猪源罗伊氏乳杆菌LR1对断奶后42 d仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响.pdf

动物营养学报，（）：猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响刘春艳，孙焱杰 王 倩 熊云霞 吴绮雯 杨雪芬 王 丽蒋宗勇 易宏波 黄艳娜（广西大学动物科学技术学院，南宁；广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州）摘 要：本试验旨在研究猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能及肠道上皮屏障功能的影响。选取 日龄体重接近的杜长大杂交断奶仔猪 头，随机分为 组，分别饲喂基础饲粮（对照组，组）、基础饲粮中添加 金霉素和 喹乙醇（抗生素组，组）、基础饲粮中添加 猪源罗伊氏乳杆菌（罗伊氏乳杆菌组，组），每组 个重复，每个重复 头仔猪，公母各占。试验期 。结果表明：）与 组相比，组的平均日增重显著增加（）。）与 组相比，组十二指肠、空肠以及回肠的绒毛高度显著增加（），十二指肠和回肠的绒隐比显著提高（）。）与 组相比，组结肠闭锁小带蛋白（）与闭合蛋白（）的基因相对表达量显著增加（）。）与 组相比，组空肠黏液素（）的基因相对表达量显著增加（），且结肠黏液素（）和 的基因相对表达量显著增加（）。）与 组相比，组回肠猪 防御素（）的基因相对表达量显著增加（），结肠 防御素（）、的基因相对表达量显著增加（）。）与 组相比，组结肠 样受体（）的基因相对表达量显著增加（）。综上可知，在饲粮中添加猪源性罗伊氏乳杆菌 可以提高仔猪在断奶后 的生长性能，并通过改善小肠绒毛形态，增加仔猪结肠肠道紧密连接蛋白、黏液素、抗菌肽及 样受体基因的表达，从而改善断奶仔猪肠道上皮屏障功能。关键词：断奶仔猪；罗伊氏乳杆菌；生长性能；肠道形态；肠道上皮屏障中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）；国家生猪产业技术体系（）；广州市科技计划项目（）；茂名实验室自主科研项目（）；茂名实验室科研启动项目（）；科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）（，）作者简介：刘春艳（），女，湖南郴州人，硕士研究生，动物营养与饲料科学专业。：通信作者：易宏波，副研究员，硕士生导师，：；黄艳娜，副教授，硕士生导师，：仔猪断奶应激易造成肠道上皮屏障功能损伤，易引发严重腹泻。在过去的几十年，抗生素和氧化锌是预防治疗仔猪断奶应激的有效添加剂，但过度使用会造成一定的耐药性已经对环境产生副作用，因此我国目前已对饲料添加剂采取禁抗、限锌的措施，生猪养殖从业者面临巨大困扰。罗伊氏乳杆菌（，）是一种天然定植在哺乳动物和鸟类肠道的益生菌，在维持动动 物 营 养 学 报 卷物健康和免疫调节等方面有着重要意义，已被证明可以调节先天免疫反应和肠道屏障功能。先前对小鼠的研究表明，可通过上调紧密连接蛋白（，）的表达来改善肠道屏障功能，此外，也可通过脂多糖刺激猪小肠上皮细胞和新生仔猪分泌 来增强新生猪的肠道屏障功能。同时，等研究发现，喂养健康新生小鼠 可调节免疫反应，同时调节肠道微生物群并促进有益代谢物的产生。此前，本课题组从健康断奶仔猪的粪便中分离出新型猪源，并发现 可以提高断奶后 仔猪生长性能并改善肠上皮屏障功能以缓解仔猪的腹泻。同时，我们利用猪小肠上皮细胞研究 如何影响产肠毒素大肠杆菌 诱导的肠道损伤，结果显示 可以通过抑制肌球蛋白轻链激酶信号通路来抑制产肠毒素大肠杆菌 诱导的炎症反应。然而，很少关注 对断奶后 仔猪肠道上皮屏障功能的影响，因此，本试验旨在研究 对断奶后 仔猪的生长性能、肠道形态以及肠道上皮屏障功能等方面的影响，以期为 在仔猪生产中的应用提供理论依据。材料与方法 试验方法 选取 头 日龄杜长大杂交断奶仔猪，随机分为 组，每组 个重复，每个重复 头仔猪，公母各占，每栏之间的体重接近（）。对照组（组）饲 喂 基 础 饲 粮，其 参 照（）营养需要配制成粉状配合饲料，表 为基础饲粮组成及营养水平。试验组分为抗生素组（组）和 组，分 别 在 基 础 饲 粮 中 添 加 金霉素和 喹乙醇、猪源（，根据 等的报道确定添加量）。益生菌制剂经喷雾干燥制成冻干粉，饲喂前经逐级稀释与粉状饲料混合均匀。试验期。仔猪自由采食，充足饮水，所有猪只均按正常免疫程序进行免疫接种。