转运蛋白在细菌吸附铜(Ⅱ)中的作用机理研究_张永合.pdf

Geological hazard susceptibilityevaluation by coupled andom Forestand information model:a case studyof Gongbujiangda County，TibetAutonomous egionLIU Fuzhen1，DAI Tianyu1，WANG Junchao2，WANG Ling1，SU Yong1，LIU Hexiao1，ZHANG Haowei1，WANG Yali3(1 School of Civil Engineering and Architecture，SouthwestPetroleum University，Chengdu 610500，China;2 Institute ofExploration Technology，China Academy of Geological Sciences，Chengdu611730，China;3GuangyuanChinaNuclearVocational and Technical College，Guangyuan 628003，Sichuan，China)Abstract:The present paper conducts a sensitivity assessment ofthe Geological hazards in hoping to prevent or reduce theGeological hazards，which is an indispensable part of its researchobjectives For this purpose，we would like to choose the currentarea of Gongbujiangda County as the study area and combine themulti-remote sensing data and its field survey results as the datasource，the research unit is 30 m 30 m grid，by starting fromthe disaster-causing factors and the potential disaster and hiddenenvironment That is the 11 influential factors such as therainfall intensity，the formation lithology，the distance from thefault source，the NDVI，terrain fluctuation，etc The selectedfactors are distinguished in rank;the information quantity is usedas the basis to construct the geological hazards susceptibilityevaluation model，and the weight of each factor is determined bythe andom forest algorithm to complete the information quantitymodel assignment;the F-information model is used to analyzethe susceptibility of geological hazards in the study area，and theaccuracy of the evaluation is verified by using historical hazardpoints and OC curves Then based on the results of our study，the following conclusions can be obtained(1)the three mainfactors which affect the development of geohazards in the studyarea are soil type，formation lithology，and planar