猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)生产用毒种不同代次生物学特性的研究.pdf

猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究丘成文1，赖月辉1*，齐冬梅1，吴文福1，侯高伟1，周晓敏1，陈坚1，徐少珠1，张国丽1，陈建凯1，2，张璞1，2，曾垠涛1（1.广东永顺生物制药股份有限公司，广东 广州 5113562.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231）摘 要：将猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）基础毒种F7传至F13，并将PRVF8PRV F13六个代次毒种接种仔猪进行安全性检验，PRV F8、PRV F10、PRV F13三个代次毒种接种仔猪进行免疫原性检验，用以研究猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性。安全性检验结果显示，各代次毒种经颈部肌肉接种仔猪，观察期内仔猪精神、食欲、体温均正常；免疫原性检验结果显示，免疫组仔猪攻毒后精神、食欲、体温均正常，对照组仔猪攻毒后体温升高，全部发病并死亡。以上结果表明，猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）不同代次的生产毒种对仔猪均安全且保持良好的免疫原性。关键词：猪伪狂犬病活疫苗；生产用毒种；安全性检验；免疫原性检验；生物学特性中图分类号：S852.5文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04002505Study on the Biological Characteristics of DifferentGenerations of Porcine Pseudorabies Live Vaccine(BarthaK61 Strain，Cell Line Origin)in Swine ProductionQIU Chengwen1，LAI Yuehui1*，QI Dongmei1，WU Wenfu1，HOU Gaowei1，ZHOU Xiaomin1，CHEN Jian1，XU Shaozhu1，ZHANG guo li1，CHEN Jiankai1，2，ZHANG Pu1，2，ZENG Yintao1（1.Guangdong winsun biophamaceutical co.，Ltd.，Guangzhou Guangdong 511356；2.College of life science and engineering，Foshan University，Foshan Guangdong 528231）Abstract：To study the biological characteristics of different generations of porcine pseudorabies live vaccine（BarthaK61 strain，cell line origin）production virus seeds，the porcine pseudorabies live vaccine（BarthaK61strain，cell line origin）basic virus seed F7 was continuously passaged to F13，and six generations of PRV F8PRVF13 were inoculated with piglets for safety test，and three generations of PRV F8、PRV F10 and PRV F13 wereinoculated with piglets for immunogenicity test.The results of the safety test showed that the spirit，appetite，and bodytemperature of piglets were normal during the observation period after each generation of production virus seeds wereinoculated on the neck muscles；the results of the immunogenicity test showed that the spirit，appetite，and body收稿日期：20220304作者简介：丘成文（1983年生），助理兽医师，从事兽用生物制品的生产。Email：*通讯作者：赖月辉（1972年生），高级兽医师，从事兽用生物制品的研发与生产。Email：Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.05广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期试验研究 25试验研究猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究丘成文，等伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病12。