线粒体DNA碱基编辑技术研究进展_宋睿嘉.pdf

遗传 Hereditas(Beijing)ISSN 0253-9772,CN 11-1913/R 遗传网络首发论文遗传网络首发论文 题目：线粒体 DNA 碱基编辑技术研究进展 作者：宋睿嘉，韩露，孙海峰，沈彬 DOI：10.16288/j.yczz.23-045 收稿日期：2023-03-01 网络首发日期：2023-07-05 引用格式：宋睿嘉，韩露，孙海峰，沈彬线粒体 DNA 碱基编辑技术研究进展J/OL遗传.https:/doi.org/10.16288/j.yczz.23-045 网络首发网络首发：在编辑部工作流程中，稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定，且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式（包括网络呈现版式）排版后的稿件，可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合出版管理条例和期刊出版管理规定的有关规定；学术研究成果具有创新性、科学性和先进性，符合编辑部对刊文的录用要求，不存在学术不端行为及其他侵权行为；稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准，正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性，录用定稿一经发布，不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容，只可基于编辑规范进行少量文字的修改。出版确认出版确认：纸质期刊编辑部通过与中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有限公司签约，在中国学术期刊（网络版）出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版，以单篇或整期出版形式，在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为中国学术期刊（网络版）是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版。Hereditas(Beijing)收稿日期:2023-03-01;修回日期:20230621;基金项目:国家重点研发计划项目(编号：2021YFC2700600)，国家自然科学基金项目(编号：31970796)资助Supported by the National Key R&DProgram of China(No.2021YFC2700600),and the National Natural Science Foundation of China(No.31970796)作者简介:宋睿嘉，在读本科生，专业方向：临床医学。E-mail：韩露，在读硕士研究生，专业方向：生殖医学。E-mail：宋睿嘉和韩露并列第一作者。通讯作者:沈彬，博士，研究员，研究方向：生殖医学、基因编辑。E-mail：DOI:10.16288/j.yczz.23-045综 述线粒体线粒体 DNADNA 碱基碱基编辑技术研究进展编辑技术研究进展宋睿嘉，韩露，孙海峰，沈彬南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室，南京 211166摘要:线粒体作为真核高等生物的能量工厂，通过有氧呼吸的方式为各项生命活动提供能量（ATP）。线粒体拥有一套独立于细胞核的基因组线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），编码 37 个基因，其突变会导致线粒体疾病，目前已在人 mtDNA 中鉴定出了超过 100 种致病突变位点，总发病率约为 1/5000。近年来，基于 CRISPR 的碱基编辑技术已经实现了对核基因组的精确编辑，然而由于 CRISPR 系统中的引导 RNA 难以通过线粒体的双层膜结构，在 mtDNA 上实现精确的碱基编辑仍具有较大的挑战性。2020 年，美国哈佛大学 David R.Liu 实验室报道了一种伯克霍尔德氏菌来源的双链 DNA 脱氨酶 DddA，将其与可编程的转录激活样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）和尿嘧啶糖苷酶抑制剂（uracil glycosylase inhibitor，UGI）融合组装成为 DdCBEs（DddA 来源的胞嘧啶碱基编辑器），首次在 mtDNA 上实现了特异高效的 CG 到 TA的转换。