温敏性双发射峰量子点的制备与性能表征.pdf

年第卷第期 传感器与微系统（）：（）温敏性双发射峰量子点的制备与性能表征宋正勋，卞晨煜（长春理工大学电子信息工程学院，吉林长春）摘要：针对目前国内测量细胞温度的方法较少，且大多数方法会对细胞造成损伤的问题，研究介绍了一种双发射峰热敏性量子点（）的合成方法，可以应用于细胞温度的无损测量。该方法合成的量子点对于温度的敏感性较强，量子点的荧光强度与温度呈线性关系，可测温度范围为，覆盖了大多数活细胞的温度（）。并优化了测量荧光发射光谱的方法，增加了实验的准确性，与热电偶相比，相关系数提高至。本文合成的碳量子点对人永生化表皮细胞（）进行了温度检测和荧光成像。结果显示，对细胞基本无损伤且温度测量结果准确。所提方法合成的碳量子点具有良好的稳定性、生物相容性，且对细胞基本无毒性，对于开发无损测量细胞的纳米温度计有重要意义。关键词：碳量子点；水热法；人永生化表皮细胞；热敏性中图分类号：；文献标识码：文章编号：（），（，）：，（），：（）；引言众所周知，温度传感在科学技术中起到非常重要的作用。细胞温度不仅能够在一定程度上反映细胞新陈代谢的情况，而且可以洞察细胞内部自身的变化。研究表明同一种细胞在受到外界环境刺激时温度也会发生变化，尤其是药物的刺激、光热的刺激、离子浓度的刺激等。想要彻底了解一个细胞，对细胞进行温度检测是非常必要的。随着纳米技术领域的发展，基于量子点（，）、有机染料、稀有离子螯合物等发光式细胞温度计已经得到迅速的发展，并开始逐渐应用到生物方面，而碳量子点（，）相对于有机染料光学稳定性更好，。与传统的金属硫化物、金属硒化物量子点相比，碳量子点具有生物相容性高、毒性低等特点。因此，基收稿日期：基金项目：国家重点研发计划资助项目（）传 感 器 与 微 系 统第卷于荧光碳纳米颗粒制备的碳量子点具有显著的优势。本文研究以蔗糖为碳源，尿素为氮源，超纯水为溶剂，通过水热法加热合成了氮掺杂的量子点。利用紫外光激发制造的单峰碳量子点、双峰量子点对环境的影响较小，可靠性更强。当温度逐渐增加时，碳量子点的荧光强度逐渐减小。在 温度范围内，荧光强度与温度之间存在良好的线性关系。本文对合成的碳量子点进行表征、毒理性实验，以及细胞成像实验，结果表明，利用水热法合成的碳量子点溶液具有抗环境干扰能力强、实验可靠性高、对细胞的毒理性低且水溶性好等优点，有望作为纳米温度计在生物医学领域得到广泛应用。实验部分试剂与仪器试剂：人永生化表皮细胞（）（武汉，普诺赛）；培养基（）；尿素，蔗糖（天津，光复科技）；磷酸盐缓冲溶液（，）（，），二甲基亚砜（，）（，），其他试剂均为国产分析纯。仪器：鼓风干燥箱（），荧光分光光度计（购于南京菲勒），原子力显微镜（，），荧光光谱仪（，），傅里叶变换红外（，）光谱仪，酶标仪（），冷冻干燥箱（，），倒置荧光显微镜（），透射显微镜（，捷克）。荧光碳量子点的制备采用水热法：用电子天平准确称取 的蔗糖和 的尿素放置于烧杯中，加入的超纯水，用超声机超声 直至混合溶液完全透明，所得透明的含碳溶液放入高压釜中进行加热，加热时间为，加热温度设置在 之间。加热结束后，将反应釜在空气中自然冷却至室温。制备过程：取出反应釜中加热过的溶液，将溶液分装至离心管中进行离心，离心转速为 ，离心时间为，离心结束后取离心管中沉淀，用将沉淀物重悬，反复离心清洗次。用 的滤膜将重悬后的溶液进行过滤，收集过滤后的溶液，密封，放入 冷冻机中，冷冻。待冷冻完全，放入冻干机，收集量子点粉末并称重。荧光碳量子点的性能与结构表征使用透射电子显微镜（，）在 加入电压下测试碳量子点的形貌和粒径。碳量子点的红外光谱表征采用压片法（扫描范围，分辨率为）。剩余的碳量子点粉末放置在硅片上用射线衍射（，）测量其溶液元素。在荧光光谱仪中加入 比色皿并在其中加入 碳量子点溶液（），加纯水稀释至 ，混合均匀后在 紫外激发光下测量碳量子点的荧光光谱（波长范围）。继续保持实验温度恒定，其他条件均无变化情况下使用无纸记录仪记录比色皿中量子点在 中每下降 所需要的时间，该过程至少进行次并取平均值，再通过 紫外光激发并计算。荧光量子产率测定以硫酸奎宁作为标准物，用来测量碳量子点的荧光产率，处的吸光度作为横坐标，激发下的荧光强度作为纵坐标，作图求出斜率（），式中，为荧光量子产率，为斜率，为折射率。