患病动物病死率高，但成年猪死亡率低，也不发生奇痒，妊娠母猪可导致死胎和流产3。预防本病的发生，主要措施是加强兽医卫生管理、猪场净化和疫苗免疫接种45。其中，疫苗免疫接种是减少猪群经济损失的最有效方法。猪群的免疫效果关键在于疫苗质量的优劣，而毒种是疫苗的根基，为保证疫苗的良好免疫原性，必须把好毒种的质量关，为此本文对伪狂犬病病毒（Bartha K61株）生产用毒种进行了安全性和免疫原性等生物学特性的研究，总结如下。1材料与方法1.1毒种伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）基础毒种F7代（PRV F7）、检验用强毒PRV GD株，均由广东永顺生物制药股份有限公司制备、鉴定和保存6。1.2细胞猪睾丸（ST）传代细胞系，由广东永顺生物制药股份有限公司提供。1.3仔猪来源于广东永顺生物制药股份有限公司定点供应猪场，无PRV、CSFV、PRRSV病史以及伪狂犬病抗原抗体阴性的2025日龄健康易感仔猪。1.4生产种子批的建立生产种子批由基础种子批经猪睾丸（ST）传代细胞繁殖传代而来，取同一批次长成良好单层的ST 传代细胞，接入适量的基础毒种 PRV F7，置37、含5%二氧化碳培养箱中培养，定期观察细胞 病 变（cytopathic effect，CPE），当 CPE 达 到80%90%以上时收获细胞培养物，根据特定生产种子批的检验标准进行系统检验，检验结果合格后可作为生产用毒种种子批PRV F8。用此方法将PRV传至F13（PRV F13）。1.5安全性检验用2025日龄健康易感仔猪35头，随机分为7组，每组5头，将六个不同代次的生产用毒种种子批PRV F8PRV F13分别用猪用疫苗稀释液稀释为107.0TCID50/mL，分别接种5头仔猪，每头仔猪颈部肌肉接种 1.0 mL；剩余 5 头仔猪作为对照组，每头仔猪颈部肌肉接种猪用疫苗稀释液1.0 mL。接种后观察14天，每天上、下午各测直肠温一次。1.6免疫原性检验用 2025 日龄健康易感仔猪 20 头，随机分为4组，每组5头仔猪，选取3个不同代次的生产用毒种种子批 PRV F8、PRV F10、PRV F13，分别用猪用疫苗稀释液稀释为103.0TCID50/mL，分别接种5头仔猪，每头仔猪颈部肌肉接种1.0 mL；剩余5头仔猪作为对照组，每头仔猪颈部肌肉接种猪用疫苗稀释液1.0 mL。免疫后10日，每头仔猪颈部肌肉接种检验用强毒PRV GD株1.0 mL（病毒含量为106.0TCID50/mL）；攻毒后观察14日，每天上、下午各测直肠温一次，期间应注意观察试验猪的临床症状，死亡猪应剖检观察其内脏器官的病理变化。2结果与分析2.1安全性检验结果将生产用毒种种子批PRV F8PRV F13接种猪，临床观察14天，免疫组的试验猪精神、食欲、体温均正常，未出现因注射PRV毒种引起的可见不良反应，免疫组与对照组的试验猪相比临床症状无明显差异。详细结果见表1，体温结果如图1所示。temperature of piglets in the immune group were normal after postinfection with PRV GD1 strain；while the bodytemperature of piglets in the control group was increased after postinfection with PRV GD1 strain，and all of thembecame ill and died.These results indicated that the different generations of porcine pseudorabies live vaccine（BarthaK61 strain，cell line origin）production virus seeds were safe and maintained good immunogenicity to piglets.Keywords：Porcine pseudorabies live caccine；Production virus seeds；Safety test；Immunogenicitytest；Biological characteristics 26图1生产用毒种PRV F8F13对仔猪安全性试验的体温猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究丘成文，等试验研究 27试验研究猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究丘成文，等表1不同代次PRV生产用毒种对猪的安全性检验结果组别PRV F8PRV F9PRV F10PRV F11PRV F12PRV F13对照组数量（头）5555555疫苗接种剂量107.0TCID50107.0TCID50107.0TCID50107.0TCID50107.0TCID50107.0TCID50/临床症状体温、精神、食欲、正常体温、精神、食欲、正常体温、精神、食欲、正常体温、精神、食欲、正常体温、精神、食欲、正常体温、精神、食欲、正常体温、精神、食欲、正常结论5/5安全5/5安全5/5安全5/5安全5/5安全5/5安全5/5安全图2生产毒种PRV F8、PRV F10、PRV F13免疫仔猪攻击PRV GD株强毒的体温2.2免疫原性检验结果将三个不同代次的生产用毒种种子批 PRVF8、PRV F10、PRV F13 分别用稀释液稀释为 103.0TCID50/mL，分别接种健康易感仔猪5头，于免疫后10日攻击PRV GD1株强毒，攻毒后免疫猪的精神、食欲正常、除个别猪的体温稍有一过性升高外其他猪的体温均正常，免疫组仔猪全部健活，保护率5/5。