curvature;(2)the proportions of the low，medium，high，and very highsusceptibility areas to the total area of the county are 54.43%，23.74%，14.91%，and 6.92%，respectively;(3)the areas inthe county that are in high or very high susceptibility are mostlynear the gullies;(4)last of all，the accuracy of the model hasbeen testified，and the AUC values of the F informationmodel and the information model are 0.912 and 0.903.That isto say，the evaluation accuracy of the information model can beimproved byusingtheandomforestalgorithm，anditsevaluation results are idealIn summary，the results of theassessment study of this paper can provide valuable decisions forthe geological hazards in Gongbujiangda County Zone，in TibetKey words:public safety;geo-hazard susceptibility;evaluationfactor;F information volume;GongbujiangdaCounty文章编号:1009-6094(2023)07-2438-09转运蛋白在细菌吸附铜()中的作用机理研究*张永合1，孙尚琛1，王永刚2，陈吉祥3，冷非凡3，南文瑄1(1 兰州资源环境职业技术大学黄河流域生态环境产教融合研究院，兰州 730030;2 兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730050;3 兰州理工大学石油化工学院，兰州 730050)摘要:为研究转运蛋白在细菌响应铜()胁迫中发挥的作用，从 Transporter Classification Database(TCDB)数据库中检索得到嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)JC1 基因组中 4 个参与 Cu()吸附、转运和外排的转运蛋白，并对其结构和功能进行分析。此外，研究菌株 JC1 对不同质量浓度的 Cu2+的吸附能力和耐受能力，并利用扫描电镜(SEM)、能量色散 X 射线光谱仪(EDS)和傅里叶变换红外光谱仪(FT I)分别分析 Cu2+胁迫后，菌株 JC1 的形态学、元素组成和官能团的变化。结果显示，菌株 JC1 可耐受 Cu2+的质量浓度为 160 mg/L，但对 120 mg/L Cu2+有最大吸附率，为72.3%。经 Cu2+胁迫后，菌株 JC1 光滑的杆状结构消失，表面褶皱、呈短杆状，且其元素组成中出现了3 个 Cu2+吸收峰。FT I 分析结果表明，OH、CO 和CC 等官能团在菌株 JC1 胞外吸附 Cu2+中发挥了重要作用。对 4 个转运蛋白质的结构分析结果显示，铜稳态蛋白 cutC 同源物存在于细胞质中，其氨基酸序列中有多个 Cu2+结合位点，可为菌株JC1 吸附 Cu2+提供条件。铜抗性蛋白 A 位于周质空间，其特异性负责对 Cu2+的吸附。CopB 是一种外膜孔蛋白，其氨基酸中含有的 N、O、P 等元素为菌株 JC1 与重金属的结合提供了电子。另外，菌株 JC1 的铜转位 P ATPase 属于 P1B ATPase，含有 8 个跨膜结构，其中 N 端含有丰富的组氨酸残基在菌株 JC1 结合 Cu2+过程中发挥重要作用。关键词:环境科学技术基础学科;嗜根寡养单胞菌 JC1;转运蛋白质;吸附;结构;机理中图分类号:X172文献标志码:ADOI:10.13637/j issn 1009-6094.2022.2291*收稿日期:2022 10 27作者简介:张永合，副教授，从事环境微生物相关研究，zhangyhe lzre edu cn;孙尚琛(通信作者)，博士，从事环境微生物相关研究，ssc210745 lzre edu cn。