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.357.西藏自治区鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度的测定及研究杨晓艳 辛有全 何建 靳娟 李胜 张琪 吴海莲 柏吉祥 金泳 代瑞霞*(青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室，西宁 811602)摘要：目的 根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)药敏试验方法中的琼脂平板稀释法，对分离自西藏自治区鼠疫自然疫源地内的164株鼠疫耶尔森菌进行抗菌药物最低抑菌浓度的测定，监测西藏地区耐药鼠疫耶尔森菌株，掌握其抑菌范围，为鼠疫的临床治疗提供基础数据。方法 利用琼脂平板稀释法分别测定氧氟沙星、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑(甲氧苄啶-磺胺甲恶唑)、硫酸卡那霉素、链霉素、头孢曲松钠、氨苄青霉素钠、氯霉素、盐酸壮观霉素、头孢呋辛钠、盐酸四环素、莫西沙星共12种抗生素对164株鼠疫耶尔森菌的最低抑菌浓度(MIC)。若发现耐药菌株，则用K-B法进行验证。结果 所测的164株鼠疫耶尔森菌中有1株对链霉素具有耐药性(MIC=4096 g/mL)，链霉素K-B法检测抑菌环直径为0，这株菌对其余11种抗菌药物均敏感。其余163株菌对12种抗生素均敏感。结论 发现1株鼠疫耶尔森菌对链霉素具有耐药性，这是我国首次发现鼠疫耶尔森菌对链霉素耐药。因链霉素是国内外治疗鼠疫的首选药物，耐药鼠疫耶尔森菌会引起链霉素治疗失败，从临床和公共卫生的角度来看，对鼠疫耶尔森菌分离株的抗菌敏感性监测应常规开展。关键词：耐链霉素鼠疫耶尔森菌株；西藏自治区鼠疫自然疫源地；最低抑菌浓度中图分类号：R978.1 文献标志码：ADetermination and study of the minimum inhibitory concentration of Yersinia pestis in the natural foci of plague in Tibet Autonomous RegionYang Xiao-yan,XinYou-quan,HeJian,JinJuan,LiSheng,ZhangQi,WuHai-lian,BaiJi-xiang,JinYong,andDaiRui-xia(ProfessionalLaboratoryforPlague,QinghaiInstituteforEndemicDisease Prevention and Control,Xining 811602)Abstract Objective AccordingtotheAGARdilutionmethodofdrugsensitivitytestmethodoftheclinicalandlaboratorystandardsinstitute(CLSI),theminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofantimicrobialagentsagainstYersinia pestisisolatedfromplaguenaturalfociinTibetAutonomousRegionwasdeterminedtomonitordrug-resistantYersinia pestisstrainsandmastertheirinhibitionrange,soastoprovidebasicdataforclinicaltreatmentofplague.Methods TheMICof12antibiotics(ofloxacin,ciprofloxacin,trimethoprim-sulfamethoxazole,kanamycinsulfate,streptomycin,ceftriaxonesodium,ampicillinsodium,chloramphenicol,spectinomycinhydrochloride,cefuroximesodium,tetracyclinehydrochloride,andmoxifloxacin)against164strainsofYersinia pestisweredeterminedbytheAGARdilutionmethod.Iftheresistantstrainwasfound,theK-Bmethodwasusedtoverifythestrain.Results 收稿日期：2021-12-29基金项目：青海省科技厅基础研究计划项目(No.2019-ZJ-7074)；国家卫生健康委鼠疫防治研究重点实验室(共建)(No.2019PT310004)；国家重点研发计划课题(No.2021YFC1200204)作者简介：杨晓艳，女，生于1979年，副主任技师，主要研究方向为鼠疫防治，E-mail:*通讯作者，E-mail:文章编号：1001-8689(2023)03-0357-05药理与临床中国抗生素杂志2023年3月第48卷第3期DOI:10.13461/ki.cja.007488.358.西藏自治区作为青藏高原的主体部分，1966年被证实为喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地1，它也是青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的重要组成部分。