香蕉果实酵母双杂交文库的构...MaMADS2互作蛋白筛选_王川.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（，）；广州市科技计划项目科学研究重点项目（）；广东省农产品保鲜物流共性关键技术研发创新团队项目（）作者简介：王川，硕士研究生。通信作者：毕方铖，研究员，博士，主要从事水果采后生物学基础与保鲜研究，：。王川，盛鸥，窦同心，等 香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选 南京农业大学学报，（）：，（）：香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选王川，盛鸥，窦同心，李斌，胡春华，杨乔松，邓贵明，董涛，李春雨，易干军，毕方铖（广东省农业科学院果树研究所 农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室 广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东 广州；华中农业大学园艺林学院，湖北 武汉）摘要：目目的的 本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子 的互作蛋白，深入解析 影响香蕉果实后熟过程的分子机制。方方法法 以 为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与 的互作；最后用蛋白免疫印迹分析 蛋白在香蕉后熟过程中的表达。结结果果 成功构建了果实在乙烯利催熟下的 文库，初级和次级文库的库容分别为 和 ，平均插入片段大小在 以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出 个互作蛋白，其中有 个 转录因子，个 泛素连接酶，个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制 个 基因的表达，而 甲基环丙烯（）对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，与 转录因子 存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和 泛素连接酶互作是一致的。结结论论 通过构建高质量的果实 文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与 互作的蛋白，并明确了 与另一 转录因子 之间存在明显的互作关系。关键词：香蕉；酵母双杂交文库；互作蛋白；果实成熟中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，）：，“”，（），南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 ，：；家族的转录因子普遍存于植物等真核生物中，其包含一个非常保守的 结构域，是调控植物生长发育过程包括果实发育和后熟的重要因子。在番茄 转录因子中，（）、（）、（）及 （）的突变都严重影响果实的成熟特性，且它们通过互作来共同调控果实成熟过程。而且，越橘（）中的 同源基因，苹果中的（）同源基因及非呼吸跃变果实草莓中的 同源基因也被证明可能参与了果实的成熟过程。在香蕉 基因组中存在近百个推定的 基因，预示着其可能参与多种生物学过程的调控。早些年在香蕉（，）中鉴定的（）基因在果实中高表达且受乙烯诱导，且其能与泛素化激活酶（）和（）相互作用来共同调控香蕉的后熟过程。此外，研究表明（）是一个影响果实成熟的正调控因子。等从香蕉（，）中鉴定出 个 同源基因，分别命名为，其中多个基因的表达能被乙烯所诱导，且能被乙烯抑制剂 甲基环丙烯（）所抑制。此外，等发现类 的 转录因子在香蕉跃变期的果皮中高度表达，且其能与大部分成熟相关基因启动子中的 序列相结合，说明这些 基因可能参与了成熟过程。最近的研究从遗传上证明了（基因组，）和（基因组，）的突变可以显著延缓香蕉的后熟过程，且对果实其他性状无明显影响，而且发现 能通过影响其他激素信号途径来调控香蕉的后熟过程。