香港牡蛎BMP7基因克隆与表达.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023蒋美君，张启元，蒙扬辉，等.香港牡蛎BMP7基因克隆与表达J.广东海洋大学学报,2023,43(4):129-136.收稿日期：2023-03-18基金项目：广西创新驱动发展专项（桂AA17204094-3）；钦州市科学研究与技术开发计划项目（20223637）；广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室开放项目（GXKEYLA2020-01）；广西农业科技自筹经费项目（Z2022217）；广西农业科技自筹经费项目（Z202293）；国家现代农业（贝类）产业技术体系建设项目（CARS-49）第一作者：蒋美君(1997)，硕士研究生，主要从事水产遗传育种与繁殖研究工作。E-mail:通信作者：官俊良（1988），硕士，助理研究员，主要从事水产遗传育种与繁殖研究工作。E-mail:；严雪瑜(1988)，博士，助理研究员，主要从事水产遗传育种与繁殖研究工作。E-mail:香港牡蛎BMP7基因克隆与表达蒋美君1，张启元1，蒙扬辉1，白科1，张兴志2，农珍珍1，钟方杰3，朱鹏1，彭金霞2，官俊良2，严雪瑜1（1.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，北部湾大学海洋学院，广西 钦州 535011；2.广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西壮族自治区水产科学研究院，广西 南宁 530021；3.钦州市水产技术推广站，广西 钦州 535000）摘要：【目的】探究骨形态发生蛋白7（BMP7）在香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）生长发育过程中的作用。【方法】通过聚合酶链式反应（PCR）获得香港牡蛎ChBMP7基因核心编码序列（CDS），并对其进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测ChBMP7基因在香港牡蛎不同组织和不同发育阶段中的表达变化。【结果】香港牡蛎ChBMP7基因CDS序列长度为1 254 bp，共编码417个氨基酸，具有TGF-超家族结构域（316Cys417His），与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）BMP7氨基酸序列同源性（98.56%）最高。ChBMP7基因在香港牡蛎8种组织中均有表达，其中外套膜组织中ChBMP7基因相对表达量最高，其次分别为闭壳肌、唇瓣、性腺、消化腺、鳃、血窦、肠。ChBMP7基因在香港牡蛎不同生长发育时期均有表达，ChBMP7基因在卵裂期和担轮幼虫时期的相对表达量显著高于其他发育时期（P 0.05）。【结论】ChBMP7基因参与了香港牡蛎早期生长发育和外套膜相关分泌调控过程。关键词：香港牡蛎；BMP7；生长发育；基因克隆；表达分析中图分类号：S917文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0129-08doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.016Molecular Cloning and Expression Analysis of BMP7 Gene ofCrassostrea hongkongensisJIANG Mei-jun1,ZHANG Qi-yuan1,MENG Yang-hui1,BAI Ke1,ZHANG Xing-zhi2,NONG Zhen-zhen1,ZHONG Fang-jie3,Zhu Peng1,PENG Jin-xia2,GUAN Jun-liang2,YAN Xue-yu1(1.Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation,College of MarineSciences,Beibu Gulf University,Qinzhou 535011,China;2.Guangxi Academy of Fisheries Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture,Nanning 530021,China;3.Qinzhou Aquatic Product Technology Promotion Department,Qinzhou 535000,China;)Abstract:【Objective】To investigate the role of bone morphogenetic protein 7(BMP7)in the growthand development of the Crassostrea hongkongensis.【Method】The ChBMP7 coding sequence(CDS)was cloned by polymerase chain reaction in C.hongkongensis,and was analyzed by bioinformatics.