下标代表硫酸奎宁，下标代表样品。由于硫酸奎宁与样品均溶于水中，所以（）。细胞毒理性测试收集细胞，调整细胞悬液浓度，接种于孔板中，铺板调整细胞密度，放入培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的碳量子点溶液（）培养。实验设置空白对照组，每组设置个平行复孔，每孔加入 四甲基偶氮唑盐（）溶液（），继续培养，吸出培养液，加入 溶液，并低速振荡。测定各孔在 处的光密度（，）值。并通过公式计算在不同浓度下的碳量子点的细胞存活率，公式：细胞存活率（）实验组对照组。细胞成像实验使用培养皿培养细胞，并在传代过程中加入（）的碳量子点溶液，然后放入培养箱培养。离心取沉淀，重悬清洗次在荧光显微镜下观察并拍照。结果与讨论蔗糖与尿素质量比对碳量子点荧光产率的影响从表中可以看出，尿素能够有效提高荧光量子产率。随着尿素比例的增加，氮含量的增加，量子点的产率逐渐提高，因为得到的碳量子点掺杂了石墨（）。实验发现当蔗糖与尿素的摩尔质量比为m时，得到的碳量子点荧光产率最高，为 。如果继续增加尿素比例，荧光产率反而会下降，也许是随着氮含量的增加导致碳量子点结构的变化从而改变了碳量子点的荧光特性。表不同质量比下蔗糖和尿素制备的碳量子点溶液荧光产率蔗糖与尿素的质量比 m m m m m（）第期宋正勋，等：温敏性双发射峰量子点的制备与性能表征碳量子点的表征如图所示，采用测试了碳点的尺寸分布及其形貌特征。由图（）可知，水热法合成的碳量子点形貌近似球体，分散性良好，尺寸的分布比较均匀，平均的粒径约 ，由图（）可知，碳量子点具有明显的碳晶格结构，晶格间距约 。(a)?晶格间距图(b)?TEM 图片0.89?nm10?nm10?nm图碳量子点的晶格间距和 利用光谱对碳量子点进行分子结构与化学组成分析。如图所示得出在 为的伸缩振动，在为的伸缩振动，在 为伸缩振动，为的伸缩运动，为的伸缩运动，为的变形振动。由此可见，碳量子点具有多种表面基团，如烃基、羧基、氨基等等，具有很好的亲水性，可将其用于细胞成像和药物运输，。4?0003?0002?0001?00020304050607080波束/cm-1透光率/%图碳量子点的红外光谱 图中采用能谱仪（，）对优选方案下水热法合成的碳点进行元素检测，发现合成的碳点粉末含量远远高于蔗糖与尿素混合溶液的含量，其中含量约，由此可以证明水热法碳点的生成，并发现粉末中元素含量约 ，配合红外光谱可以证明元素成功掺杂到碳点中。0.00.40.81.21.6010203040ONCCNOAt%76.413.510.2keVcps/eVMap?Sum?Spectrum图 检测合成的碳点粉末元素含量 合成的碳量子点溶液在自然光下为淡黄色，在紫外灯照射下为明亮的蓝色，碳量子点溶液在酶标仪测量下光谱在 处有典型的吸收峰键跃迁。荧光光谱中，碳点在 下 处有最大的发射峰。从图中可以看出，碳量子点有着明显的光致发光，且它发射光谱的波长和强度明显地影响它的光谱。这可能是碳量子点表面本身的缺陷导致或者是纳米尺度量子点效应导致。随着激发波长从，碳量子点的荧光强度增加，当激发波长达到，荧光强度达到最大值，继续增加激发波长，荧光强度反而减少，最大发射波长也从 移至。6005505004504003500.20.61.01.41.8波长/nm荧光强度/105a.u.390?nm310?nm320?nm330?nm340?nm350?nm360?nm370?nm380?nm图不同激发光（）下的荧光发射光谱碳量子点的荧光性质图（）中，在 温度范围内，荧光强度可以观察制备的优选量子点溶液拥有很强的温度敏感性。选用优选下的量子点溶液（）加入容量为 比色皿中并用纯水稀释至 在紫外光激发下，图（）发现碳量子点的发射光谱在 和 之间拥有两处有着明显的荧光峰，这两处荧光峰强度与温度呈线性关系，线性拟合的相关系数约为，该荧光强度随着温度的增加而逐渐淬灭，伴随着温度从 逐渐增加到，碳量子点在 和 的荧光强度减少了约。荧光光谱在 和 两处的荧光强度和温度呈线性关系，原因在于碳量子点表面氢键以及大量的含氧基团共同反应导致了温度与荧光的线性响应，此外，可以通过荧光强度比值的变化来保证温度传感的稳定性。