基金项目:国家自然科学基金项目(32260566);兰州资源环境职业技术大学校级成果培育转化项目(X2022E 02);甘肃省自然科学基金项目(22J5A804)8342第 23 卷第 7 期2023 年 7 月安全 与 环 境 学 报Journal of Safety and EnvironmentVol 23No 7Jul，20230引言目前，随着我国工业化进程不断深入及城市化水平的逐步提高，重金属污染带来的危害已成为严重制约我国经济发展与影响居民生活质量的因素之一 1。铜作为一种必需元素，在生态系统中发挥着重要作用，如适量铜会参与植物的光合作用与氧分子的还原以及人体的抗氧化作用等 2 3。但当铜在人体或植物组织超量积累后，会严重损害人体的肝、肾、脑等 3 或影响植物的光合作用，导致生长受限 2。由于微生物可培养性强，细胞壁表面带有大量负电荷等优势，依赖于微生物的生物吸附策略被认为是对重金属污染物治理最有前景的技术 4 5。Bradley 等 6 在 1981年首次发现生长于铜(锌)矿区周围的植物非常稀疏，在生长的少量植物中，石楠菌根植物比非菌根植物长势好。该结果为后期研究真菌对重金属的吸附提供了思路，进而为生物技术吸附重金属污染物奠定了基础。此后，诸多真菌类或细菌类微生物资源被挖掘，如内节杆菌(Arthobacter)Sphe3 和球形芽孢杆菌(Bsphaericus)吸附 Cu2+10 min 时，可分别去除 80%和85%的 Cu2+7。多毛链霉菌(S pilosus)利用细胞壁表面的COOH 可高效吸附 Cu2+8，将铜绿假单胞菌(P aeruginosa)和柔性聚乙烯导管耦合后可高效去除污水中90%以上的 Cu2+等 9。基于诸多研究结果，微生物细胞对重金属的吸附总体可分胞外吸附和胞内沉淀 2 种。当微生物细胞受外界重金属离子胁迫时，其细胞壁表面的阴离子基团和细胞膜的通透性可完成对一部分重金属离子的螯合和防御10。另一部分金属离子在相关转运蛋白的作用下跨膜转运至细胞质，并在胞内完成积累。因此转运蛋白在微生物细胞对重金属离子的胞内积累过程中发挥重要作用，其结构类型、氨基酸组成等因素会影响被转运金属离子的种类、数量11。Margoshes 等12 于 1957 年首次从马肾中分离得到金属硫蛋白(Metallothionein，MT)，通过解析其结构发现这类蛋白中含有的巯基具有高度的亲核性，易于与 Cu、Zn、Cd 等金属离子结合。该结果为研究微生物、植物吸附重金属中转运蛋白的作用机制奠定了基础。另外，Zhao 等13 成功地从鼠伤寒沙门氏菌(S typhimurium)中分离得到新的 GolB 蛋白，通过对其晶体结构解离分析发现，该蛋白可高选择性地结合 Au+和 Cu2+。安鹏虎等14 研究发现，P1B ATPases 的结构主要包括 1 个结构域、3 个功能域、1 个 N 末端和 C 末端金属结合域。在这 4个结构的共同作用下，P1B ATPases 可完成植物细胞对 Cu2+、Zn2+、Pb2+等离子的吸附和解毒。嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)作为一种植物根际促生菌已被研究显示在改良土壤性状、吸附重金属离子(Cr6+、Pb2+、Zn2+等)过程中发挥了重要作用15 16。本文以嗜根寡养单胞菌株JC1 为目标菌株，研究其对不同质量浓度 Cu2+的去除能力和生理学性能，并从 TCDB 数据库中筛选得到菌株 JC1 基因组中的铜稳态蛋白 cutC 同源物、铜抗性蛋白 A、CopB 和铜转位 P ATPase 4 个参与Cu2+吸附的转运蛋白。通过分析这 4 个转运蛋白的理化性质、二级结构、三级结构等，以期揭示其在菌株 JC1 吸附 Cu2+过程中的生物学机理，为研究菌株JC1 吸附 Cu2+分子机理和定向修饰奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1菌株嗜根寡养单胞菌 JC1 保存于兰州理工大学生命科学学院。1.1.2试剂蛋白胨(A，上海生工生物工程有限公司)、酵母(A，上海生工生物工程有限公司)、琼脂(A，上海生工生物工程有限公司)、NaCl(A，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、CuSO4(A，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、葡萄糖(A，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。