最新的研究显示，香蕉 转录因子被认为是香蕉的后熟过程核心调控因子。这说明多个 转录因子共同参与香蕉果实后熟过程的调控。前期的报道显示，在香蕉果肉和果皮中 的表达不受乙烯诱导，而其表达下调能延缓香蕉后熟过程，说明其可能在乙烯信号途径上游起重要调控作用，但与其互作的蛋白及其具体的作用机制还不明确。本研究通过构建高质量的香蕉果实酵母双杂交文库，进一步利用此文库筛选鉴定出多个与 互作的蛋白，并对互作蛋白的功能进行初步预测与分析，为进一步深入解析 调控香蕉后熟过程的分子机制奠定基础。材料与方法 试材及取样供试材料选用开花后 （成熟）的巴西蕉（，）果实。采回的新鲜香蕉经清洗后用（体积分数）乙烯利水剂稀释 倍后进行催熟处理，分别在处理前、处理后 和处理后 取样，经液氮速冻后保存于 备用。香蕉果实 提取及酵母双杂交文库（文库）的构建前期研究发现，香蕉在催熟后 已转色，且大部分受诱导基因已呈现较高表达水平，因此选取香蕉催熟处理前、处理后 和处理后 的混合样品为材料，在液氮中研磨成粉后用 法提取果实 进行建库。具体如下：）提取缓冲液，（），用前加入 巯基乙醇至终浓度为（体积分数），且在 预热；）每 果 第 期王川，等：香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选肉加入 聚乙烯吡咯烷酮（）在液氮中磨成粉末，取部分粉末加入 提取液，涡旋混匀，在 水浴 ，每隔 混匀 次；）冰上冷却至室温，加入等体积氯仿抽提，于 、离心，取上清液，加入 至终浓度为 （倍体积），放置过夜；）于 、离心 沉淀，用 焦碳酸二乙酯（）水溶解沉淀，用等体积的水饱和酚或酸酚，氯仿顺序抽提 次，取上清液，加 体积 和 倍体积无水乙醇放在 冰箱中沉淀 以上，于 、离心 沉淀；）沉淀物用预冷的 乙醇洗涤 次，真空干燥后溶于 处理水中备用。提取获得的总 用 分离，所得 经反转录合成双链 后再连接接头，进一步利用 进行 反应并连接 载体，所得初级文库质粒利用 进行 反应并连接 载体得到酵母双杂交文库质粒。诱饵蛋白表达载体的构建、诱饵蛋白毒性及自激活检测利用基因特 异 引 物（和）将（）的 编 码 区 序 列 克 隆 至，构 建 诱 饵 蛋 白 表 达 载 体，并 命 名 为。对比 （）和 （）在 平板上的生长情况来确定诱饵蛋白是否对酵母的生长有毒性。按组合、转化 酵母，通过观察酵母在二缺（）和四缺（）培养基平板上的生长情况来确定是否存在自激活情况。酵母文库的筛选参考 （公司）使用手册说明，以携带诱饵质粒的 菌株和文库质粒为材料，采用质粒共转的方法进行香蕉果实酵母文库的筛选。挑取诱饵菌株单克隆接种至 液体培养基，于 、培养至（）；离心收集菌体，用 预热的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂腺嘌呤硫酸盐（）液体培养基重悬并转移至 锥形瓶中，、继续培养 至细胞密度达到；离心收集菌体，用无菌蒸馏水清洗 次，加入 溶液重悬菌体，涡旋重悬菌体，静置 ，离心，弃上清液；依次加入预冷的 聚乙二醇（）、文库质粒、无菌水，涡旋混匀；孵育，每 颠倒混匀 次，加入 二甲基亚砜（），用移液器吸打混匀，水浴，每 颠倒混匀 次；离心收集菌体，弃上清液，用 重悬，于、振荡培养 ，离心 收集菌体，用 溶液重悬细胞；转化液分别稀释、倍后各取 涂布于 的 、的培养基上，其中 、分别用于验证诱饵菌株和文库质粒情况，根据 平板上的单克隆数计算转化效率；将剩余重悬液按每个培养皿 均匀涂布到 的 培养皿上；倒置培养 ，挑取单克隆转移至 培养基上生长，观察颜色变化。回转验证用酵母质粒小量抽提试剂盒（）分别提取阳性克隆所含的文库质粒，转化大肠杆菌感受态扩繁。将提取的质粒分别与 载体共转化 ，再将转化后的酵母铺于 培养基上，待克隆长出后，分别接种至 和 培养基进行回转验证。同步进行阳性对照（）和阴性对照（）质粒的转化试验。利用 载体特异性引物对阳性克隆进行菌液 鉴定，送上海生工生物工程有限公司测序。根据测序结果，进一步将鉴定的候选蛋白克隆至 载体，分别与 质粒共转 酵母菌株，并将转化后的酵母涂布于 培养基上，待克隆长出后，分别接种至 和 培养基进行进一步验证。