本文对近几年基于 DddA 的线粒体碱基编辑技术的发展进行综述，并对其未来应用前景进行展望，以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化线粒体碱基编辑技术提供参考。关键词:线粒体 DNA；碱基编辑；线粒体疾病；DdCBEAdvances in mitochondrial DNA base editing technologyRuijia Song,Lu Han,Haifeng Sun,Bin ShenState Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,ChinaAbstract:Mitochondria,the energy factories of higher eukaryotes,provide energy(ATP)for life activities throughaerobic respiration.They possess their own genome,mitochondrial DNA(mtDNA),which encodes 37 genes.Mutations inmtDNA cause mitochondrial diseases,and more than 100 pathogenic mutations have been identified in human mtDNA,with a total incidence rate of about 1/5000.In recent years,advances in CRISPR-based base editing technology haveenabled accurate editing of nuclear genes.However,it remains a challenge to achieve precise base editing on mtDNA due tothe difficulty of guide RNA in the CRISPR system passing through the mitochondrial double-membrane.In 2020,David R.Lius group at Harvard University reported a double-stranded DNA deaminase DddA from Burkholderia cenocepacia,网络首发时间：2023-07-05 16:51:27网络首发地址：https:/ 36 卷which was fused with the programmable transcription activator-like effector(TALE)and uracil glycosylase inhibitor(UGI)to develop DddA-derived cytosine base editors(DdCBEs).Using DdCBEs,they were able to achieve specific and efficientCG to TA conversion on mtDNA for the first time.In this review,we summarize the recent progress of mitochondrial baseediting technology based on DddA and prospect its future application prospects.The information presented may facilitateinterested researchers to grasp the principles of mitochondrial base editing,to use relevant base editors in their own studies,or to optimize mitochondrial base editors in the future.Keywords:mitochondrial DNA;base editing;mitochondrial diseases;DdCBE线粒体是真核生物重要的细胞器，不仅通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）进行有氧呼吸产生 ATP，而且在氨基酸生物合成、脂肪酸和类固醇代谢方面亦发挥了重要作用1,2。