1.1.3仪器超净工作台(CJ 2S，天津市泰斯特仪器有限公司)、恒温培养箱(DPH 9082，成都一科仪器设备有限公司)、恒温振荡培养箱(HZQ 98A，上海天呈实验仪器有限公司)、石墨炉火焰原子吸收光谱仪(SDA 100FG，济南上地电子科技有限公司)、扫描电子显微镜(JSM 5600LV，日本电子光学公司)、傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet Summit，美国赛默飞公司)。1.2方法1.2.1菌株的活化、培养挑取菌株 JC1 单菌落至 5 mL LB 液体培养基，在 170 r/min、30 下振荡培养 36 48 h。然后按2%的接种量接种至50 mL LB 液体培养基中，在170r/min、30 下振荡培养 36 48 h。培养结束后，以8 000 r/min 离心10 min，收集细菌沉淀，并将细菌沉淀用去离子水洗涤 3 次。1.2.2菌株对不同质量浓度 Cu2+的去除能力及耐受能力研究准确称取 10 mg 菌体，分别将质量浓度为 0、40mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L 和 200 mg/L 的93422023 年 7 月张永合，等:转运蛋白在细菌吸附铜()中的作用机理研究Jul，2023Cu2+加入于 LB 培养液中，在 170 r/min、30 下振荡培养 48 h。培养结束后，以 8 000 r/min 离心 10min，分别收集菌体沉淀和上清液，上述试验均重复3 次。其中沉淀质量用于评价菌株对不同质量浓度Cu2+的耐受能力，上清液中 Cu2+的质量浓度利用石墨炉火焰原子吸收光谱仪测得，以用于评价菌株对不同质量浓度 Cu2+的去除效率，见式(1)。=(0 1)/0 100%(1)式中 为菌株对 Cu2+的去除能力，%;0为 Cu2+的初始质量浓度，mg/L;1为上清液中 Cu2+的质量浓度，mg/L。1.2.3Cu2+对菌株 JC1 细胞形态的影响称取 10 mg 用去离子水洗涤干净的 JC1 菌体，分别将质量浓度为0 和120 mg/L Cu2+加入于 LB 培养液中，在 170 r/min、30 下振荡培养 48 h。培养结束后制取扫描电镜分析样品，制备方法参照文献 17。1.2.4Cu2+对菌株 JC1 官能团及元素组成的影响称取 10 mg 用去离子水洗涤干净的 JC1 菌体，分别将质量浓度为0 和120 mg/L Cu2+加入于 LB 培养液中，在 170 r/min、30 下振荡培养 48 h。培养结束后，于 8 000 r/min 离心 10 min，收集细胞沉淀。获得的细胞沉淀分别用 FT I 与 EDS 以分析 Cu2+对菌株 JC1 官能团和元素组成的影响。1.2.5菌株 JC1 基因组中参与 Cu2+吸附的转运蛋白结构与功能研究通过 TCDB 数据库(https:/tcdb org/)检索得到菌株 JC1 基因组中的转运蛋白，依据其功能共预测到 4 个直接参与 Cu2+吸附的蛋白质。然后利用在线分析软件对 4 个蛋白质的氨基酸序列、理化性质、结构域及功能进行分析，以进一步分析其在菌株JC1 中对 Cu2+吸附中发挥的功能。2结果与分析2.1菌株 JC1 对不同质量浓度 Cu2+的耐受能力及去除能力菌株 JC1 对不同质量浓度 Cu2+的耐受能力见图 1(a)。菌株 JC1 在质量浓度为 40 120 mg/LCu2+的 LB 培养基中生长 48 h 后，其菌体质量与对照(Check，CK)无显著差异(p 0.5)，即 40 120mg/L Cu2+对菌株 JC1 的生长无抑制影响。当 Cu2+质量浓度为 160 mg/L 时，菌株 JC1 的菌体质量显著下降(p 0.001)，表明该质量浓度下 Cu2+对菌株JC1 的生长有抑制影响;而当 Cu2+质量浓度为 200mg/L 时，菌体质量仅为(10 0.32)mg，与菌体的投加量一致，表明该质量浓度的 Cu2+完全抑制了菌株 JC1 的生长。菌株 JC1 对不同质量浓度 Cu2+的去除能力见图 1(b)。在 48 h 的吸附时间内，菌株 JC1 对 40 120 mg/L Cu2+的去除效率随 Cu2+质量浓度的增加而增大，且对 120 mg/L Cu2+的去除效率达最大，为(72.3 0.87)%。