布格局研究表 属水平上主要的内生细菌群落组成 属名相对含量 /克拉玛依地上部分.克拉玛依根部.艾丁湖地上部分.艾丁湖根部.塔什店地上部分.塔什店根部.野云沟地上部分.野云沟根部.轮台地上部分.轮台根部.芽孢杆菌属.链单胞菌属.嗜盐单胞菌属.沉积物杆菌属.假单胞菌属.海球菌属.拟诺卡氏菌.叶杆菌属.节杆菌属.链霉菌属.薄壁芽孢杆菌属.表 属水平上主要的内生真菌群落组成 属名相对含量 /克拉玛依地上部分.克拉玛依根部.艾丁湖地上部分.艾丁湖根部.塔什店地上部分.塔什店根部.野云沟地上部分.野云沟根部.轮台地上部分.轮台根部.葡萄座腔菌属.链格孢菌属.曲霉属.粪壳菌纲未分类属.格孢腔菌属.茎点菌属.支顶孢属.花冠菌属.短梗霉属.芽枝霉属.毕赤酵母属.分析 基于 水平对不同样本内生细菌和内生真菌群落进行非度量多维尺度()分析其结果以 值评估即观察到的距离和拟合距离的不一致性 值小于.时具有解释意义 如图、图 所示各地区不同组织的内生细菌群落(:.)和内生真菌群落(:.)组成差异显著 其中 个样品根部的点比较分散说明根部内生细菌群落差异较大(值为.)地上部分内生细菌群落相对集中说明其共有的细菌类型较多群落构成相似度高 可见地上部分和地下部分两种不同的采样位点对内生细菌的群落组成影响显著 在内生真菌(值为.)中组、组的根部以及 组的地上部分群落较分散群落构成特异性高而其他样本虽相对集中但样品间真菌的群落构成依然差异显著.不同地区土壤属性分析及其对群落组成的影响土壤样品理化性质的测定结果表明(表):不同地区土壤 值均呈碱性全盐含量介于.属于盐碱土其中 地区的含盐量最高有机质含量基本介于.属于荒漠土地区间全氮含量差异不显著 地区可溶性氮、速效磷、硫酸根含量均最高 地区的速效钾含量最高为.地区钙离子含量最高为.电导率、钠离子、氯离子与土壤全盐量随地区变化规律较一致均为 地区最高 地区最低 结果表明除全氮含量外不同地区间的土壤理化性质及含水量均存在显著差异 干旱地区农业研究 第 卷图 内生细菌群落 分析(:.).(:.)图 内生真菌群落 分析(:.).(:.)表 土壤样品理化性质 指标克拉玛依()艾丁湖()塔什店()野云沟()轮台().全盐量 /().有机质 /().全氮 /().可溶性氮 /().速效磷 /().速效钾 /().电导率 /().氯离子 /().硫酸根/().钙离子 /().镁离子 /().钠离子 /().水分/().注:同行不同字母表示处理间差异显著(.):(.).将各样本细菌群落的主要门()及环境因子进行冗余分析()发现第一排序轴()对所有环境因子的解释率为.第二排序轴()解释率为.钠离子()、速效磷()、钙离子()、可溶性氮()是影响细菌群落的主要因子土壤理化性质间呈正相关关系 钠离子()与、显 著 正 相 关 速 效 磷()、钙 离 子()、可溶性氮()与、正相关(图)除钠离子()外(.)其他环境因子对优势细菌门水平的影响均不显著对各样本内生真菌主要门()及环境因子进行冗余分析()发现第一排序轴()对所有环境因子的解释率为.第二排序轴()解释率为.氯离子()、可溶性氮()、电导率()是影响真菌群落的主要因子氯离子()、电导率()与、以及其他门呈正相关关系其中氯离子()的影响较显著(.)除与 呈正相关关系外与其他门和环境因子均为负相关但影响不显著(图)讨 论盐碱地因其含盐量高、碱化严重、养分贫瘠、易板结、透气性差等特点使得大多数植物和微生物难以生存 盐生植物可在盐碱生境中不断吸收盐离第 期 王慧楠等:新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落组成与分布格局研究图 内生细菌群落组成(门水平)与环境因子的冗余分析.