该鼠疫自然疫源地是我国乃至世界鼠疫流行最为活跃的地区之一2。1999年以来藏南地区就新增了11个疫源县3。近年来，滥用抗生素一直是全世界面临的公共卫生问题，从而导致了耐药细菌的大量出现。鼠疫耐药菌株比较罕见，已报道在马达加斯加发现了2株分离自人体的耐药鼠疫耶尔森菌株和1株分离自动物体内的鼠疫耶尔森菌株，其中人体的一株菌为多重耐药菌株4-6，耐药鼠疫耶尔森菌株的出现使得鼠疫临床治疗面临着新的挑战。为了解西藏自治区鼠疫耶尔森菌对临床常用药物的耐药情况，笔者选择鼠疫治疗、预防的药物及临床常用药等12种抗菌药物，测定这些药物对西藏自治区鼠疫耶尔森菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,以下简称MIC)，为鼠疫的临床治疗提供基础数据，现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 实验菌株、主要试剂与仪器1.1.1 实验菌株被试菌株为19662008年间西藏自治区鼠疫自然疫源地分离自39个疫源县(市)的164株代表性鼠疫耶尔森菌株(详见表1)、鼠疫耶尔森菌标准株141及质控菌株ATCC25922，均由青海省地方病预防控制所提供。1.1.2 主要试剂琼脂粉、牛肉粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白及12种抗生素均购自北京中生瑞泰科技有限公司，赫氏培养基购自北京陆桥有限公司。1.1.3 主要仪器One of 164 Yersinia pestisstrainstestedwasresistanttostreptomycin(MIC=4096g/mL),andthediameterofinhibitionringdetectedbythestreptomycinK-Bmethodwas0.Thestrainwassensitivetotheother11antibiotics.Theother163strainswereallsensitivetothe12antibiotics.Conclusion One strain of Yersinia pestiswasfoundtoberesistanttostreptomycin,whichwasthefirsttimethatYersinia pestiswasfoundtoberesistanttostreptomycininChina.Sincestreptomycinisthepreferreddrugforthetreatmentofplagueathomeandabroad,drug-resistantYersinia pestiscancausestreptomycintreatmentfailure.Fromtheperspectiveofclinicalandpublichealth,theantimicrobialsusceptibilitymonitoringofYersinia pestisisolatesshouldbecarriedoutroutinely.Key words Streptomycin resistance Yersinia pestis;NaturalplagueFociinTibet;MinimuminhibitoryconcentrationMIC多点接种仪(天津市恒奥科技发展有限公司)，细胞密度仪(英国Grant Bio)。1.2 方法按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的琼脂平板稀释法对鼠疫耶尔森菌的MIC进行抗菌药物的测定。1.2.1 抗菌药物储备液配制(1)氧氟沙星、环丙沙星、磺胺甲恶唑：先加1/2体积灭菌去离子水，然后逐滴加入1 mol/L NaOH至溶解后，再用灭菌去离子水定容，均配制成浓度为10 mg/mL的储备液。(2)硫酸卡那霉素、硫酸链霉素、头孢曲松钠、氨苄青霉素钠、盐酸壮观霉素、头孢呋辛钠、莫西沙星：直接用灭菌去离子水溶解，均配制成浓度为10 mg/mL的储备液。(3)盐酸四环素：直接用灭菌去离子水溶解，配制成浓度为5 mg/mL的储备液。(4)氯霉素：直接用95%乙醇溶解，配制成浓度西藏自治区鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度的测定及研究 杨晓艳等表1 西藏自治区鼠疫自然疫源地164株鼠疫耶尔森菌分离年代及其疫源地分布Tab.1 Isolation ages and distribution of 164 strains of Yersinia pestis in natural foci of Tibet Autonomous Region疫源地区分离年代合计19661975年19761985年19861995年19962008年拉萨市0023941山南地区0063844日喀则地区7011927阿里地区0011011那曲地区0251926昌都地区04048林芝地区00077合计7615136164.359.为10 mg/mL的储备液。(5)甲氧苄啶：用灭菌去离子水加10%终体积的0.05 mol/L盐酸，配制成浓度为2.5 mg/mL的储备液。配制好的储备液储存于-20冰箱中备用。1.2.2 培养基制备用灭菌去离子水将13种药物的储备液对倍稀释成所需浓度，加入到已灭菌的定量M-H琼脂培养基中，制备成含抗菌药物终浓度为0.004、0.008、0.015、0.031、0.062、0.125、0.25、0.50、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024和4096 g/mL的含药平皿。