之后，随着 Cu2+质量浓度的增加，去除效率逐渐降低。进一步分析发现，尽管菌株JC1 在 200 mg/L Cu2+环境中无法生长(图 1(a)，但对 200 mg/L Cu2+仍有(10.2 0.45)%的吸附能力(图 1(b)。这是因为细菌细胞壁中含有大量的阴离子官能团，如COOH、OH 等，无论是死亡菌体还是活菌株均可利用细胞壁中的阴离子基团与重金属发生配位反应18 19。ns 代表 p 0.05，代表 p 0.01，代表 p 0.001。图 1菌株 JC1 对不同质量浓度 Cu2+的耐受能力和吸附能力Fig 1Tolerance and adsorption ability of strain JC1to different mass concentrations of Cu2+2.2Cu2+对菌株 JC1 细胞形态的影响为研究 Cu2+胁迫对菌株 JC1 细胞形态的影响，0442Vol 23No 7安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 7 期利用 SEM 观察菌株 JC1 与 120 mg/L Cu2+接触 48 h后细菌的形态结构变化，见图 2。未受 Cu2+胁迫的菌株 JC1 表面光滑、结构完整，呈均匀的杆状，而经Cu2+胁迫后的菌株 JC1 表面褶皱、均匀的杆状结构消失，呈短杆状且有颗粒物形成。通常，细菌通过缩小体积或伸长细胞 2 种方式响应重金属刺激，这与重金属类型和细菌类型密切相关20。当细菌可以吸附较多的金属离子时，细菌普遍增大;而当细菌无法吸附过多的金属离子时，通常会缩小体积以维持其正常生长20。研究表明，成团 范 式 菌(Pantoeaagglomerans)和 酸 胞 菌(Acidocella)经 Cu2+胁 迫 后，细 胞 变 长 且 呈 丝状21 22。而菌株 JC1 吸附 Cu2+后，细胞变得短小且褶皱，可能是因为菌株 JC1 对 Cu2+的吸附更多地发生于细胞质，使得菌株失水所致18。图 2Cu2+对菌株 JC1 形态的影响Fig 2Effect of Cu2+on cell morphology of strain JC12.3Cu2+对菌株 JC1 官能团和元素组成的影响细菌细胞对重金属的胞外吸附一般依赖于细胞壁表面阴离子官能团，如羧基、巯基、氨基、羰基、羟基 等23。Golab 等8 研 究 显 示 多 毛 链 霉 菌(Streptomyces pilosus)主要依靠COOH 以实现对Cu2+的高效吸附。假单胞菌(P plecoglossicida)在吸附 Cd2+时，主要由NH、OH、CH、CONH发挥作用24。苍白杆菌(O intermedium)LBr 主要通 过COOH、OH 和NH 表 面 络 合 Cu2+和Cr6+18。为研究菌株 JC1 细胞壁中参与 Cu2+胞外吸附的官能团，利用 FT I 研究了菌株 JC1 吸附Cu2+前后官能团的变化，见图 3。与对照相比，吸附Cu2+后的菌株 JC1 在 3 365 cm1处有很强的 OH的伸缩振动峰，在1 600 cm1处有 CC 的伸缩振动峰，在 1 420 cm1处有很强的 CO 伸缩振动峰。以上结果表明，OH、CC、CO 等官能团在菌株 JC1 胞外吸附 Cu2+时发挥重要作用。图 3Cu2+对菌株 JC1 官能团的影响Fig 3Effect of Cu2+on functional group of strain JC1为验证菌株 JC1 形态结构、官能团的变化为Cu2+胁迫所致，利用 EDS 研究了菌株 JC1 吸附 Cu2+前后元素组成的变化，见图 4。未经 Cu2+胁迫的菌株 JC1 所含元素主要为 C、O、P、S、Ca、Si 等;经 Cu2+胁迫后，菌株 JC1 除了含有 C、O、P、S、Ca 的吸收峰外，还出现 4 个 Cu2+的吸收峰，表明菌株 JC1 吸附了 Cu2+。进一步研究发现，经 Cu2+胁迫后，菌株JC1 中 Si 元素的吸收峰消失，C、O、S 等必需元素的吸收峰增强或减弱，这可能与原子所带电荷与原子半径有关。如 Cu 的原子半径大于 Si，则 Cu 可通过与 Si 竞争细菌表面的结合位点而将 Si 置换。Wang等25 利用 EDS 研究路德维希肠杆菌(E ludwigii)LY6 吸附 Cd2+时发现 S 与 Cd 的含量一致，即认为Cd2+胁迫后 E ludwigii 细胞表面形成的颗粒物是 S与 Cd 结合形成的 CdS 沉淀。