候选互作蛋白基因的表达分析对不同生长发育阶段（断蕾、）和后熟不同阶段（乙烯利处理和处理）的香蕉果实进行转录组测序分析，以此为基础提取互作蛋白基因的转录组数据，利用 软件以各阶段基因表达的 值（取 为底的对数）绘制表达热图。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 双分子荧光互补试验（）载体构建利用 和 酶切克隆载体（和）后胶回收备用，然后用 引 物（和）将 基因（）的编码区克隆至 载体，用引物（和）将 基因的编码区克隆至 载体，分别提取质粒进行水稻原生质体转化。水稻原生质体分离及瞬时转化取在 暗培养 的水稻幼苗茎叶，除去最外层叶鞘，用刀片切成小段（），加入 酶解液（甘露醇、巯基乙醇），、振荡酶解 ；用 滤网过滤原生质体，离心 收集原生质体，弃上清液，用预冷的 溶液 （吗啉）乙磺酸、，洗涤 次，最后用 溶液（含 、甘露醇、）重悬，并调整原生质体浓度为（）；向 无菌离心管中加入（）质粒、原生质体、（含 、甘露醇、），轻柔混合均匀，室温静置 ；加入 缓冲液，混合均匀终止反应，离心 收集原生质体，弃上清液，加入 溶液洗涤 次，最后加入 溶液，转移到 离心管中，暗培养 ，离心 收集原生体，留 原生质体用于激光共聚焦显微镜（）观察。分析取约 样品在液氮中研磨，加 裂解液（含 苯甲基磺酰氟，碧云天生物技术有限公司），冰浴 ，每 混匀 次，于 、离心 ，取上清液测定蛋白浓度后用于蛋白表达检测。配制 浓缩胶和 分离胶，浓缩胶电泳电压为 ，分离胶电泳电压为 。用 孔径的 膜转膜，转膜条件为：湿转，恒流 ，。用含 脱脂奶粉的 室温封闭 ，的多克隆抗体按 倍稀释后于 过夜孵育，二抗 倍稀释后于室温孵育 ，然后用 洗涤 次，每次 ，最后用 显色试剂盒（）进行显影。内参抗体 购自上海艾比玛特医药科技有限公司。多克隆抗体由南京金斯瑞生物科技股份有限公司制备，以合成的 特异多肽为免疫原，每 周免疫 次，共免疫 次制备的兔血清，效价在 以上。结果与分析 酵母双杂交文库构建采取 方法提取总，检测结果显示，和 核糖体 条带清晰可见，没有拖带（图），且 为，表明 质量高，符合建库要求。用 分离，电泳检测呈均匀的弥散带，大小为 （图），符合进一步反转录进行建库的要求。经反转录合成 后依次进行初级文库和次级文库的构建，经计算初级文库和次级文库的库容分别为 和 （图、），符合酵母双杂交筛选要求（以上）。随机挑选 个克隆对文库插入片段大小检测，结果表明初级文库和次级文库的平均插入片段大小均在 以上（图、），说明所得的 文库质量完全能满足进一步的酵母双杂交筛库需要。诱饵菌株毒性及自激活检测采用特异引物通过 将 基因的编码区克隆至 载体，经测序确认 蛋白能与载体中 的 结构域融合表达。为了检测 蛋白的表达对酵母是否存在毒性，以空载质粒 为对照，将诱饵质粒转化 酵母菌株，然后涂布于色氨酸缺失的 平板上，结果（图）显示，转化诱饵质粒和空载质粒的酵母生长几乎一致，说明 蛋白的表达对酵母细胞不会产生毒害作用。为了进一步检测诱饵菌株是否存在自激活现象，用不同的质粒组合转化 酵母菌株，结果（图）显示，阳性对照 在双缺和四缺平板上都能正常生长；阴 第 期王川，等：香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选性对照 组合与试验组合 在双缺平板上能正常生长，在四缺平板上不能正常生长，说明诱饵菌株无自激活现象。图 香蕉果实酵母双杂交文库的构建.总；的分离；初级文库的库容鉴定（数字 表示平板上的菌落数，表示 倍稀释）；次级文库的库容鉴定（数字 表示平板上的菌落数，表示 倍稀释）；初级文库插入片段长度的鉴定；次级文库插入片段长度的鉴定。分子量标准。；（，）；（，）；图 诱饵载体自激活和表达蛋白毒性检测.诱铒蛋白毒性检测；诱饵蛋白自激活检测（和 组合作为阳性对照，和 组合作为阴性对照）。；（，）南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 互作蛋白的筛选及鉴定用诱饵菌株和文库质粒采用共转化的方法进行文库筛选，保证每次转化效率在 以上，经多次筛选共得到 个能在四缺平板上生长的克隆。