根据由外向内的结构可将线粒体划分为四个功能区：线粒体外膜（outer membrane,OM）、线粒体膜间隙（intermembrane space,IMS）、线粒体内膜（inner membrane,IM）和线粒体基质（matrix）。线粒体内膜又可划分为三个区域：内界膜（inner boundary membrane,IBM）、嵴连接（crista junction,CJ）和嵴（cristae）3。人体几乎所有的细胞都具有线粒体（成熟红细胞除外），不同组织的细胞内线粒体数量不同，神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等含有的线粒体数量较多，这与其高代谢率有关。在哺乳动物细胞中，mtDNA以共价闭合的双链环状分子存在，可分为编码区和非编码区2,4,5。哺乳动物的mtDNA编码区共含有37个基因，由13个氧化磷酸化相关的蛋白质编码基因、2个rRNA基因（编码12S rRNA和16S rRNA）以及22个tRNA基因组成4,6。非编码区又称D环区（D-Loop region）或控制区（control region），与mtDNA的复制及转录有关6。由于mtDNA缺少组蛋白保护，且其处于线粒体氧化磷酸化所产生的高活性氧环境之中，加之线粒体缺乏有效的DNA损伤修复系统，因此mtDNA极易受到氧自由基的攻击而发生突变，突变率较核基因组高1017倍2,79。由于线粒体基因组缺乏内含子，mtDNA突变很容易累及基因组内重要的功能区，当突变型mtDNA的占比例超过突变负荷的阈值时（一般为60%90%），可导致线粒体功能障碍相关性疾病的发生1,2,8。长久以来，科研人员一直探索如何对 mtDNA 突变进行模拟或者修复。由于线粒体双层膜结构缺乏高效的 DNA 和 RNA 的转运系统，导致以 CRISPR 为基础的 DNA 编辑工具很难在线粒体中进行工作1012。仅以蛋白为基础的 mtDNA 编辑器可以进入线粒体（如 ZFN1319和 TALEN2024），对突变的 mtDNA 分子进行 DNA 双链切割，随后线性化的 mtDNA 被线粒体的外切酶快速降解，这一过程虽然使得突变型/野生型mtDNA 的比例发生变化，但它们不能在 mtDNA 上模拟突变或者修复突变，且无法改变同质性突变的比例10,25。线粒体碱基编辑技术的诞生打破了这一僵局，本文将对线粒体碱基编辑技术的发展进行介绍和总结。1 1DddADddA 衍生的胞嘧啶碱基编辑器（衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DddA-derivedDddA-derived cytosinecytosine basebase editorseditors，DdCBEsDdCBEs）1 1.1.1 基于双链基于双链 DNADNA 脱氨酶脱氨酶 DddADddA 实现实现 mtDNAmtDNA 上的胞嘧啶碱基编辑上的胞嘧啶碱基编辑目前使用的核基因组碱基编辑器均基于 CRISPR/Cas 系统，其将 DNA 双链解旋，暴露出单链 DNA，再通过天然的或人工改造的脱氨酶（如胞嘧啶脱氨酶 rAPOBEC 和腺嘌呤脱氨酶 TadA）与 nCas9 融合，实现 DNA 上胞嘧啶的脱氨（C 到 dU）或腺嘌呤的脱氨（A 到 dI），从而在 DNA 修复和复制过程中被识别为 C 到 T 或 A 到 G2629。2020 年，Mok 等30在伯克霍尔德氏菌中发现了一种新型的细菌间毒素 DddA，并尝试将其脱氨酶结构域 DddAtox应用于 mtDNA 的碱基编辑。DddAtox可以催化双链 DNA 上胞嘧啶（dC）的脱氨，形成尿嘧啶（dU）。为了克服全长的 DddAtox对哺乳动物细胞的毒性伤害，DddAtox被分裂为两个半体，并分别融合到线粒体靶向的 TALE 阵列中，从而确保两个半体在靶向基因区域结合在一起时才恢复催化活性。胞嘧啶脱氨后形成的 dU 会被内源性的尿嘧啶糖苷酶（UNG）切除31，将两条 TALE 分别融合 UGI，以阻止 dU 被切除，经过 DNA 复制或修复，最终实现了 CG 到 TA 的碱基对转换。