表 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）（）项目含量 原料 玉米 膨化玉米 发酵豆粕 去皮大豆粕 膨化大豆 鱼粉 乳清粉 大豆皮 大豆油 浓缩乳清蛋白 白砂糖 氯化胆碱 食盐 磷酸氢钙 石粉 赖氨酸盐酸盐 蛋氨酸 苏氨酸 色氨酸 预混料）期刘春艳等：猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响续表 项目含量 合计 营养水平 ）消化能 （）粗蛋白质 钙 总磷 标准全消化道可消化磷 标准回肠可消化赖氨酸 标准回肠可消化蛋氨酸标准回肠可消化半胱氨酸 标准回肠可消化苏氨酸 标准回肠可消化色氨酸 ）预混料中含多维 、多矿 ，其具体组成见参考文献。，。）粗蛋白质、钙、总磷为实测值，其余为计算值。，检测指标与方法 生长性能 在试验第 天和第 天时以栏为单位称量各猪只的体重并记录耗料量，在称重前 对仔猪采取禁食措施。计算每组的平均日增重（）、平均日采食量（），并根据 和 计算料重比（）。肠道形态 试验第 天，从每栏随机挑选 头仔猪进行屠宰，环切约 的十二指肠（近端）、空肠（中段）、回肠（远端），用注射器吸取磷酸盐缓冲液（）轻轻冲洗后分别置于 多聚甲醛样品瓶中固定保存，后续进行肠道形态学检测：经过冲水、脱水、透明、石蜡包埋等处理后，苏木精伊红（）染色切片观察，每张切片测量 个完整的肠道绒毛及其伴生的隐窝，最后计算绒毛高度与隐窝深度的比值（）。肠黏膜基因表达 用实时荧光定量 的方法测定肠道屏障功能相关基因相对表达量，方法如下：利用 （，美国）提取肠黏膜中的总，接着反转录合成。后续 扩增反应体系为 ：，上、下 游 引 物 各，模板 ，超纯水 。试验所需引物均由 软件设计，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列信息见表。内参基因为 肌动蛋白（），目的基因相对表达量用 法计算。表 引物序列信息 基因引物序列 （）产物长度 登录号 闭锁小带蛋白：闭合蛋白：黏液素：动 物 营 养 学 报 卷续表 基因引物序列 （）产物长度 登录号 黏液素：猪 防御素：猪 防御素：抗菌肽：样受体：样受体：肌动蛋白：数据统计分析 数据采用 统计软件进行单因素方差分析（），氏法进行多重比较。结果用平均值均值标准误（）表示，软件作图，表示差异显著。结果与分析 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪生长性能的影响由表 可知，组相比于 组平均日采食量有增加的趋势，但无显著差异（），平均日增重显著提高了（）。组平均日采食量较 组显著增加了（），平均日增重显著增加了（）。与 组相比，组和 组的腹泻率均有下降的趋势，但差异不显著（）。猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道形态的影响 由表 可知，与 组和 组相比，组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及回肠的绒毛高度 隐窝深度显著提高（）。此外，相比于 组，组十二指肠的绒毛高度与绒毛高度隐窝深度也显著上升（）。十二指肠、空肠及回肠的 染色切片如图 所示，所有试验组猪小肠黏膜结构与形态完整。表 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪生长性能的影响 项目组别 值初始体重 终末体重 平均日采食量 （）平均日增重 （）料重比 腹泻率 同行数据肩标不同字母表示差异显著（）。下表同。，（）期刘春艳等：猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响表 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道形态的影响 项目组别 值十二指肠 绒毛高度 隐窝深度 绒毛高度 隐窝深度 空肠 绒毛高度 隐窝深度 绒毛高度 隐窝深度 回肠 绒毛高度 隐窝深度 绒毛高度 隐窝深度 图 断奶仔猪肠道 染色切片图 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道上皮屏障功能的影响 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道紧密连接蛋白基因表达的影响 如图 所示，组与 组相比，空肠闭锁小带蛋白（）的基因相对表达量显著降低（），结肠 与闭合蛋白（）的基因相对表达量显著增加（）。与 组相比，组空肠以及回肠 的基因相对表达量显著增加（）。猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道黏液素基因表达的影响如 图 所 示，组 的 空 肠 黏 液 素 （）和结肠黏液素（）、的基因相对表达量显著高于 组（），回肠、基因相对表达量显著低于 组（）。