第43卷广东海洋大学学报The expression of ChBMP7 in different tissues and developmental stages of C.hongkongensis wasdetected by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】The sequence of ChBMP7 CDS was1 254 bp,which encoded 417 amino acids.It included TGF-superfamily domain(316Cys-417His).ChBMP7 was highly homologous(98.56%)with that of Crassostrea gigas.ChBMP7 gene was expressedin 8 tissues,and the relative expression was higher in labial palps,followed by the closed shell muscle,labellum,gonad,digestive gland,gill,blood sinus and intestine,respectively.ChBMP7 gene wasexpressed in all developmental stages,and the relative expression in cleavage and trochophore larvaestages was significantly higher than that in other stages(P 0.05).【Conclusion】ChBMP7 gene isinvolved in the regulation of the early growth and mantle related secretion of C.hongkongensis.Key words:Crassostrea hongkongensis;BMP7;growth and development;gene cloning;gene expressionBMPs是 TGF-超家族中最大的蛋白家族，是一类多功能细胞因子，主要成员包括 BMP2 BMP18以及BMP2B、BMP8B等蛋白。大量研究发现BMP7与动物胚胎发育、贝壳形成等有着紧密联系：BMP7在合浦珠母贝（Pinctada martensi）的珍珠层和柱状层形成过程中起着关键作用1，还可能参与了泥蚶（Tegillarca granosa）的贝壳形成过程以及文蛤（Meretrix meretrix）幼虫形态发生和贝壳形成，具有组织分化、调控胚胎生长发育等生理功能2，3；MmBMP7基因在文蛤未受精卵、囊胚、原肠胚期、担轮幼虫期和稚贝期都高度表达3；hdh-BMP7基因在皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）4,5不同生长发育阶段均有表达。2022年我国牡蛎产量达到581.91万t，具有重要经济价值6。香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）是我国华南沿海地区的重要养殖贝类之一，近年来出现抗病抗逆性差、个体小型化、单位产量降低等不良现象，急需培育生长更优良的品种。鉴于BMPs 基因家族在软体动物生长发育过程中的重要作用，探究BMP7基因的生长发育调控机制是非常必要的。目前根据 NCBI 数据库中已公布物种的氨基酸序列，发现BMP7物种的研究主要集中于哺乳动物类7-9、硬骨鱼类10-12，尚未发现香港牡蛎BMP7基因的相关研究；且关于牡蛎幼虫期到 2龄成体期内生长情况的研究较少。因此，本研究利用 PCR 扩增技术获取香港牡蛎 BMP7 基因（ChBMP7 基因）蛋白质编码区（CDS 序列），并采用生物软件和在线预测工具对 ChBMP7基因的结构和物理性质进行生物信息学分析，利用实时荧光定量（qRT-PCR）技术分析 ChBMP7 基因在香港牡蛎不同组织和不同生长发育时期表达情况，进一步探讨 ChBMP7基因在香港牡蛎生长发育过程中调控机制，为完善ChBMP7基因对牡蛎的作用机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料通过解剖香港牡蛎雌雄亲贝体质量为（117.65 16.96）g，壳高为（80.13 8.82）mm获取精卵进行人工授精，在500 L养殖槽中孵化，并继续对香港牡蛎幼苗进行育种养殖。于显微镜观察辨别牡蛎幼体的形态特征，从而获取不同发育时期（卵裂期幼虫、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、眼点幼虫期）香港牡蛎样品，孵化水体盐度为（20 0.5），水温为（28 1）。采集不同时期的牡蛎幼虫样品，每个样品取3个重复；样品采集后立即放到液氮中速冻，采集结束转入-80 冰箱保存备用。