()()图 内生真菌群落组成(门水平)与环境因子的冗余分析.()()子降低土壤含盐量增加土壤有机质从而改良盐碱地土壤性质 然而单独的植物修复方法存在很多不足比如修复效率低、专一性不强、只适用于中低浓度环境胁迫等 植物微生物联合修复成功弥补了单独修复方法存在的缺陷是一种更加有效的盐碱地修复方式 等研究表明将从盐地碱蓬中分离到的内生真菌接入水稻()后水稻在 胁迫情况下的生长能力和抗氧化性特征显著增强 在盐角草()应对盐胁迫的研究中发现内生菌可通过增强代谢活性显著提高植物对盐碱条件的适应能力 因此研究盐生植物内生菌的群落结构及其与植物的共生互作机制对于盐渍化土壤的改良以及生物资源的开发利用具有重要的实际应用价值现有研究表明植物的根和地上组织之间内生菌群落组成存在显著差异 等通过对三七的内生菌进行研究发现其根部的内生细菌 多样性显著高于茎和叶且不同生长阶段根部群落的特有成员数量明显多于叶层群落 等的研究也发现白首乌叶部内生真菌丰富度及多样性均最高 等通过对菜豆的内生菌研究发现不同品种菜豆内生真菌多样性在器官和根际之间存在差异根际最高茎最低 以上研究表明除了根和地上组织之间生化环境的差异外二者的定植、共存机制以及组织间的流通限制也是造成群落差异的主要原因 本研究通过高通量测序技术对新疆 个不同地区盐生植物盐爪爪进行分析发现其地上部分的真菌多样性和丰富度明显高于根部细菌多样性和丰富度则明显低于根部这一结果与前期对新疆核辐射污染区盐爪爪内生菌群落的报道一致 本研究还发现不同地区盐爪爪地上部分内生细菌群落相对集中群落构成相似度高而根部内生细菌群落较为分散特异性更高内生真菌中 组、组根部及 组地上部分群落较分散其他地区相对集中但样品间仍有差异表明不同采样部位对内生细菌群落构成影响显著对内生真菌群落影响不显著 等对极端环境下的穗状双针、苦艾、短柄白珠树及毛梗霉植物进行了研究指出土壤中的微生物种类通常多于地上组织 因此根部细菌群落可能是通过土壤迁徙大量聚集形成的而内生真菌的群落组成则受宿主和环境的限制更大优势菌能影响微生物群落的组成和结构是决定微生物群落平衡的重要因素之一 如 等指出高盐生态系统拥有一个特定的微生物群可以被盐生植物招募盐碱干旱土壤中生长的盐角草对招募的微生物群的多样性产生了强烈的影响其亲和力强归因于内生优势菌嗜盐单胞菌属()目前多数盐生植物中的主要菌门为厚壁菌门()、变形菌门()、放线菌门()、子囊菌门()、担子菌门()及接合菌门(干旱地区农业研究 第 卷)本研究中内生细菌门以变形菌门、厚壁菌门、放线菌门为主内生真菌门则以子囊菌门、担子菌 门 为 主 属 水 平 上 分 别 以 嗜 盐 单 胞 菌 属()链格孢菌属()为主要优势属 此外内生细菌和内生真菌中存在的大量未知类群也占据了较大比例 这与大部分藜科植物内生菌的研究结果相似 前期对新疆和硕县乌什塔拉乡周边干旱荒漠地区地区的盐爪爪内生真菌群落进行研究发现炭角菌属()为盐爪爪内生真菌群落的绝对优势种属这与本研究结果有所不同因此推测不同区域、不同组织的盐爪爪内生真菌群落组成存在一定差异可能与菌群的选择偏好性有关 盐单胞菌属()属于中度嗜盐菌该属的成员大多对环境适应能力强具有较高的耐盐性能 等研究发现将该菌接种于苜蓿幼苗后在.