与 组相比，组空肠 以及回肠、的基因相对表达量显著降低（），显著增加了结肠 的基因相对表达量（）。动 物 营 养 学 报 卷 ：闭锁小带蛋白 ；：闭合蛋白。：对照组；：抗生素组；：罗伊氏乳杆菌组。柱状图上标不同字母表示差异显著（）。下图同。：；：；：（）图 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道紧密连接蛋白基因表达的影响 ：黏液素；：黏液素。图 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道黏液素基因表达的影响 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道抗菌肽基因表达的影响 如图 所示，与 组相比，组显著降低了空肠猪 防御素（）、回肠猪 防御素（）的基因相对表达量（），显著增加了回肠、结肠、的基因相对表达量（）。相较于 组，组显著降低了空肠、，回肠 以及结肠抗菌肽（）的基因相对表达量（），显著增加了结肠 的基因相对表达量（）。猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道 基因表达的影响 如图 所示，组的空肠和回肠 样受体（）、样受体（）的基因相对表达量显著低于 组（），但与 组相比显著增加了结肠 的基因相对表达量（）。与 组相比，组显著增加了空肠 的基因相对表达量（），显著降低了空肠、回肠以及结肠 的基因相对表达量（），同时显著降低了回肠 的基因相对表达量（）。讨 论 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪生长性能的影响 抗生素是抗菌剂，可用于杀死肠道中的致病微生物，减轻免疫系统的负担，优化消化系统，改善生长性能。本试验中，抗生素提高了仔猪的平均日增重以及平均日采食量。然而，在动物生 期刘春艳等：猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响产中持续使用抗生素导致了一系列抗生素耐药性病原体，这些病原体也影响人类和动物。因此，养殖中控制抗生素的用量尤为重要。我国已于 年 月 日起“全面禁抗”，为了克服由于该禁令而导致的断奶仔猪死亡率、发病率和断奶后腹泻率增加的问题，已经提出了许多替代方案。益生菌是一种活的微生物，当给予足够的量时，通过不同的机制能够赋予宿主良好的健康效果，此前已被多项试验证实能够促进动物的生长发育。是益生菌中较常见的一种，能够预防一些疾病或者改善疾病症状。本试验研究结果表明，显著提高了仔猪断奶后 的末重和平均日增重，对平均日采食量也有提高的趋势。之前在鸡的研究上，已经证实 有助于增加体重并降低饲料转化率，并有研究报道，饲粮中添加 增加了仔猪断奶后 的末重和平均日增重。本研究结果与以上研究结果一致。此外，本课题组前期研究发现，可显著增加断奶后 的生长性能，说明 在断奶前期或断奶后 均能提高断奶仔猪的生长性能，在促生长型抗生素替代品中有良好的发展潜力。：猪 防御素 ；：猪 防御素 ；：抗菌肽 。图 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道抗菌肽基因表达的影响 ：样受体 ；：样受体 。图 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道 基因表达的影响 猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道形态的影响 小肠表面具有手指状微尺度的绒毛结构，它能扩大肠道表面积以利于宿主有效吸收，同时，其与隐窝结构对于肠上皮的结构完整性和维持肠道稳态也至关重要。隐窝绒毛组织结构与快速细胞更新相结合，使肠道既是营养吸收的主要部位，也是防止有害物质和病原体入侵的第 道屏障。有研究表明，仔猪饲喂鼠李糖乳杆菌后，肠道绒毛高度显著挺高，且绒毛高度 隐窝深度也显著增加。等从猪的粪便中分离的唾液乳杆菌对仔猪肠道的绒毛高度也有显著促进动 物 营 养 学 报 卷作用。本研究结果表明，饲粮中添加 的仔猪其十二指肠、空肠以及回肠的绒毛高度均有显著的增加，并能改善十二指肠以及回肠的绒毛高度隐窝深度。这与上述研究结果一致，表明 可通过提高仔猪的绒毛高度以及绒毛高度 隐窝深度来促进营养物质的吸收。猪源罗伊氏乳杆菌对断奶后 仔猪肠道上皮屏障功能的影响 肠道屏障的稳态在很大程度上取决于，当 发生改变时，可导致肠道屏障功能的快速恶化，最终阻碍正常的吸收和分泌活动。由位于肠上皮细胞侧膜顶端部分的多蛋白复合物形成，主要由跨膜蛋白（、）和支架蛋白（和）组成，在维持肠道物理屏障和调节肠道通透性方面起重要作用。