1.2.3 细菌接种将被试菌株28、24 h培养后，按照何建等7鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度测定方法的建立与应用中的方法用MIC多点接种仪进行接种。在接种含抗菌药物平皿前及接种完成后分别接种一个不含抗菌药物的M-H质控平皿以检查接种菌株生长性的纯度。将接种好的平皿置37温箱培养2448 h。1.2.4 结果观察将培养好的平皿置于不反光的表面上观察被试菌株是否生长。当质控菌株的MIC在质控范围内时，记录完全抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度(MIC)。当出现单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象时可判为未生长；当出现耐药性菌株生长时重复此方法至少3次以上。1.3 纸片扩散法按照美国CLSI8推荐，使用药敏纸片检测耐链霉素鼠疫耶尔森菌、鼠疫标准株141及ATCC 25922对链霉素的药敏性，当出现耐药性菌株时(未出现抑菌环)重复此方法至少3次以上。2 结果2.1 鼠疫耶尔森菌株耐药性测定164株测试菌株中未发现除链霉素外对其它11种抗生素具有单个或多个抗菌药物抗性的鼠疫耶尔森菌株，但有1株鼠疫耶尔森菌对链霉素具有耐药性，详见表2和图1。2.2 纸片扩散法结果根据美国CLSI8药敏纸片法判定标准(耐药11 mm，中度敏感为12l4 mm，敏感15 mm)，其中1#平皿为耐链霉素鼠疫耶尔森菌株(未出现抑菌环)，2#平皿为鼠疫标准株141(抑菌环直径为27.7 mm)，3#平皿为质控菌株ATCC 25922(抑菌环直径为25.1 mm)，详见图2。3 讨论本次研究对19662008年间分离自西藏自治区表2 12种抗菌药物对164株鼠疫耶尔森菌的MICTab.2 MIC of 12 antibiotics against 164 strains of Yersinia pestis抗菌药物MIC/(g/mL)MIC50MIC90敏感S耐受R0.0080.0150.030.060.120.250.501248164096氧氟沙星9826670.120.250.25/环丙沙星38827010.060.060.25/卡那霉素4311652.002.0016.00a64.00a链霉素531101*4.004.004.0016.00头孢曲松钠3994310.0080.0150.125b0.25 b氨苄西林4799180.250.51.00b4.00b氯霉素451192.004.008.0032.00壮观霉素16111378.008.0032.00b128b头孢呋辛钠44582330.250.501.00b4.00b盐酸四环素85794.004.004.00c16.00c氧苄啶-磺胺甲恶唑371270.030.0624莫西沙星115850.120.120.5 a2 a*表示抗链霉素耐药菌株；/表示CLSI中耶尔森菌只有敏感标准，无耐受标准；a表示无耶尔森菌的敏感和耐受标准，参照一般细菌标准；b表示无耶尔森菌敏感和耐受标准，参照特殊细菌标准；c表示无盐酸四环素敏感和耐受标准，参照一般细菌对四环素的标准；标准引自WHONET5.6中国抗生素杂志2023年3月第48卷第3期.360.1 2 31#：耐链霉素鼠疫耶尔森菌株；2#：鼠疫标准株141；3#：ATCC25922图2 药敏纸片法对耐药鼠疫耶尔森菌的药敏结果Fig.2 Antimicrobial susceptibility test of Y.pestis using the disk diffusion method的164株野生鼠疫耶尔森菌进行MIC测定，其中163株鼠疫耶尔森菌中未发现对除链霉素外对其它11种抗生素具有单个或多个抗菌药物抗性的鼠疫耶尔森菌株。但有1株鼠疫耶尔森菌对链霉素具有耐药性，这株菌分离自1996年西藏自治区隆子县加玉乡四村一起人间疫情人尸体内，现保藏于青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室。表现出了对链霉素的高度耐药性(MIC=4096 g/mL)，链霉素对鼠疫耶尔森菌的耐药标准为MIC16 g/mL，远超耐药标准，该菌对所测的其余11种抗菌药物均敏感，这是在我国鼠疫自然疫源地野生鼠疫耶尔森菌株中首次发现的对链霉素耐药的鼠疫耶尔森菌株。结合流行病学调查、临床症状和患者治疗情况，推断是由于临床大量使用链霉素治疗患者引起患者携带菌株出现耐药现象。链霉素对鼠疫耶尔森菌有很强的杀菌作用，自20世纪40年代末期以来，一直作为治疗鼠疫的首选药物9，链霉素耐药菌株的发现，警示我们研究新型、高效和低毒的抗菌药物应用于鼠疫临床是下一步十分迫切与必要的工作。而本次研究从表型特征上发现的耐链霉素鼠疫耶尔森菌株的耐药机制有待进一步研究。代瑞霞等10在19432016年分离自我国鼠疫自然疫源地的2753株鼠疫菌中均未检测到链霉素、-内酰胺类抗菌药及磺胺类药物耐药基因及耐消毒剂基因，而何建等11采用PCR法检测西藏自治区鼠疫耶尔森菌耐药质粒时也未发现携带耐链霉素质粒的现象，以上两项研究中均包括此次实验中发现的这株耐链霉素鼠疫耶尔森菌，但检测方法只是针对外源耐药质粒的检测，故未在检测菌株中发现有获得性耐药质粒的菌株。而在本次研究中通过表型特征的测定却发现了耐链霉素鼠疫耶尔森菌株，说明随着抗菌药物的广泛使用及全球化推进，鼠疫耶尔森菌耐药性的产生是必然趋势，且不能仅通过一种方法就能筛选出耐药菌株，而是应该通过多种多次的检测方法和实验操作来进一步确认。