这一套第*期作者等:标题3编辑系统被称为DddA 来源的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBEs）(图 1，表 1)。Mok 等30通过使用不依赖CRISPR 的 DdCBEs 首次在 mtDNA 上实现了精确的碱基编辑，得到的 mtDNA 突变细胞呈现出线粒体功能受损的表型。这对于理解 mtDNA 突变与线粒体疾病表型的关系提供了重要细胞模型，为后续新型碱基编辑器的开发奠定了基础(表 1)，对由 mtDNA 突变导致的线粒体疾病的研究及基因治疗具有深远意义3235。表表 1 1 线粒体碱基编辑器的编辑类型和序列偏好性线粒体碱基编辑器的编辑类型和序列偏好性Table1 The editing type and motif of mitochondrial base editors线粒体碱基编辑器编辑类型序列偏好性DdCBEsCG 到 TATCmDdCBEsCG 到 TATCHiFi-DdCBEsCG 到 TATCDdCBEs（V6）CG 到 TATCDdCBEs（V11）CG 到 TAHC（H=A，C，T）TALEDsAT 到 GCNA（N=A，C，T，G）1 1.2.2 DdCBEDdCBE 在构建疾病模型中的应用在构建疾病模型中的应用为了探究 DdCBEs 是否能够实现在体 mtDNA 编辑，构建模拟人 mtDNA 突变疾病的动物模型，Lee 等36设计了靶向小鼠线粒体基因Nd5的 DdCBEs，在体外将其转录成 mRNA 并显微注射进合子中，成功诱导出了 mtDNA 中 C12539T 和 G12542A 的突变，并在 F0 代成年小鼠的各种组织中检测到编辑，证实了受精卵注射 DdCBEs 诱导产生的线粒体编辑可在整个发育过程中得到维持。将雌性 F0 小鼠与野生型雄性小鼠杂交后，F1 小鼠中也可检测到靶位点的突变，表明了 DdCBE 诱导的突变可以通过母系遗传到下一代36。与此同时，Guo 等37在小鼠 N2A 细胞中筛选出靶向 G7763 和 G2820 位点的高效 DdCBEs 组合，将转录产物注射到小鼠的受精卵中，成功模拟了人线粒体上的 G8363A 和 G3376A 突变。为进一步提高在小鼠中的编辑效率，Lee 等38将靶向 mtDNA 的 TALENs（mitoTALENs）与 DdCBEs 共注射到受精卵中以切割未编辑的 mtDNA，同时在 DdCBEs 中加上出核信号（NES）以提升其进入线粒体的能力，可以得到编辑效率达46.2%的 mtDNA 突变个体，表型分析显示小鼠的肾脏和棕色脂肪组织中的线粒体受损、海马萎缩，表现出与人类 G13513A 突变患者相似的驼背症状38。除了小鼠动物模型，Guo 等39将 DdCBE mRNAs 注射到斑马鱼一细胞期受精卵中，在 F0 代的 G8892、G4247 和 G14076 位点处分别检测到高达 88.32%、23.48%和 67.9%的编辑效率，在 F1 代中，G8892A 和G4247A 的突变率最高分别为 84.33%和 40.42%。通过对 120 天龄的 F1 代 G4247A 个体和 45 天龄的 F0代 G14076A 个体进行游泳轨迹试验，发现其均表现出了明显的运动能力缺陷。使用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）对编辑后的斑马鱼骨骼肌进行分析，发现了线粒体基质中出现了明显的嵴退化和断裂。这些结果表明斑马鱼可通过精确的 DdCBEs 编辑成为人 mtDNA 突变疾病的动物模型。Qi 等40在大鼠中找到与人类线粒体 G8363A 和 G14710A 突变对应的 G7755 和 G14098 位点，利用 DdCBEs 进行了高效的靶向编辑（编辑效率分别高达 36.33%和 46.73%）。与野生型大鼠相比，在突变个体的心脏和大脑中检测到 ATP 水平下降，同时，突变个体的运动协调和前肢握力受损，而学习能力和精神状态并没有受到影响。通过超声评估了 4 月龄 G14098A 的 F1 雄性大鼠心脏结构和功能，发4Hereditas(Beijing)2014第 36 卷现其表现出扩张型心肌病表型，心室扩大，室壁变薄，收缩功能下降。这些工作为研究线粒体疾病的致病机制和临床基因治疗提供了重要的动物模型40。1 1.3.3 AAVAAV 包装包装 DdCBEDdCBE 介导线粒体介导线粒体碱基碱基编辑编辑DdCBE 介导的双链 mtDNA 脱氨产生的 dU 需要 DNA 的复制或修复机制来最终实现 CG 到 TA 的编辑，是否能在成体有丝分裂后的心肌细胞中进行 mtDNA 碱基编辑仍需探索。