采集4月龄、8月龄、12月龄和24月龄（成体）等不同生长时期香港牡蛎的外套膜和闭壳肌组织样品，同时，采集成体香港牡蛎的外套膜、闭壳肌、鳃、唇瓣、血窦、性腺、消化腺、肠等组织样品，每个样品取3个重复。采集完成后立即置于液氮中速冻，采集完成后转入-80 冰箱保存备用。1.2 方法1.2.1总RNA提取及cDNA合成用Tirzol法提取以上样品的总 RNA，利用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计来检测 RNA 的完整性和纯度，将质量较高的 RNA 使用反转录试剂盒 TransScript One-StepgDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒（Trans，北京全式金生物技术有限公司）反转录合成 cDNA；反转录后将 cDNA 稀释 10 倍保存于-20。130第4期蒋美君等：香港牡蛎BMP7基因克隆与表达1.2.2引物设计及基因克隆根据美国国家生物技术信息中心数据库的注释信息，结合已报道太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的 BMP7 基因的 CDS 区域设计引物 ChBMP7-F1 及 ChBMP7-R1、ChBMP7-F2及ChBMP7-R2（表1），用于基因克隆。并根据测序获得的 ChBMP7基因序列设计实时荧光定量 PCR引物qChBMP7-F和qChBMP7-R。使用Oligo7.0软件设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体系：cDNA 模板 2 L；上游引物（10 mol/L）2 L，下游引物（10 mol/L）2 L；2 Es Taq MasterMix（Dye）25 L；ddH2O 19 L。其中2 Es Taq MasterMix购自中国康为世纪生物科技股份有限公司。反应程序：94，2 min；94，30 s，退火55,30 s，72，30 s，34次循环；72，10 min；12 保存。反应结束的 PCR 产物经琼脂糖凝胶检测后，对符合预期大小的 PCR 片段使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（Trans，北京全式金生物技术有限公司）试剂盒进行回收纯化，纯化产物置于-20 保存。将纯化后的 PCR产物与pEASY-T1 cloing质粒载体（Trans，北京全式金生物技术有限公司）连接，并转化到Trans-T1感受态细胞中。通过蓝白斑筛选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.3ChBMP7 基因生物信息学分析利用 SnapGene 4.3.6软件对测序结果进行拼接，获得ChBMP7基因 CDS 序列。利用 NCBI ORF Finder 在线工具（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因的开放阅读框和预测编码蛋白序列。采用ExPASy-ProtParam tool（https:/web.expasy.org/protparam）预测编码蛋白理化特性；使用SignalP 6.0 Server（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）预测蛋白信号肽序列；采用NetNGIys 1.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）预测蛋白 糖 基 化 位 点；用 NetPhos3.1（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）预测蛋白的磷酸化位点；用 Scratch（http:/scratch.proteomics.ics.uci.edu/explanation.html）预测蛋白的二硫键；用SMART（http:/smart.embl-heidelberg.de）预测蛋白结构域；分别采用SOPMA（https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https:/swissmodel.expasy.org/interactive）在线工具预测蛋白二级结构和三级结构；在NCBI数据库中搜索不同物种的氨基酸序列，利用DNAMAN8.0软件分析序列同源性，并用MEGA7.0软件的邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树。1.2.4 ChBMP7基因在不同生长时期和不同组织中的表达分析使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix（Trans，北京全式金生物技术有限公司）检测ChBMP7基因在卵裂期、担轮幼虫期、D形幼虫期、壳顶幼虫期、眼点幼虫期和成贝期（4月龄、8月龄和12月龄、24月龄）等不同时期，以及在唇瓣、鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、血窦、性腺等组织中的表达情况。