而菌株 JC1 各必需元素含量与 Cu 含量差异较大，推测 Cu2+胁迫后 JC1细菌表面形成的颗粒物可能是 Cu2+与细胞壁表面的阴离子络合或螯合形成的不溶性沉淀物。2.4转运蛋白生物信息学分析通过 TCDB 数据库从菌株 JC1 基因组中筛选得到4 个参与 Cu2+吸附的转运蛋白，分别研究其理化性质、结构域等，4 个转运蛋白的登录号及名称见表1。2.4.1氨基酸序列及理化性质利用 ExPASy(https:/web expasy org/protparam/)14422023 年 7 月张永合，等:转运蛋白在细菌吸附铜()中的作用机理研究Jul，2023表 24 个转运蛋白氨基酸序列分析Table 2Amino acid sequence analysis of four transporters蛋白质登录号氨基酸数目非极性氨基酸极性不带电荷氨基酸极性带正电荷氨基酸(ArgLys)极性带负电荷氨基酸(AspGlu)总数含量最多含量最少数目比例/%数目比例/%数目比例/%数目比例/%Q9NTM9273GlyLeu(9.9%)Tyr(1.1%)10839.610036.63412.53111.3Q4KCN4579Gly(9.3%)Cys(0.5%)26245.219133569.77012.1F4ZBX4422Ala(14.9%)Trp(1.7%)18142.916539.2296.84711.1.D1CA99785Ala(15.3%)Cys(0.1%)40151.121527.4678.510213注:Gly 为 Glycine，甘氨酸;Leu 为 Leucine，亮氨酸;Tyr 为 Tyrosine，酪氨酸;Cys 为 Cystine，半胱氨酸;Trp 为 Tryptophan，色氨酸;Arg 为Arginine，精氨酸;Lys 为 Lysine，赖氨酸;Asp 为 Asparticacid，天冬氨酸;Glu 为 Glutamicacid，谷氨酸。分析软件对 4 个蛋白质的氨基酸序列和理化性质分别进行分析。4 个转运蛋白的氨基酸序列相关特性见表2。铜稳态蛋白 cutC 同源物和铜抗性蛋白 A 的图 4Cu2+胁迫对菌株 JC1 元素组成的影响Fig 4Effect on elemental composition of strainJC1 through Cu2+stress氨基酸序列中含量最多的均为甘氨酸(Glycine，Gly)，CopB 和铜转位 P ATPase 的氨基酸序列中含量最多的均为丙氨酸(Alanine，Ala)。Gly 和 Ala 中通常富含 S、O、N 等元素，可作为电子供体实现对金属离子的络合26。进一步分析发现，铜抗性蛋白A、CopB 和铜转位 P ATPase 的氨基酸，酸性氨基酸总数均大于碱性氨基酸总数，但铜稳态蛋白 cutC 同源物的氨基酸，酸性氨基酸数(11.3%)略小于碱性氨基酸数(12.5%)。一般情况下，COOH 在螯合金属阳离子中发挥巨大作用，而酸性氨基酸中较多的COOH 为细菌对金属离子的螯合提供了更多的阴离子基团18。4 个转运蛋白质的理化性质见表 3。根据理论等电 点 可 知，铜 抗 性 蛋 白 A、CopB 和 铜 转 位P ATPase 均为酸性蛋白质，表明COOH 数多于表 1菌株 JC1 基因组中参与 Cu2+吸附的转运蛋白信息Table 1Information of transporter involved in Cu2+adsorption in strain JC1 genome蛋白登录号TCDB登录号基因名称蛋白质名称Q9NTM99.B 158.1.1CUTC铜稳态蛋白 cutC 同源物Q4KCN49.B 62.1.5copA铜抗性蛋白 AF4ZBX41.B 76.1.1copBCopBD1CA993.A 3.5.38铜转位 P ATPase注:代表未查询到其基因名称。2442Vol 23No 7安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 7 期NH2，可为细菌与金属离子的结合提供更多阴离子。从不稳定系数和总平均亲水系数推断，铜抗性蛋白 A 和 CopB 为不稳定的亲水性蛋白，易发生解离。