之前的研究表明，成年哺乳动物的细胞中不含心脏干细胞，心肌细胞不会分裂41,42。为此，Silva 等43通过用两个腺相关病毒载体（AAV）包装 DdCBEs 后，通过尾静脉注射递送至成年小鼠的心脏。注射后的第 3 和第 24 周，在小鼠心脏组织中分别检测到了 2%和 20%的编辑效率。研究者进一步在出生 24 h 的小鼠上通过颞静脉注射 AAV，在第三周获得了约 30%的编辑效率。这些结果证实了 DdCBEs 编辑可用于在有丝分裂后的组织细胞中，为在体 mtDNA 的靶向诱导突变提供了概念上的证明。传统版本的 DdCBEs 以两个蛋白的方式共同发挥作用（图 2A），较大的基因长度（5 kb）影响病毒颗粒的包装，比如常用 AAV 的包装上限是 4.7 kb。为此，Mok 等44开发了一种全长无毒的突变版本DddA，通过结构指导的位点突变与易错 PCR 随机突变的方式，获得了两种的 DddA 全长突变体GSVG和 E1347A，在融合一条 TALE 后可实现 mtDNA 上高效的 CG 到 TA 编辑，该工具称为 mDdCBE（图 2B，表 1）。其中，GSVG 版本与传统拆分的 DdCBE 编辑效率相当，在ND4、ND6和ND1的编辑效率分别达到了 31%、27%和 42%，而 E1347A 版本的 mDdCBE 的编辑效率稍低，在这三个位点的编辑效率分别为 7.2%、8.9%和 13.7%。通过 AAV 包装了靶向ND4和ND1位点的 mDdCBE，在转染 HEK293FT 细胞 6 天后分别检测到了 99.1%和 59.8%的高效编辑。与传统拆分的 DdCBE 相比，mDdCBE 最大的优势就是其较小的长度，能被高效包装进 AAV 中，为未来的临床应用提供了新的工具。1 1.4.4 DdCBEDdCBE 在人胚胎中的编辑在人胚胎中的编辑为了评估 DdCBE 在人类早期胚胎 mtDNA 上的编辑效率，Chen 等45将 DdCBE mRNAs 注射到人类 3PN胚胎（tripronuclear zygotes，3PN）的细胞质中，在注射后的第 3 天、第 5 天和第 6 天分别收集 3PN胚胎进行测序。根据之前的报道，从人类的受精卵到植入前胚胎阶段，mtDNA 的复制活性是被抑制的46，但 DdCBE 介导的碱基转换依赖于脱氨基后 mtDNA 的复制，因此在早期胚胎阶段不活跃的 mtDNA 复制可能会影响编辑结果。通过使用可兼容 dU 的 DNA 聚合酶（UC）和不兼容 dU 的 DNA 聚合酶（HiFi）对注射了 G3733-DdCBE mRNAs 的 3PN 胚胎进行检测，发现在靶位点可分别检测到高达 37.54%和 58.97%的编辑，在 G8363 位点分别是 44.54%和 10.37%，这些结果说明在人类 3PN 胚胎发育过程中，mtDNA 发生了复制。值得注意的是，研究团队在注射了 G3733-DdCBE 和 G8363-DdCBE 的 3PN 胚胎中分别鉴定出 255个和 137 个的脱靶位点，其中，绝大多数脱靶位点处在 TC 基序上，且 106 个脱靶位点是共有的，证明了这些脱靶编辑主要是由 DddA 本身与 mtDNA 的结合所引起45。与此同时，Wei 等47也设计了靶向人 mtDNA 上ND4基因的 ND4-DdCBE。将 DdCBE mRNAs 注射到人受精卵、2 细胞、4 细胞和 8 细胞胚胎中，可在注射后 48 h 检测到高效的编辑效率。进一步针对线粒体基因组构建了靶向不同位点的 DdCBE，发现 DdCBE 均能诱导有效的 CG 到 TA 的编辑，最高达 60%，并且在 8 细胞注射时效率最高。这两项工作首次证明了 DdCBE 在人类胚胎中介导线粒体碱基编辑的可行性，也表明了在人类早期胚胎阶段修正致病 mtDNA 突变的可能性，为母系遗传的线粒体疾病的治疗提供了潜在的治疗方法。尽管目前已在多种模式动物中证实了 DdCBE 可以高效的模拟人类的 mtDNA 致病突变，但 DdCBE 技术在走向临床应用前，更多的高等模式动物模型如食蟹猴、更多的致病位点、以及 mtDNA 突变后致病机制等仍需要科研工作者们进一步的研究（图 3B）。2 2解决解决 DdCBEDdCBE 的脱靶问题的脱靶问题2 2.1 1 与核定位的与核定位的 DddIDddIA A共表达抑制核脱靶共表达抑制核脱靶在之前的报道中，DdCBEs 会在 mtDNA 中造成脱靶，但在核基因组中的脱靶情况未得到全面分析。