荧光定量 PCR 反应体系：2 TransStart TipGreen qPCR SuperMix 10 L；上游引物（10 mol/L）0.5 L；下游引物（10 mol/L）0.5 L；无核酸酶水7 L；模板 2 L。反应程序为：94，30 s；94，5 s，60，30 s，72，20 s，40 个循环；94，10 s，65，60 s，94，1 s。1.3 数据处理以 EF1 为内参基因，使用 EXCEL 软件采用表1实验所涉及的特异引物Table 1Primer sequences used in the experiments引物 PrimersChBMP7-F1ChBMP7-R1ChBMP7-F2ChBMP7-R2qChBMP7-FqChBMP7-REF1A-FEF1A-R序列(5-3)Sequence form 5 to 3TAGAATAGGCATTTCGGAGGCAGTATCTTGTCTTCAGGGTTACCCCCAGAGAACACAGACGCATCAAAAGACAGGTGGACCCAAAGACCGAAGCCGAAATCAAGCGCCGTCATCCTTCACAACACCATTGCCCAGGTCATCATCTTGAAGCAGGCAATGTGAGCAGTG退火温度Annealing temperature/C5555555561616161用途Purpose基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆qPCRqPCR内参13内参13131第43卷广东海洋大学学报2Ct法计算 ChBMP7 基因的相对表达量；并使用GraphPad Prism 9.0 软件绘制柱状图。使用 SPSS26.0软件对不同生长发育时期、不同组织的实验数据进行单因素方差分析与多重比较，显著性水平=0.05。2 结果与分析2.1 ChBMP7基因CDS的克隆及序列分析ChBMP7基因 CDS序列长度为 1 254 bp，编码417个氨基酸（图 1）；预测的编码蛋白的理论分子质量为 47.64 ku，蛋白等电点（PI）为 9.16，呈碱性；ChBMP7蛋白中共有6个糖基化位点、21个磷酸化位点、3对二硫键（图1）。预测的氨基酸中赖氨酸含量最高（8.48%），其次是亮氨酸（8.09%），半胱氨酸最少（1.54%）。信号肽预测结果如图2所示，香港牡蛎ChBMP7蛋白N端存在信号肽，信号肽位置在第1至23个氨基酸。ChBMP7蛋白存在TGF-超家族结构域（图3），位于316Cys417His，并发现该结构域中含有6个半胱氨酸残基（图1）。2.2 ChBMP7二级结构与三级结构预测通过二级结构预测，发现ChBMP7蛋白中无规则卷曲比例最高，占56.59%，-螺旋、延伸链、-转角占比分别为21.10%、19.90%、2.40%（图4）。SWISS-MODEL预测结果显示，ChBMP7蛋白质三级结构预 测 与 太 平 洋 牡 蛎 三 级 结 构 预 测 的 结 果 相似（图5）。2.3 ChBMP7氨基酸序列同源性及系统进化树分析多序列同源性比对结果显示，ChBMP7与太平洋牡蛎同源性最高，达到98.56%，与太平洋珠母贝（Pinctada imbricata）、泥蚶（T.granosa）、厚壳贻贝（Mytilus coruscus）、紫贻贝（Mytilus edulis）、文蛤（M.meretrix）、缢蛏（Sinonovacula constricta）、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）等贝类也具有较高的同源性，分 别 为 61.33%、57.51%、55.79%、54.46%、47.78%、45.22%、45.22%（图 6）。通过 NJ法构建的进化树分析发现，香港牡蛎与太平洋牡蛎的亲缘性最接近，其次依次为其他软体动物类、硬骨鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类（图7）。图1ChBMP7基因CDS序列及其编码的氨基酸序列Fig.1Coding sequence and deduced amino acid sequences of ChBMP7 gene加粗ATG为起始密码子，加粗TGA为终止密码子，*为蛋白翻译终止，加粗下划线为糖基化位点，常规下划线为磷酸化位点。Bold ATG is the start codon,bold TGA is the stop codon.*is the termination of protein translation.Gray shaded regions indicate signal peptide regions.Regular underlined phosphorylation sites.qChBMP7-R GCCGTCATCCTTCACAACACCATT 61 qPCR EF1A-F GCCCAGGTCATCATCTTGAA 61 内参基因12,13 EF1A-R GCAGGCAATGTGAGCAGTG 61 内参基因12,13 1.2.3 ChBMP7 基因生物信息学分析基因生物信息学分析 利用 SnapGene 4.3.6 软件对测序结果进行拼接，获得 ChBMP7 基因 CDS 序列。