若温度上升，荧光单峰上升且 荧光单峰下降，则说明实验的失败，以此推断荧光双峰比值的涨幅也可以实现实验的稳定性。环境设置为恒定，其他均无改动情况下使用无纸记录仪记录下比色皿中量子点溶液在 中每下降 所述的时间，该过程至少进行次并取平均值，得到每个定点温度段的时间，之后将比色皿升温在温度达到 后自降温度，每到一段时间下降的时间就利用荧光光谱仪测其光谱，在已知谱中 和 的发射峰结果下，直接测量 和 与 和 之间的峰值，结果发现，大大减少了将比色皿加热后再接触荧光光谱仪过程的时间，相关系数也提高到，其原因在于光谱仪在 的扫描速率至少在 才能扫描完成需要测试全部波长范围而 比色皿温度（）的变化至少为 ，若设置 将会导致图谱整体粗糙以及实验的精确性；原因在于使用水浴恒温箱加热的量子点溶液在达到温度后再放入荧光光谱仪测量光谱这传 感 器 与 微 系 统第卷段时间也会消耗一定的热量。因此，该方法优势在于记录段与段之的光谱会大大减少其检测时间，并通过溶液温度自降的方式减少了过程中的消耗而提升了实验的准确率。50045040035034563663683703723744.34.64.95.2波长/nm荧光强度/104a.u.(a)?量子点在不同温度下荧光光谱波长/nm(b)?量子点自降温度测量的段光谱4204184164144123.53.73.94.1荧光强度/104a.u.荧光强度/104a.u.波长/nm35363738394035363937384050403020100图碳量子点的荧光性质仿真实验结果细胞毒理性分析用研究碳量子点的细胞毒性。实验结果显示，当量子点浓度小于 时，细胞的存活率大于 ，当加入细胞中碳量子点溶液浓度逐渐上升时，细胞存活率有下降的趋向但变化不大，当量子点溶液浓度大于 时，细胞存活率为 。这些结果表明：此量子点对细胞基本无毒性且生物相容性高，有望作为纳米荧光探针应用在生物医学领域。碳量子点的细胞成像分析图为碳量子点标记的细胞在荧光显微镜下分别用白光、紫外光照射成像图，并通过水温恒热箱缓慢地从加热至后的荧光强度并作对比，从图（）中可以看出，细胞培养皿中的细胞在紫外光激发下发出明亮的蓝光，证明碳量子点溶液已经成功标记在细胞中。图（）为细胞培养皿在 紫外激发下对比图，当培养皿温度逐步从缓慢加热至时，其细胞中荧光强度也在缓慢下降，且达到 时荧光接近淬灭，由此可以证明此碳量子点对于探测细胞温度的可行性，图（）中可以看出：在白光照射下，细胞将量子点内吞后并无明显损伤且发育良好，说明该量子点溶液对细胞的毒理性低。当前研究最热门的量子点主要由有毒金属元素和非金属元素的化合物组成，具有较高的毒理性且制备工艺极为复杂，。碳量子点优异的性质，可以作为纳米荧光探针来进一步推动其生物成像应用。结论采用所制备量子点的荧光特性来感应细胞温度，并用于活细胞成像，结果表明：该量子点荧光峰强度与温度呈线性关系，而且，量子点双峰比值能够很好地保证实验的稳定(a)?20?下通过紫外光激发的内吞碳量子点的细胞(b)?在 50?高温下通过紫外光激发的内吞碳量子点的细胞(c)?常温白光下通过荧光显微镜观察内吞碳量子点的细胞图不同温度碳量子点的细胞成像对比性，当蔗糖与尿素的摩尔质量比为 胞 时，荧光产率最高为 。制备的量子点具有很高的生物相容性和较低的毒理性，提高了检测细胞温度的准确率并缩短了检测流程及时间。以上结果均显示：制备的碳量子点其优异的性质可以作为高效、高灵敏度纳米荧光探针在细胞温度传感方面得到广泛应用。参考文献：何伟男，严森，顾宁细胞测温技术及其在药物研发中的应用前景药学研究，（）：，（）：荆晓东，孙莹，于冰，等肿瘤微环境响应药物递送系统的设计化学进展，（）：，（）：罗众光热化疗联合治疗肿瘤纳米载体的构建及其抗肿瘤机制的研究天津：天津理工大学，：，谢雪，吴建荣，蔡晓军，等光热 响应纳米药物用于化疗光热协同治疗肿瘤无机材料学报，（）：，（）：李呈多功能刺激响应型智能纳米探针在肿瘤诊疗中的制备及应用武汉：华中科技大学，：，刘丽娜，许晴，魏华，等光电结合检测大鼠原代神经元胞内钙离子浓度方法的建立实验动物科学，（）：，第期宋正勋，等：温敏性双发射峰量子点的制备与性能表征，（）：崔云先，杨琮，薛生俊，等 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