Wei 等48 50通过他们之前开发的 GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo第*期作者等:标题5injection）技术，首次报道了 DdCBE 在核基因组中存在着大量脱靶。通过对荧光报告小鼠二细胞受精卵的其中一个卵裂球注射 DdCBE 和 Cre mRNAs，然后对 14.5 天的胚胎分选 tdTomato 阳性和阴性细胞并进行全基因组测序，Wei 等51揭示了 DdCBE 在核基因组中导致了上千个 CG 到 TA 转换的单核苷酸变异脱靶，并且存在着 TC 基序的富集，但并未发现这些脱靶位点在全基因组上的分布规律，因此认为DdCBEs 造成了核基因组上的随机脱靶。而 Lei 等52利用之前开发的 Detect-Seq 技术，通过捕获 DdCBE 诱导的中间产物 dU,也在核基因组上检测到了大量的脱靶53。通过对这些脱靶位点进行分析，将其分为 TALE 序列依赖性和非 TALE 序列依赖性脱靶，并发现后者在不同的样本中高度重合，说明 DdCBE 介导的非 TALE 序列依赖性脱靶在核基因组上并非随机发生。进一步的分析表明，这些脱靶位点的临近基序与 CTCF 蛋白的核心结合基序高度匹配，并通过免疫共沉淀实验证明，非 TALE 序列依赖性脱靶与 CTCF 和 Cohesion 共定位。CTCF 蛋白对维持基因组三维结构起重要作用54,55，但尚不清楚 DdCBE 与 CTCF 蛋白共定位背后的原因，以及过表达DdCBE 会因此而对核染色体的三维结构造成何种影响53。最后，Lei 等53提出了降低 DdCBE 核脱靶的三种策略：（1）根据蛋白的晶体结构30，尝试突变 DddA来减少其 DNA 结合活性；（2）共表达融合了核定位信号的 DddIA A蛋白（一种天然的 DddA 对抗蛋白），从而在核内抑制 DdCBE 的脱氨酶活性，此方法抑制核脱靶的效果最好（图 2C）；（3）在 DdCBE 基础上增加出核信号（NES），从而减少其核内定位。这些方法保护了核基因组免受 DdCBE 的胞嘧啶脱氨攻击，为线粒体的基因编辑提供了更精准的工具。2 2.2.2 理性设计构建高保真版本的理性设计构建高保真版本的 DdCBEDdCBE在之前的研究中，DdCBE 被报道会引起 mtDNA 上的脱靶。Lee 等56推断 DdCBE 的脱靶活性可能有两个来源：1）TALE 在高度同源序列上造成脱靶；2）不依赖于 TALE 识别的 DddA 两个半体的自发组装，然后对双链 DNA 上的胞嘧啶造成脱氨。前者和 TALE 的序列特异性结合有关，而后者则是更普遍的问题，因此研究者们着重于解决 DddA 两个半体的自发组装。受到前期提高锌指核酸酶特异性的方法启发57，58，Lee 等设计改造了 DddA 半体相互作用的界面，以避免自发组装。他们先鉴定出了两个半体界面紧密接触的氨基酸，通过将其突变为惰性的丙氨酸，随后检测这些突变体的编辑效率和脱靶活性，开发出了高保真的 DdCBEs 版本（HiFi-DdCBEs）（图 2B，表 1）。研究者选择了人类线粒体基因组中的四个位点进行测试，全线粒体 DNA 测序结果显示，与传统的DdCBEs 在人类 mtDNA 中诱导数百个 CG 到 TA 的脱靶位点相比，HiFi-DdCBEs 在实现高效靶位点编辑的同时，减少了 mtDNA 上的脱靶编辑。如果该工具在多个线粒体位点也能保持该特性，将会是构建mtDNA 突变动物模型和细胞系的理想选择，也为 mtDNA 突变疾病患者的临床基因治疗提供更安全的方案56。3 3基于基于 DddADddA 工程化改造的线粒体工程化改造的线粒体 DNADNA 碱基编辑工具碱基编辑工具3 3.1.1 定向进化改造出效率提升与编辑序列偏好性拓宽的增强版定向进化改造出效率提升与编辑序列偏好性拓宽的增强版 DdCBEDdCBE对于原始版本的 DdCBE 而言，mtDNA 上的编辑效率及编辑模式主要取决于目标 C 在编辑窗口内的位置，目前仍存在着效率偏低，且具有较强的 TC 基序偏好性，需要进一步的优化和改进30。Mok 等59通过噬菌体辅助进化技术6062对 DdCBE 中的 DddA 进行定向进化改造，以增加其对 TC 和非 TC 靶标的编辑活性，最终获得的 DddA 突变体表现出了活性提升和靶向序列范围扩大的特性（图 2B，表 1）。其中，DddA11-DdCBE 为线粒体和核碱基编辑提供了更广泛的 HC（H=A、C 或 T）序列兼容性，并将 AC 和 CC 靶标的平均编辑效率从原始的不到 10%提高到 15%30%。