用 （，）进行 确定插入片段的大小，排除片段大小相同的克隆后最终得到 个大小不同的候选阳性克隆（表）。提取各克隆的文库质粒，转入大肠杆菌进行扩繁，将提取的各文库质粒与 点对点共转化 酵母菌株，然后分别在双缺（）和四缺（）培养基上生长，结果（图）显示，阳性对照在双缺和四缺平板上均能生长，阴性对照只能在双缺平板上生长，说明转化过程可靠。个阳性克隆质粒与 共转的组合均能在双缺和四缺平板上正常生长，确定为阳性克隆。通过测序与在香蕉基因组数据库进行 分析，确定候选互作蛋白基因的信息如表 所示。其中，多个是与蛋白泛素化降解途径相关的基因，如 泛素连接酶、泛素结合酶、蛋白酶调控亚基等，此外还鉴定出 个转录因子基因。表 互作蛋白的功能注释 编号蛋白编号 功能注释 编号蛋白编号 功能注释 丝氨酸 苏氨酸蛋白磷酸酶 催化亚基 可能的 泛素连接酶 转录因子 泛素结合酶 泛素连接酶 类 泛素连接酶 组蛋白脱乙酰酶 泛素连接酶 转录因子 蛋白酶调节亚基 同源物 转录因子 类丝裂原激活蛋白激酶 可溶淀粉合成酶 类 泛素连接酶 自噬相关蛋白 类转录因子 结合蛋白 转录共抑制子 图 互作蛋白点对点互作验证.：阳性对照 ；：阴性对照 互作蛋白 编码区克隆及点对点互作验证由于文库质粒中整合的序列多为基因的片段，少有完整的基因编码区序列，且插入序列可能因移码而导致表达的蛋白与通过基因片段测序鉴定的结果不一致。为了进一步确定候选蛋白与 的真实 第 期王川，等：香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选图 互作蛋白 全长点对点互作验证.互作情况，分别将 个候选蛋白 编码区的序列克隆至 载体，然后与 进行点对点的互作分析，结果（图）发现，只有 个蛋白与 有明显的互情况，分别为、号，在双缺和四缺培养基能正常生长，且在 存在下四缺培养中显蓝色，说明报告基因被激活表达。以上 个蛋白被确定为最终的候选互作蛋白。互作蛋白基因的表达分析为了确定编码候选互作蛋白基因的表达情况，对前期果实后熟的组学数据进行分析发现，个基因在果实后熟的不同阶段，无论是在果皮还是在果肉中都能检测到明显的表达；在未处理条件下，在果皮和果肉中的表达丰度都最高，次之；基因 和 的表达受乙烯利抑制，受 的诱导，而基因 和 在果皮和果肉中都呈现受乙烯利诱导表达、而受 抑制的表达趋势（图），说明以上基因可以在果实的后熟过程中起重要的作用。进一步对果实不同发育阶段的转录组数据（未发表数据）分析发现，各基因在发育过程中都能检测到明显的表达，的表达丰度最高，但在不同发育阶段的表达无明显差异（图）；其他基因能检测到表达，但丰度不高，且在各时期的表达差异也不明显，说明它们与果实的发育过程关联性不强，主要在果实后熟过程起作用。图 及其互作蛋白基因在香蕉后熟过程中的表达分析.热图是用 软件以 值取 为底的对数制作。下同。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 及其互作蛋白基因在香蕉果实发育过程的表达分析.图 与 互作的双分子荧光互补分析.已明确存在相互作用的蛋白（与）作为阳性对照。（）互作蛋白的 验证分析 互作蛋白 编码一个 转录因子（表），前述的表达数据分析发现，的表达与果实后熟过程密切相关，暗示其可能在香蕉后熟过程中起重要的调控作用。为了进一步确定其与 的互作关系，针对这 个基因，利用水稻原生质体瞬时转化体系进行双分子荧光互补试验，将 的编码框（去除终止密码子）与 蛋白 端编码区连接得到 载体，编码框与 蛋白 端编码区连接得到 载体。结果发现，与 质粒组合出现明显的 荧光信号，而 与空载 的组合没有任何荧光信号，说明 个蛋白存在明显的相互作用（图）。图 果实后熟过程中 蛋白的表达分析.和 蛋白相对分子质量分别为 和。图下的数字是以条带的灰度值所计算出的相对表达值（的值设为）。，（）蛋白的表达分析在鉴定的互作蛋白中，有 个 泛素连接酶的同源蛋白，且表达数据分析发现，其中 个是受乙烯利诱导表达，且 能抑制它们的表达（图），说明 泛素连接酶可能参与调控果实后熟过程。用 的多克隆抗体检测其表达发现，蛋白随果实的成熟其表达水平逐渐降低，根据条带的灰度值，利用 进行均一化处理量化分析表明，在果实成熟后期 蛋白水平仅为成熟初始期的，说明其随着果实的后熟过程逐渐降解（图）。