利用 NCBI ORF Finder 在线工具（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因的开放阅读框和预测编码蛋白序列。采用 ExPASy-ProtParam tool（https:/web.expasy.org/protparam）预测编码蛋白理化特性；使用 SignalP 6.0 Server（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）预测蛋白信号肽序列；采用 NetNGIys 1.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）预测蛋白糖基化位点；用 NetPhos3.1（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）预测蛋白的磷酸化位点；用 Scratch（http:/scratch.proteomics.ics.uci.edu/explanation.html）预 测 蛋 白 的 二 硫 键；用 SMART（http:/smart.embl-heidelberg.de）预测蛋白结构域；分别采用 SOPMA（https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（https:/swissmodel.expasy.org/interactive）在线工具预测蛋白二级结构和三级结构；在 NCBI 数据库中搜索不同物种的氨基酸序列，利用DNAMAN8.0 软件分析序列同源性，并用 MEGA7.0 软件的邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树。1.2.4 ChBMP7 基因在不同生长时期和不同组织中的表达分析基因在不同生长时期和不同组织中的表达分析 使用 TransStart Tip Green qPCR Super Mix（Trans，北京全式金生物技术有限公司）检测 ChBMP7 基因在卵裂期、担轮幼虫期、D 形幼虫期、壳顶幼虫期、眼点幼虫期、稚贝期和成贝期（4 月龄、8 月龄和 12 月龄、24 月龄）等不同生长、发育时 1 ATGATGGCGGATTTATTTCTTTGTCTTTTTACAACGATGCTTTTATTGAGGACGAGCGTGGCATCGTCTGCTTATTATGTGGACAATGGAATCGGACAGACG 1 M A D L F L C L F T T M L L L R T S V A S S A Y Y V D N G I G Q T 100 GAAAAAATGCATGAAATGAACTCGAGGGACAAACGTGAACTTCAACATGAGATTCTTACATTACTTGGTCTTCACCAAAGACCGAAGCCGAAATCAAGC 34 E K M H E M N S R D K R E L Q H E I L T L L G L H Q R P K P K S S 199 ACTACCAAGGACTCGGCTCCAACGTTCATGCTGAGTTTGTACAATTCTATTACTTCAGATAATGGTGTTGTGAAGGATGACGGCACATTTCACACCAGC 67 T T K D S A P T F M L S L Y N S I T S D N G V V K D D G T F H T S 298 CATAATGTTACAGTAGGAGATAGCGTGGTGCAACCCATTGAGGGAACAGACATCATCATCAGTTTTGTTAATAAGGCTAAAAAAGTTCCACATCTAAGA 100 H N V T V G D S V V Q P I E G T D I I I S F V N K A K K V P H L R 397 CATGAGAAGGACAGGACGTTTTTCTTTGACTTTAGTGATGTCACCGCTAAGGAAACTGTGGTTGGAGCAGAGTTGCGGTTATACAAGGAAAAATCCGAG 133 H E K D R T F F F D F S D V T A K E T V V G A E L R L Y K E K S E 496 AAATGGAAGAAGAACCATGAATTCCAAATCCAGGTCTATATGCTTAGACAGGGAAAAGACCCTGAAGACAAGATACTGGATCCCTTATCCAATATCACT 166 K W K K N H E F Q I Q V Y M L R Q G K D P E D K I L D P L S N I T 595 GTTTATGCTAATACAGAGGGGTGGATCACATTTAACATGACACGGGCGGCCGAGCTATGGACCAGACAACCAGAGGCCAATCTGGGGCTTTTCATCAAA 199 V Y A N T E G W I T F N M T R A A E L W T R Q P E A N L G L F I K 694 