研究团队进一步分析了升级版碱基编辑器的脱靶效应，发现与原始版本相比，DddA6 和 DddA11 两个进化版本在某些位点的总体脱靶率略有升高，但脱靶/上靶的比值与初始版本相似。总之，利用噬菌体进化得到的增强版 DdCBEs，具有更高的编辑效率和更广泛的编辑范围，大大提高了 mtDNA 碱基编辑的有效性和适用性59，但也降低了碱基编辑的精度。6Hereditas(Beijing)2014第 36 卷3 3.2.2 DddADddAtoxtox与与 TadA8eTadA8e 融合实现线粒体融合实现线粒体 DNADNA 上上 A AT T 到到 G GC C 的转换的转换尽管 DdCBEs 的开发及优化带来了 mtDNA 突变动物模型的广泛应用，但是来源于伯克霍尔德氏菌中的双链 DNA 胞嘧啶脱氨酶 DddA 局限于 CG 到 TA 的转换。为此，Cho 等63将 DddAtox与单链 DNA 腺嘌呤脱氨酶（TadA8e）28,64相融合，构建出了在 mtDNA 上可实现 AT 到 GC 转换的编辑器TALEDs(转录因子激活样效应蛋白连接的脱氨酶)（图 2D，表 1），在细胞中最高编辑效率可达 49%63。在这项研究中，构建了三种不同类型的可实现 AT 到 GC 转换的碱基编辑器，分别为：sTALED（split TALEDs）、mTALED（monomeric TALEDs）、dTALED（dimeric TALEDs）。其中 mTALED 的编码基因(长度为 3.13.5 kb)可以很容易地包装在 AAV 中，这将在基因递送方面发挥出优势。此外，研究者们对 TALEDs 的编辑序列偏好、窗口、及脱靶做了详细的探究工作。研究者发现，与 DdCBEs 不同的是，TALEDs 并不需要在靶位点及其邻近序列中包含 TC；不同类型的 TALEDs 及左右臂的位置对靶位点处的编辑模式各不相同，主要编辑位置集中在 TALE 的 C 端 512 位的 AT 位点（sTALEDs）或是 712 位的 AT 位点（mTALEDs 和 dTALEDs）。TALEDs 的旁编辑比较严重，但整体 mtDNA 脱靶水平较低，仅有少量的脱靶位点集中在 D-Loop 区。在 MitoMap 中列出的 90 余个致病性 mtDNA 点突变中，TALEDs 可实现比 DdCBE 更多的位点模拟，拓宽了线粒体 DNA 的碱基编辑范围。但是目前的 TALEDs 仍存在着严重的旁观者编辑等缺点，需要开发出更高效和特异的版本，从而实现更精准的 mtDNA 碱基编辑63,65。4 4结语与展望结语与展望伯克霍尔德氏菌来源的双链 DNA 脱氨酶 DddA 与 MTS、TALE、UGI 融合后构成的编辑器 DdCBEs 首次实现了 mtDNA 的碱基编辑，为 mtDNA 突变疾病的研究和临床基因治疗带来了曙光（图 3A），改变了传统的在线粒体中基于 TALEN/ZFN 切割突变型 mtDNA 的方法30。利用 DdCBE 构建的一系列动物模型为线粒体 DNA 突变与疾病表型的探索提供了新的途径与见解（图 3B）36,37,39,40,43。DddA 所具有的 TC 序列偏好性也一定程度上被用来在编辑窗口内实现 C 到 T 的精确编辑30。对其工程化改造的增强版本 DddA6、DddA11 和 NES-DdCBE 进一步提升了 DdCBE 的编辑活性、拓宽了编辑编辑范围38,59。体积紧凑的单 TALE 臂引导的 mDdCBE 可以包装进 AAV 载体中实现更便捷的递送44。TadA8e与 DdCBE 融合得到的 TALEDs，将原始的 CG 到 TA 的碱基编辑类型进一步拓宽到了 AT 到 GC63。共表达核定位的 DddIA A可以很大程度上消除 DdCBEs 所造成的核脱靶53，而工程化改造的高保真型DdCBEs 则可降低在 mtDNA 上的脱靶，提升了安全性56。此外，将 DdCBEs 中的 TALE 替换为锌指蛋白（ZFP）亦被报道用于线粒体 DNA 编辑66,67。但目前的 DdCBEs 及基于此的 TALEDs 编辑器仍存在着序列特异性不足、编辑窗口内靶碱基编辑不够特异、以及编辑模式仍局限于 CG 与 TA 间相互转换，未来是否能够实现更加精确地识别不同特征序列（NC），以及近一步拓宽碱基转换类型（如：C 到 A 或 G，A 到 C 或 T），这些工作仍待进一步的深入研究。