表 34 个转运蛋白理化性质分析Table 3Physicochemical properties analysis of four transporters蛋白质登录号相对分子质量理论等电点原子组成消光系数半衰期不稳定系数总平均亲水系数脂肪系数Q9NTM929 340.998.47C1269H2097N369O388S190.165/0.15210 h45.670.01992.16Q4KCN464 435.075.97C2853H4398N824O829S291.419/1.41710 h45.130.35476.51F4ZBX444 949.895.32C1935H3016N572O626S201.12210 h32.670.49461.97D1CA9983 207.565.54C3665H5863N1093O1089S170.81710 h30.730.084102.962.4.2结构及功能分析通过分析 4 个蛋白质的氨基酸保守序列发现，铜稳态蛋白 cutC 同源物存在于细胞质，属于 CutC家族成员，可参与铜的摄取、储存，传递和外流27。进一步分析发现，铜稳态蛋白 cutC 氨基酸序列的 31和 52 位点处分别有一个 Cu2+结合位点，在其 C 末端是 2 个严格保守的半胱氨酸残基，可增强 cutC 与Cu2+的结合。铜抗性蛋白 A 含有 1 个跨膜结构，并位于周质空间，属于铜抗性蛋白 CopD 家族。铜抗性蛋白 A 氨基酸序列 177 351 为 Cu2+的结合位点，特异性负责 Cu2+的结合。457 573 位点为氧化还原酶活性位点，通过水解三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate，ATP)为 Cu2+的转运和外流提供能量。有研究表明，处于对数生长期的细菌有利于铜抗性蛋白 A 对 Cu2+的结合，但在稳定期的细菌对 Cu2+的吸附能力很低28。CopB 是一种外膜孔蛋白，有一个 N 端氨基酸残基，以及亲水性的脯氨酸/丙氨酸结构域和一个含有 10 个 链的 C 端结构域。此外，在 CopB 外膜孔蛋白氨基酸的 29 55 和101 146 位点处分别有一个极性氨基酸残基，其含有的 S、O、P 等元素在结合重金属过程中可提供电子29。实际上，CopA、CopB、CopC 和 CopD 4 个蛋白质构成了完整的 Cu2+抗性系统，其中 CopC 在周质中与 Cu2+有高效的亲和力，CopD 是一种膜蛋白，负责 Cu2+的跨膜转运，CopB 是一种外膜蛋白。这3 种蛋白与 CopA 共同作用实现对 Cu2+的摄取、跨膜转运和外排30。铜转位 P ATPase 含有 8 个跨膜结构，属于 P1B ATPase，N 端含有丰富的组氨酸残基，具有 ATP 酶偶联阳离子跨膜转运蛋白活性和金属离子结合能力。在研究 Sphaerobacter thermophilus的铜转位 P ATPase 生化和光谱特征时发现，尽管该蛋白能高效结合 Cu2+，但结合位点不在其跨膜结构域31。此外，尽管二价金属离子的存在会显著抑制 P ATPase 的活性，但在运输 Cu+时，P ATPase却发挥重要功能32。2.4.3二级结构和三级结构预测通过 SOPMA(http:/pbil ibcp fr/)在线软件预测得到的 4 个蛋白质的二级结构见表 4。铜稳态蛋白 cutC 同源物和铜转位 P ATPase 的二级结构数分数由大到小依次均为 螺旋、无规则卷曲、延伸链、转角，CopB 和铜抗性蛋白 A 的二级结构数分数由大到小依次均为无规则卷曲、螺旋、延伸链、转角。有研究表明，当细菌受外界刺激时，相关蛋白质的 螺旋和无规则卷曲在其三级结构的稳定性维持和功能发挥中起重要作用33。在蛋白质的 螺旋结构中，氨基酸的 基团一般指向外和下，可避免与多肽链的主干部分之间发生位阻，进而促进了氨基酸 基团与重金属离子的结合33。另外，螺旋结构非常灵活，可通过改变其构象对外界刺激做到及时响应，进而保护细菌免受破坏。尽管 转角在 4 个蛋白质中的数分数均为最低，但其含有大量的甘氨酸和丙氨酸残基，可为重金属离子的还原提供 O、P、S 等电子配体，进而实现细菌对重金属的降解34。进一步通过 SWISS MODEL(https:/swissmodelexpasy org/interactive)在线软件构建了 4 个转运蛋白的三级结构，见图 5。铜抗性蛋白 A 和 CopB 的无规则卷曲结构较为突出，形态松散，且该构象比较稳定，不易被物理或化学因素破坏。因此，该结构对维持细胞结构的稳定性起重要作用35。