抗生素会破坏肠道正常微生物平衡，引起肠道屏障功能障碍。本试验结果表明，饲用抗生素显著降低了仔猪空肠的 以及 的基因表达，这和上述研究结果一致。但抗生素却增加了结肠 以及 的基因表达，我们推测是由于结肠内容物较空肠、回肠来说停留时间较长、肠道菌群较为丰富的原因所造成的差异。也表现出和抗生素一样的结果，降低了空肠 的基因表达，增加了结肠 以及 的基因表达。但较抗生素来说，饲喂 增加了空肠、回肠 的基因表达。先前研究表明，可以增加卵清蛋白致敏的大鼠空肠、的基因表达。本课题组在前期研究中也发现，可显著增加断奶后仔猪早期小肠的 以及 的表达，表明 能增强断奶早期仔猪的肠上皮物理屏障功能。但本试验中，降低了空肠 的表达，说明 在断奶早期的效果比断奶中期好。此外，有研究发现 可以预防高脂肪饮食诱导的肠道屏障损伤，增加小鼠结肠 和 的基因表达，这和本试验 增加仔猪结肠 的基因表达的结果一致，表明 能通过增加结肠 以及 的基因表达来增强结肠的物理屏障功能。紧密的上皮形成物理屏障，由黏液层进一步保护，黏液层提供各种特定部位的保护功能。黏液素是胃肠道黏膜屏障的守门人，在各种胃肠道病理中异常表达，其主要成分为 和，在肠道上皮黏液层中起着至关重要的作用。肠道黏液层厚度在空肠、回肠、结肠中依次增加。本试验中，增加了空肠、结肠、的 基 因 表 达，却 降 低 了 回 肠、的基因表达。此前研究报道，小鼠口服植物乳杆菌 增加了结肠 的量，能显著增加结肠黏液层的厚度，减少了肠腔细菌与肠上皮细胞的接触而不触发炎症反应，这和本试验中 增加结肠、的基因表达结果一致，说明 可通过增加黏液素的表达加强结肠的肠道屏障功能。维持肠道稳态不仅需要耐受共生微生物群，还需要遏制入侵的病原体。越来越多的证据表明，潘氏细胞分泌的抗菌肽在先天肠道免疫和肠道微生物群调节中起着至关重要的作用。研究发现，对仔猪空肠以及回肠的抗菌肽调控作用不大，但能显著增加结肠中抗菌肽的表达，如、等。本试验结果表明，显著降低了空肠、回肠 的基因表达，但显著增加了回肠、结肠、的基因表达。结肠中微生物消化的主要代谢产物为短链脂肪酸，且短链脂肪酸可以诱导猪宿主抗菌肽基因表达。有研究证实，饲喂发酵乳杆菌后可以显著增加结肠消化物中丁酸盐的含量，因此我们猜测造成空肠、回肠、结肠这种表达差异的原因可能是丁酸介导的。样受体是微生物诱导的蛋白质，在大多数上皮细胞谱系中表达，具有重要的抗菌功能，可动态调节肠上皮在宿主和肠道微生物群之间的物理和免疫屏障。和 是肠道稳态的关键介质。前人研究表明，新生仔猪饲喂鼠李糖乳杆菌后，空肠黏膜、基因表达水平显著上调，乳酸杆菌能显著上调新生仔猪回肠中、和 等的 丰度，并显著上调了结肠 的 丰度。本试验研究结果表明，组的空肠以及回肠的、的基因表达显著降低，但显著上调了结肠的 的基因表达。这和前人研究结果部分保持一致，但与乳杆菌能提高空肠以及回肠中 样受体的表达相反。在新生仔猪中，肠黏膜屏障的完整性存在缺陷，早期饲喂 对断奶过渡期间微生物群发育以及猪健康影响显著。由于断奶后 时仔猪相比于刚断奶的仔猪来说具有更为完善的胃肠道功能，且体内的消化酶活性、免疫功能以及抗 期刘春艳等：猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响病能力增强，因此乳酸菌对断奶后 猪的影响相对有限。大肠中的微生物组与小肠中的微生物组不同，并且比小肠中的微生物组更稳定，这可能是结肠不论是在前期或者后期都保持结果稳定的原因。结 论 饲粮中添加 猪源 可提高仔猪断奶后 的平均日增重，改善小肠绒毛高度与绒毛高度 隐窝深度，显著增加仔猪结肠紧密连接蛋白、黏液素、抗菌肽及 样受体基因的表达。由此可见，猪源 能够改善断奶后 仔猪生长性能、小肠绒毛形态及结肠肠道上皮屏障功能。参考文献：吴胜男，胡胜兰，蒋宗勇，等罗伊氏乳杆菌调节肠黏膜屏障功能的作用及机制 动物营养学报，（）：，（）：（），：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，：，（）：杨广达，王丽，易宏波，等罗伊氏乳杆菌 对断奶仔猪血清生化指标和肠道营养物质转运载体 表达的影响 动物营养学报，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，：，：，动 物 营 养 学 报 卷 ，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：期刘春艳等：猪源罗伊氏乳杆菌 对断奶后 仔猪生长性能和肠道上皮屏障功能的影响：，：；，：（责任编辑 陈 鑫），（，；，）：，（，），（，）（，）（）：），（），（），（），（），（）（），（），（）（），（），（）（），（）：；