此外，mtDNA 上插入缺失（Indels）突变被报道与疾病相关的，目前仍没有可模拟或修复的办法，能否在线粒体中实现同源重组修复或类似于引导编辑器（Prime Editing）68,69介导的可定制编辑也值得研究者们进一步探究。总之，DddA 来源的线粒体碱基编辑器的诞生与发展提高了人们对线粒体疾病的认识，未来借鉴核基因碱基编辑技术的优化方法70，并与不断发展的递送技术相结合，将为线粒体疾病的基因治疗提供更高效安全的碱基编辑工具（图 3C）。第*期作者等:标题7图图 1 1 DdCBEDdCBE 介导的线粒体介导的线粒体 DNADNA 上的上的 C CG G 到到 T TA A 编辑的模式图编辑的模式图Fig.1 The model of CG to TA editing of DdCBE on mitochondrial DNADdCBE 的主要组成部分：线粒体靶向信号肽（MTS）、左/右 TALE 臂、G1333 或 G1397 位置拆分的半体 DddAtox、尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI）。转入细胞后的 DdCBE 载体在核内转录出 mRNA，随后在胞质中翻译成为成熟的蛋白。DdCBE 蛋白在 MTS 的引导下进入线粒体，左右臂分别结合在靶编辑位点的两侧，从而形成完整的 DddAtox蛋白发挥脱氨酶活性。C在脱氨后形成 dU，并在 UGI 的作用保持 dU 的存在，最终在经过 DNA 复制或 DNA 修复后实现 CG 到 TA 转换。8Hereditas(Beijing)2014第 36 卷第*期作者等:标题9图图 2 2 基于基于 DddADddA 开发的线粒体碱基编辑器开发的线粒体碱基编辑器Fig.2 Mitochondrial base editors based on DddAA:原始版本的 DdCBEs 主要实现 TC 基序中的 C 到 T 的编辑；B：通过对 DdCBEs 中的 DddAtox进行工程化改造得到的不同突变体 DdCBEs 版本，分别是对 TC 编辑活性有提升的 v6 版本（DdCBE-DddA6）、对 non-TC 基序具有活性的 v11 版本（DdCBE-DddA11）、携带突变 DddAtox的单 TALE 臂版本（mDdCBE），以及高保真版本（HiFi-DdCBE）；C：DddIA-DdCBE通过同时表达核定位的 DddIA蛋白，最大程度降低了 DdCBE 在核内的脱靶；D：通过与腺嘌呤脱氨酶 TadA8e 结合，构成三种版本的 TALEDs，可以实现 mtDNA 上的 AT 到 GC 的编辑。黑色星号（*）：Mok 等通过定向进化得到的增强版 DddAtox；黑色井号（#）：Mok 等工程化改造的没有明显毒性的 DddAtox；红色星号（*）：Lee 等通过界面氨基酸突变得到的高保真型 DddAtox；黑色三角号（）：催化活性失活的 DddAtox。图图 3 3 线粒体碱基编辑器的未来应用线粒体碱基编辑器的未来应用Fig.3 The future application of mitochondrial base editorsA：通过线粒体碱基编辑工具可以实现 mtDNA 上的突变修复；B：线粒体碱基编辑工具为人 mtDNA 突变疾病的动物模型构建提供了可能（如小鼠、大鼠、斑马鱼、食蟹猴等）；C：在伦理允许下，线粒体碱基编辑工具为 mtDNA 突变导致的线粒体疾病的治疗带来了曙光。参考文献（参考文献（References）：）：1Jia ZW.Mitochondria and pluripotent stem cells function.Hereditas(Beijing),2016,38(7):603-611.贾振伟.线粒体与多潜能干细胞功能.遗传,2016,38(7):603-611.10Hereditas(Beijing)2014第 36 卷2Tuppen HAL,Blakely EL,Turnbull DM,Taylor RW.Mitochondrial DNA mutations and human disease.Biochim BiophysActa,2010,1797(2):113-128.3Neupert W.SnapShot:mitochondrial architecture.Cell,2012,149(3):722-722.e1.4Schatz G.Mitochondrial DNA.In:Encyclopedia of biological chemistry.Elsevier,2013,132-134.5Gray MW.Mito