讨论酵母双杂交技术是研究蛋白互作的常用方法之一，因其操作简便，已被广泛应用于高通量筛选靶标蛋白的互作因子，在鉴定新基因及解析重要蛋白互作调控方面发挥重要作用。高 第 期王川，等：香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选质量酵母双杂交文库是开展有效文库筛选的基础，一般从库容和插入段大小来判断。本研究构建的初级和次级文库的库容为 左右，且插入片段的平均大小都大于 ，并且通过筛库最终鉴定出 个可能的互作蛋白，说明文库质量较好，此文库也可以用于其他靶标基因互作蛋白的筛选。酵母双杂交技术只能用于核蛋白的筛选且假阳性较高，因此只能作为互作蛋白的初步筛选，对于初筛出的互作蛋白还需采用其他方法，如基因全长点对点酵母双杂交验证、双分子荧光互补技术及免疫共沉淀技术等进一步验证蛋白互作的真实性。本研究最初共筛选得到 个候选阳性克隆，提取文库质粒进行点对点互作验证也证明其存在相互作用，但进一步克隆基因编码区进行点对点互作分析发现，只有 个候选蛋白与 存在明显的相互作用，这可能是由于基因片段在整合进文库质粒时发生了移码，导致所表达的融合蛋白并不是通过测序所鉴定出的蛋白。研究表明，家族转录因子与香蕉果实的后熟过程密切相关，转录因子表达的下调能明显延缓果实的后熟过程，其作为关键的成熟调控因子可能通过与其他蛋白相互作用来共同调控下游的靶标基因。在番茄中 通过形成异源复合物的形式来调控乙烯合成、细胞壁降解、类胡萝卜素及香味物质的合成等。香蕉 转录因子也可能通过形成异源多聚体的形式调控与成熟密切相关 转录因子的表达。本研究通过酵母双杂交筛库鉴定 个可能与其互作的 转录因子 和，且这 个转录因子的表达模式类似，乙烯利处理后表达下降，而 能诱导表达上调；通过双分子荧光互作试验进一步确认 与 存在明显的物理相互作用，预示其可能参与 所调控的果实后熟过程，具体的作用机制需进一步探究。此外，候选的互作蛋白中包含 个与蛋白降解途径相关的 泛素连接酶蛋白、及。已有研究表明，泛素连接酶能直接与（）互作来调节乙烯的合成。报道显示，在苹果中 泛素连接酶可通过与花青素合成关键调控因子互作来影响花青素的积累。而且，近年研究显示，香蕉中 泛素连接酶 能通过调节重要的成熟相关蛋白的稳定性，如（、）、及（），来参与果实的后熟过程。尽管前期有研究指出，基因的表达在果实的后熟过程中无明显变化，但本研究对蛋白表达检测发现，随着果实的成熟蛋白水平逐渐降低，且互作蛋白的鉴定显示 泛素连接酶可与 互作，这预示着 泛素连接酶可能通过与其互作来调控果实的成熟过程。本研究还发现，组蛋白脱乙酰酶（）和转录共抑制子 也能与 蛋白互作。有研究表明，组蛋白脱乙酰酶通过与转录因子互作来参与调控基因的表达。是参与抑制基因表达的抑制子，如在花发育过程中，（）、（）及 能与 互作来调控花发育相关基因的表达。这表明 可能通过与起抑制作用的蛋白互作来抑制部分下游靶基因的表达，而这些靶基因很可能是对果实成熟起负调控作用的基因。对这些候选互作蛋白功能的深入研究，将有助于全面解析 调控香蕉果实后熟过程的分子机制。参考文献：，：，（）：芦旺，席万鹏 转录因子在果实成熟及品质形成中的调控作用研究进展 园艺学报，（）：，（）：（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：南 京 农 业 大 学 学 报第 卷，（），：张远森，秦晓萌，严金平，等 香蕉 基因家族的生物信息学分析 植物生理学报，（）：，（）：（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：许向阳，裴童，吴泰茹，等 干旱胁迫下“”番茄酵母双杂交 文库构建和鉴定 东北农业大学学报，（）：，“”，（）：（）羊海珍，顿珠加布，徐齐君 青稞白粉菌诱导酵母双杂文库的构建及 互作蛋白的筛选 分子植物育种，（）：，（）：（），（）：，：卫玮，邝健飞，陆旺金，等 泛素化调控香蕉果实成熟的相关机制分析 第三届全国植物开花 衰老与采后生物学大会，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：责任编辑：范雪梅