胁迫的情况下能刺激植株生长使其恢复正常生长水平 此外盐单胞菌属的菌株还具有特殊的生物化学功能如产胞外多糖、降解苯酚、降解原油、高产四氢嘧啶等在工农业生产中发挥了重要作用 链格孢菌()在多种植物中存在也有促进植株生长和提高盐耐受性能的作用除了具有酶促活性外该菌还具有多种对抗人类病原微生物的抗菌活性并能产生氨和吲哚乙酸()等的研究已将链格孢菌用作玉米的生物抑制剂并取得了良好效果 这表明盐爪爪内生菌中存在具有特殊功能的微生物资源有很大的发掘和利用潜力土壤理化因子是微生物群落结构和组成的主要决定因素 相关研究发现土壤、有机质、含盐量是影响植物内生菌的主要因素但在较高的分类层级上植物的含盐量及生长阶段对盐生植物内生菌群落组成影响不显著 本研究也发现钠离子()、氯离子()和电导率()与内生菌中的主要门呈正相关关系 与其他 个地区相比艾丁湖地区()的钠离子()、氯离子()含量最丰富群落丰度最高这可能是因为对耐盐植物而言盐胁迫可增加根际土壤细菌多样性和生物量而该地区土壤盐分含量显著高于其他地区盐分的升高促进了耐盐或嗜盐细菌的增殖 土壤内生真菌大部分属于好氧型土壤含水量过高会抑制其生长与繁殖这可能是造成轮台地区()真菌丰度偏低的主要原因 可见大多数植物内生菌群落组成除受宿主植物的影响外还受到土壤理化特性的影响两者共同作用导致不同地区盐爪爪内生菌群落组成的差异 此外盐爪爪是典型的盐生植物 是其生长必需元素盐胁迫可以提高植物中钠离子的含量 等研究也发现种植盐草能显著降低土壤盐分及 有效改善土壤环境及土壤肥力 由此可见种植盐生植物是盐碱地生物改良的有效方法 结 论通过对新疆 个盐碱地区的盐爪爪根部和地上部分样品的内生细菌及内生真菌进行分析发现变形菌门()、厚壁菌门()、放线菌门()为主要细菌门属水平上嗜盐单胞菌属()的相对丰度最高子囊菌门()、担子菌门()为主要真菌门属水平上链格孢菌属()相对丰度最高 土壤中的钠离子()与细菌、呈显著正相关关系氯离子()、电导率()与真菌、和其他门呈显著正相关关系 不同地区、不同组织的盐爪爪内生群落结构存在显著差异且与土壤盐碱化相关 研究结果初步揭示了新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落结构组成与分布格局对深入阐明内生菌在生态系统的演替、生物多样性及其生态功能具有重要的科学意义参 考 文 献:张万银 郑旭 李斌 等.基于 数据库对新疆盐碱地治理研究现状与分析.农业与技术 ():.():.赵可夫 李法曾 张福锁.中国盐生植物.版.北京:科学出版社.:.:.():.:().():.高瑞如 赵瑞华 杜新民 等.种盐生植物根系的适盐特性.林业科学 ():.():.刘琳 张富春 曾幼玲.盐爪爪/逆向转运蛋白和焦磷酸酶第 期 王慧楠等:新疆盐碱地区盐爪爪内生菌群落组成与分布格局研究的亚细胞定位.西北植物学报 ():./.():.刘晓静 张志东 唐琦勇 等.新疆和硕干旱荒漠区盐爪爪内生真菌群落特征分析.干旱区资源与环境 ():.():.():.():.():.张玮川 李剑 王志宇 等.内生菌植物联合修复污染土壤研究进展.农业资源与环境学报 ():.():.:.:.():.():.:.():.():.:.:.():.罗鑫 张海燕 刘明元 等.稻田土壤微生物群落多样性研究进展.安徽农业科学 ():.():.():.():.():.唐琦勇 朱静 楚敏 等.北疆盐角草内生真菌群落组成和分布.干旱区资源与环境 ():.():.:.():.():.董静 邢锦城 温祝桂 等.苏北滩涂盐碱地 种典型盐生植物根际土壤细菌多样性及群落结构分析.江苏农业科学 ():.():.():.张雪 陈婷 牛艳慧 等.高通量测序揭示艾比湖湿地 种盐生植物根际土壤真菌群落组成及多样性.微生物学报():.():.():.干旱地区农业研究 第 卷