1995年法国巴斯德研究所科学家Galimand等4在马达加斯加分离了1株耐链霉素鼠疫耶尔森菌 No.16/95，随后的研究证实，对链霉素具有强耐受性的鼠疫耶尔森菌No.16/95中存在着质粒PIP1203，该质粒长40 kb，可在鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌中高频传递，在鼠疫耶尔森菌、大肠埃希菌中以较低的频率传递，其质粒上携带有氨基糖甙类酰基转移酶基因，能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化，导致了耐药性的出现12。西藏自治区属青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，是全国受鼠疫威胁最严重的省(自治区)之一。1966年首次证实鼠疫存在以来，共发生人间鼠疫22起，发病120人，死亡75人，平均死亡率为62.5%13。西藏自治区鼠疫自然疫源面积广，动物间鼠疫流行猛烈，本研究结果发现的链霉素耐药菌株为人间疫情人西藏自治区鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度的测定及研究 杨晓艳等 1 2 3 4 5 616平皿中链霉素浓度依次为1、2、4、8、2048和4096 g/mL；上六排及左下两排点种的为55株被测鼠疫耶尔森菌，其中第一排第一株为耐链霉素菌株，右下为质控菌株ATCC25922图1 被试菌株在含链霉素不同浓度平皿中的培养结果Fig.1 Culture results of tested strains in different concentrations of streptomycin sulfate plates.S1.尸体所分离，耐药性极强(MIC=4096 g/mL)，这对我国鼠疫的临床治疗提出了新的研究课题。因此，将抗菌药物对鼠疫耶尔森菌最低抑菌浓度测定方法，纳入到鼠疫耶尔森菌常规的表型研究中，了解西藏自治区乃至中国各鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌对抗菌药物的耐药情况，掌握常用抗菌药物对鼠疫耶尔森菌的MIC势在必行。参 考 文 献1 西绕若登,次仁顿珠.西藏鼠疫流行特征及控制措施的研究J.地方病通报,1995,10(3):20-25.2 西绕若登,李景中,洛桑群增,等.西藏鼠疫流行现状与青藏铁路沿线鼠疫预防控制对策J.中国地方病防治杂志,2008,23(3):198-200.3 杨晓艳,辛有全,魏柏青,等.19992008年西藏藏南地区新增疫源县鼠疫菌病原学分析及流行病学意义J.中华地方病学杂志,2015,34(4):37-39.4 Galimand M,Guiyoule A,Gerbaud G,et al.Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferable-plasmidJ.N Engl J Med,1997,337(10):677-680.5 Guiyoule A,Gerbaud G,Buchrieser C,et al.Transferable plasmid-mediated resistance to streptomycin in a clinical isolate of Yersinia pestisJ.Emerg Infect Dis,2001,7(1):43-48.6 Cabanel N,Bouchier C,ajerison M,et al.Plasmid-mediated doxycycline resistance in a Yersinia pestis strain isolated from a ratJ.Int J Antimicrob Agents,2018,51(2):249-254.7 何建,杨晓艳,辛有全,等.鼠疫耶森菌最低抑菌浓度测定方法的建立与应用J.中华地方病学杂志,2020,39(11):842-846.8 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)(2016):Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Twenty-sixth informational supplement.CLSI document M100-S26.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute.9 张贵,张贵军,刘振才.抗生素治疗鼠疫的现状及进展J.中国地方病学杂志,2006,25(6):729-730.10 代瑞霞,何建,杨晓艳,等.我国鼠疫菌耐药及耐消毒剂相关基因研究J.中华地方病学杂志,2021,40(1):66-70.11 何建,杨晓艳,李胜,等.西藏自治区鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌耐药及耐消毒剂基因的研究J.中国媒介生物学及控制杂志,2018,29(1):61-63.12 Welch T J,Fricke W F,McDermott P F,et al.Multiple antimicrobial resistance in plague:An emerging public health riskJ.PLoS One,2007,2(3):e309.13 麻占军,李景中,扎西.西藏自治区鼠疫流行特征及防控措施J.中国地方病防治杂志,2019,34(5):550.中国抗生素杂志2023年3月第48卷第3期