GTCTTGTTTGTCAGCAAAGGCAGAGAGATTAACCCCAACAAACTTGGGATCGTGAGTTACAGAGGGTCAGAAGACAAGAAGCCCTTCATGGTGGGATTT 232 V L F V S K G R E I N P N K L G I V S Y R G S E D K K P F M V G F 793 TTCTCCTCCCAAGAACTGGTGTACCCCCAGAGAACACAGACAGCCCTGAGGCGGAGGCGAGAGCTCTACTCCTACAAGGAGGAGCAGGAGAAATACACC 265 F S S Q E L V Y P Q R T Q T A L R R R R E L Y S Y K E E Q E K Y T 892 GACTACAACCTCTCACGTCACAAGCGAGGGGCATCGGGCGGAGGAAGATGGCCATGTCAACGACGATCCTTATACGTCAAATTTCGAGACCTTGGTTGG 298 D Y N L S R H K R G A S G G G R W P C Q R R S L Y V K F R D L G W 991 CAGAGTTGGATCATTGCCCCTGATGGATACCATGCCTTCTTCTGTGAAGGAGAATGCTCCTTTCCCATTGGAAACCATGTCAATGCTACCAACCATGCC 331 Q S W I I A P D G Y H A F F C E G E C S F P I G N H V N A T N H A 1090 ATAGTCCAGACACTGGTCCATATGTACACCCCTTTCAAGGCCCCCAGCCCTGGCTGTGCCCCATCCAAACTAAGTGCCCAGTCTGTACTATATTTCGAT 364 I V Q T L V H M Y T P F K A P S P G C A P S K L S A Q S V L Y F D 1189 GATGATGGAAATGTTGTGCTGAAGAAATTCCCAAAGATGATCGTTACCTCTTGTGGATGCCACTGATGA 397 D D G N V V L K K F P K M I V T S C G C H *加粗 ATG 为起始密码子，加粗 TGA 为终止密码子，*为蛋白翻译终止，加粗下划线为糖基化位点，常规下划线为磷酸化位点。Bold ATG is the start codon,bold TGA is the stop codon.*is the termination of protein translation.Gray shaded regions indicate signal peptide regions.Regular underlined phosphorylation sites.图 1 ChBMP7 基因 CDS 序列及其编码的氨基酸序列 Fig.1 Coding sequence and deduced amino acid sequences of ChBMP7 gene 132第4期蒋美君等：香港牡蛎BMP7基因克隆与表达 蛋白质序列 Protein sequence 红色线条是信号肽的 n 端区域，橙色线条是信号肽的中心疏水区，黄色线条是信号肽的 c 端区域。Red line is the n-terminal region of the signal peptide.Orange line is the center hydrophobic region of the signal peptide.Yellow line is the c-terminal region of the signal peptide.图 2 ChBMP7 信号肽预测 Fig.2 Signal peptide prediction of ChBMP7 位置 Position 图 3 ChBMP7 结构域预测 Fig.3 Domain prediction of ChBMP7 2.2 ChBMP7 二级结构与三级结构预测二级结构与三级结构预测 通过二级结构预测，发现 ChBMP7 蛋白中无规则卷曲比例最高，占 56.59%，-螺旋、延伸链、-转角占比分别为 21.10%、19.90%、2.40%（图 4）。SWISS-MODEL 预测结果显示，ChBMP7 蛋白质三级结构预测与太平洋牡蛎三级结构预测的结果相似（图 5）。位置 Position 蓝色是-螺旋，红色是延伸链，绿色是-转角，紫色是无规则卷曲。Blue is-helices.Red is extension chains.Green is-turns.Purple is random coils.图 4 ChBMP7 二级结构预测 Fig.4 Secondary structure prediction of ChBMP7 1002003004000位置 Position图3ChBMP7结构域预测Fig.3 Domain prediction of ChBMP72.4ChBMP7基因在香港牡蛎不同发育、生长时期的相对表达ChBMP7基因在香港牡蛎不同幼虫发育时期相对表达量结果如图8所示，ChBMP7在香港牡蛎的卵裂期、担轮幼虫期和D形幼虫期、壳顶幼虫期、眼点幼虫期五个幼虫发育时期均有表达，其中卵裂期、担轮幼虫期表达量显著高于其他幼虫时期表达量（P 0.05），依次是D形幼虫期、壳顶幼虫期、眼点幼虫期。