对照仔猪攻毒后表现精神倦怠、厌食和发热（40.5 以上），出现震颤、呼吸困难、有呕吐和腹泻 28等现象，对照仔猪于攻毒后10天内全部死亡，发病率死亡率均为100%（5/5）。详细结果见表2，攻毒猪体温如图2所示。3讨论治疗猪伪狂犬病目前尚无特效药，预防猪伪狂犬病的主要措施依然是免疫接种PRV疫苗，疫苗免疫接种是防患于未然，也是减少经济损失最有效的方法，猪群的免疫效果好坏关键在于制苗毒种的免疫原性及制备疫苗的质量，优质高效的疫苗能使猪产生良好的免疫力。笔者对猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用种子批细胞毒种PRV F8PRV F13的6个不同代次进行健康易感仔猪的本动物实验，BarthaK61株毒种传至F13代，毒株对仔猪安全，免疫猪能抵抗PRV强毒的攻击，试验数据证明PRV BarthaK61株毒种仍能很好地保护易感猪不发病。试验结果与吴文福等研究一致，表明PRV传至F13依然对仔猪保持良好的免疫原性7。PRV是 DNA 病毒，相对RNA病毒而言，其发生变异的概率较低，但2011年以后陆续在全国各地发现并分离得到了PRV变异株，针对PRV变异株的防护，周金柱研究发现BarthaK61株疫苗对PRV变异株和经典株仍然可以提供良好的免疫保护8。目前，国内猪场使用的猪伪狂犬病疫苗毒株以PRV BarthaK61株为主要代表，根据大畜牧的数据统计：2021 年获得伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株）批签发的生产企业有40家，批签发总数998批，比2020年增加103批，增长11.51%，为近5年最多。而猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源），目前只有永顺生物获得该产品的批准文号，2021 年获得该产品的批签数 13 批，表明PRV BarthaK61株是目前国内使用数量较多、应用范围较广的经典疫苗毒株，以此毒株制备的疫苗在伪狂犬净化过程中起到了关键性作用。4结论用基础毒种PRV F7作为毒种制备的生产用种子批细胞毒种PRV F8PRV F13，经本动物仔猪安全性检验，结果六个不同代次的PRV毒种对仔猪均安全，符合猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种标准的要求。用基础毒种PRV F7作为毒种，制备的生产用种子批细胞毒种 PRV F8PRV F13，分别选取PRV F8、PRV F10、PRV F13这3个代次的PRV毒种免疫仔猪，10天后仔猪能完全抵抗PRV GD株强毒的攻击，表现出对仔猪具有良好的免疫保护效果。参考文献：1 殷震，刘景华.动物病毒学 M.第2版.北京：科学出版社，1997：780781.2 POMERANZ L E，REYNOLDS A E，HENGARTNER C J.Molecularbiologyofpseudorabiesvirus：impactonneurovirology and veterinary medicineJ.Microbiology andMolecular Biology Reviews，2005，69（3）：462500.3 傅宏庆，姚志兰，刘轶秋，等.猪伪狂犬病毒YZ株的分离鉴定及遗传进化分析 J.扬州大学学报，2020，41（5）：3641.4 尹佳彤，马湘海，袁晨阳，等.猪伪狂犬病防控进展 J.畜禽业，2021，32（5）：9192.5 张志安，王妍瑾，马增军.种猪场伪狂犬病的净化策略 J.猪业科学，2020，37（8）：3538.6 邹伟斌，赖月辉，牛贝贝，等.猪伪狂犬病病毒变异株GD株的分离鉴定及TK和gE基因的进化分析 J.现代畜牧兽医，2019（10）：815.7 吴文福，林德锐，黄秋雪，等.猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）最小免疫剂量的研究 J.广东畜牧兽医科技，2018，43（5）：4952.8 周金柱.Barthak61株疫苗对猪伪狂犬病病毒变异株的免疫保护及变异株生物学特性的初步研究 D.扬州：扬州大学，2018.表2不同代次PRV生产用毒种对猪的免疫原性检验结果组别PRV F8PRV F10PRV F13对照组数量（头）5555疫苗接种剂量1103.0TCID501103.0TCID501103.0TCID50/强毒攻毒剂量1106.0TCID501106.0TCID501106.0TCID501106.0TCID50保护率5/55/55/50/5发病率0/50/50/55/5死亡率0/50/50/55/5猪伪狂犬病活疫苗（BarthaK61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究丘成文，等试验研究 29