铜稳态蛋白cutC 同源物和铜转位 P ATPase 的三级结构呈现较为明 显 的 右 手 螺 旋，尤 其 是 铜 转 位 P ATPase 中氨基酸组成简单，更易于小分子物质的通过和结合。另外，铜稳态蛋白 cutC 同源物和铜抗性蛋白 A 中所含元件数较多且分布致密，具有较强的机械强度，为细菌的正常生存和抵抗外界34422023 年 7 月张永合，等:转运蛋白在细菌吸附铜()中的作用机理研究Jul，2023图 54 个转运蛋白的三级结构示意图Fig 5Schematic illustration of the tertiary structure of four transporters表 44 个转运蛋白质的二级结构特征Table 4Secondary structural features of four transporters蛋白质登录号数分数/%螺旋 无规则卷曲 延伸链 转角Q9NTM941.7634.4316.856.96Q4KCN424.7047.1518.319.47F4ZBX431.7552.219.483.55D1CA9943.6931.5916.438.28刺激奠定了基础35。3结论本文中菌株嗜根寡养单胞菌 JC1 可耐受 160mg/L Cu2+，但对120 mg/L Cu2+有较强吸附能力，吸附率为 72.3%。JC1 菌株可通过改变形态结构及利用细胞壁表面的OH、CO、CC 等官能团以实现对 Cu2+的胞外吸附。转运蛋白在细菌吸附重金属过程中发挥重要作用。一方面，可通过存在于转运蛋白氨基酸序列中的金属离子结合位点特异性吸附金属离子;另一方面，可通过转运蛋白氨基酸中含有的 N、O、P 等元素为金属离子的氧化还原提供电子配体。此外，部分转运蛋白含有的跨膜结构可实现对金属离子的跨膜转运，进而实现微生物细胞对重金属离子的降解。本文为实现生物吸附技术挖掘了微生物资源，为揭示微生物吸附重金属机制提供了一定理论基础，但在相关基因和蛋白的能力代谢和分子水平上的研究还不够深入。后期将通过 qPC 技术研究相关蛋白的编码基因在菌株受 Cu2+胁迫后的表达水平，或通过突变体构建定向研究相关蛋白在菌株JC1 吸附 Cu2+的功能。4442Vol 23No 7安全 与 环 境 学 报第 23 卷第 7 期参考文献(eferences):1 XIAO X Y，WANG M W，ZHU H W，et al esponse ofsoil microbial activities and microbial community structureto vanadium stress J Ecotoxicology and EnvironmentalSafety，2017，142:200 206.2王子诚，陈梦霞，杨毓贤，等 铜胁迫对植物生长发育影响与植物耐铜机制的研究进展 J 植物营养与肥料学报，2021，27(10):1840 1863.WANG Z C，CHEN M X，YANG Y X，et al Effect ofcopper stress on plant growth and advances in themechanisms of plant tolerance researchJ Journal ofPlant Nutrition and Fertilizers，2021，27(10):1840 1863.3尹乃毅，罗飞，张震南，等 土壤中铜的生物可给性及其对人体的健康风险评价J 生态毒理学报，2014，9(4):670 677.YIN N Y，LUO F，ZHANG Z N，et al Bioaccessibilityof soil copper and its health risk assessmentJ AsianJournal of Ecotoxicology，2014，9(4):670 677.4 LUO S，LI X，CHEN L，et al Layer-by-layer strategy foradsorptioncapacityfatteningofendophyticbacterialbiomass for highly effective removal of heavy metals J Chemical Engineering Journal，2014，239:312 321.5 STEITT M，LESTE J NInteractions of heavymetalswithbacteria J 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