ChBMP7基因在香港牡蛎不同生长时期闭壳肌中相对表达量如图9（A）所示，ChBMP7基因在8M时期表达量最高，随着生长发育，相对表达量呈现下降趋势（P 0.05）；在外套膜中表达量如图9（B）所示，ChBMP7基因4月龄、24月龄时期表达量显著高于8月龄、12月龄时期（P 0.05）。2.5 ChBMP7基因在成体香港牡蛎不同组织的表达ChBMP7基因在成体期 24月龄香港牡蛎不同组织的相对表达量结果如图10所示，ChBMP7基因在香港牡蛎的各个组织内均有表达，其中外套膜、闭壳肌组织中的表达量较高，在唇瓣、性腺、消化腺、鳃、血窦、肠等组织中的表达量依次下降，其中肠 组 织 中 的 表 达 量 显 著 低 于 外 套 膜、闭 壳 肌（P 0.05）。CS:cleavage stage;Tr:trochophore;DL:D-shaped larvae;UL:umbolarva;EL:eyespot larva;Values with a same letter indicate no significantdifferences between them(P 0.05).图 7 基于邻接法不同物种 BMP7 系统进化树 Fig.7 Phylogenetic tree of BMP7 based on Neighbor-Joining method 2.4 ChBMP7 基因在香港牡蛎不同发育、生长时期的相对表达基因在香港牡蛎不同发育、生长时期的相对表达 ChBMP7 基因在香港牡蛎不同幼虫发育时期相对表达量结果如图 8 所示，ChBMP7 在香港牡蛎的卵裂期、担轮幼虫期和 D 形幼虫期、壳顶幼虫期、眼点幼虫期五个幼虫发育时期均有表达，其中卵裂期、担轮幼虫期表达量显著高于其他幼虫时期表达量（P0.05）。CS:cleavage stage;Tr:trochophore;DL:D-shaped larvae;UL:umbo larva;EL:eyespot larva;Values with a same letter indicate no significant differences between them(P0.05).图 8 ChBMP7 基因在不同发育时期的表达 Fig.8 Expression analysis of ChBMP7 in different development stages ChBMP7 基因在香港牡蛎不同生长时期闭壳肌中相对表达量如图 9（A）所示，ChBMP7 基因在 8M时期表达量最高，随着生长发育，相对表达量呈现下降趋势（P0.05）；在外套膜中表达量如图 9（B）所示，ChBMP7 基因 4 月龄、24 月龄时期表达量显著高于 8 月龄、12 月龄时期（P 0.05）。Values with a same letter indicate no significant differences betweenthem(P 0.05).图10香港牡蛎ChBMP7在组织中的表达Fig.10Expression analysis of ChBMP7 in tissuesIn：肠；Si：血窦；Gi：鳃；DG，消化腺；Go：性腺；LP：唇瓣；AM：闭壳肌；Ma：外套膜；凡含一个相同字母表示差异不显著（P 0.05）。In:intestine;Si:sinusoids;Gi:gill;DG:digestive gland;Go:gonad;LP;labial palps;Values with a same letter indicate no significantdifferences between them(P 0.05).凡含一个相同字母表示差异不显著（P0.05）。Values with a same letter indicate no significant differences between them(P0.05).图 9 ChBMP7 基因在不同生长时期的表达 Fig.9 Expression analysis of ChBMP7 in different growth stages 2.5 ChBMP7 基因在成体香港牡蛎不同组织的表达基因在成体香港牡蛎不同组织的表达 ChBMP7 基因在成体期 24 月龄香港牡蛎不同组织的相对表达量结果如图 10 所示，ChBMP7 基因在香港牡蛎的各个组织内均有表达，其中外套膜、闭壳肌组织中的表达量较高，在唇瓣、性腺、消化腺、鳃、血窦、肠等组织中的表达量依次下降，其中肠组织中的表达量显著低于外套膜、闭壳肌（P0.05）。In:intestine;Si:sinusoids;Gi:gill;DG:digestive gland;Go:gonad;LP;labial palps;Values with a same letter indicate no significant differences between them(P0.05).图 10 香港牡蛎 ChBMP7 在不同组织中的表达