莴笋感染番茄斑萎病毒（TS.毒粒子分布与亚细胞病变特征_王田田.pdf

莴笋是西藏昌都市露地栽培的主要蔬菜种类之一，近年来斑萎病发生普遍，发病率达到了 以上，引起严重的经济损失，前期研究表明发病植株受到番茄斑萎病毒（）侵染。为明确该区域莴笋感染 不同时期病毒粒体分布与亚细胞病变的特征，为病毒病的精准诊断与绿色防控提供依据，本研究采集了西藏昌都市卡若区莴笋不同发病时期的样品，应用 基因序列设计引物，通过 扩增克隆与测序分析，根据 基因序列推导 蛋白氨基酸序列比对，明确采集样品受到 侵染。采集不同发病时期的样品进行负染色和超薄切片制样透射电子显微镜观察，发现早期感病叶片（症状为轻微褪绿）中病毒粒体相对含量较少，粒体分布于细胞质中，叶绿体噬锇颗粒明显增加，线粒体嵴膜部分降解，少部分细胞的液泡内有较多 粒体聚集于细胞质内的囊泡中；中期感病叶片（褪绿或黄化斑）中，病毒粒体相对含量较高，较多 粒体聚集于细胞质内质网池中，叶绿体膜系统降解，噬锇颗粒增加，线粒体增多；后期感病叶片（坏死斑）中，病毒粒体相对含量高，叶绿体、线粒体等细胞器降解，有大量 病毒粒体聚集于残存的细胞质内囊泡中。粒体相对含量和亚细胞病变程度与植株症状严重度呈正相关，发病早期和后期 粒体在细胞质内囊泡中的聚集为首次发现。上述结果为莴笋感染 的早期诊断和确诊提供了新的依据，可为高原地区 引起的莴笋病毒病的早期预防提供指导。关键词 莴笋；番茄斑萎病毒；病毒粒体分布；亚细胞病变中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：昌都市食药用菌及脱毒马铃薯等特色产业发展新品种新技术引进与示范项目（）作者简介：王田田（），女（汉族），河南襄城人，科研助理：通讯作者：张仲凯（），男（彝族），云南昌宁人，研究员：昌都市位于西藏东部，地处横断山脉和三江（金沙江、澜沧江、怒江）流域，属高原亚温带亚湿润气候，利于蔬菜的种植生产。莴笋是昌都市蔬菜露地栽培的主要种类，成为当地农民收入的重要来源之一。自 年发现莴笋斑萎病普遍发生以来有逐渐加剧的趋势，引起产量和品质的严重损失。莴笋（）属菊科（）莴苣属（）年生蔬菜，是适应范围广泛的蔬菜作物，从热带到温带地区都可露地栽培。自然条件下，侵染莴笋的病毒包括莴苣花叶病毒（，）、黄瓜花叶病毒（，）、番 茄 斑 萎 病 毒（，）等 余种，云南高原夏秋蔬菜产区的莴笋斑萎病主要由 侵染引起，北京莴苣类蔬菜生产中已报道由 侵染引起的病毒病害。本实验室前期（年采集样品）研究表明，昌都市露地栽培的莴笋病害主要是 侵染引起的斑萎病（另文报道）。属于布尼亚病毒目（）番茄斑萎 病 毒 科（）正 番 茄 斑 萎 病 毒 属（），是该科和属的代表种。是目前已知寄主范围和发生分布区域最广的植物病毒，侵染超过 科 种植物，在全球除南极洲和北极附近区域之外都有报道，也是我国多种蔬菜的重要病毒病原，至 年已在 个省（区、市）发生为害。侵染寄主植物后，产生褪绿或黄化，部分寄主植物如番茄叶片和果实、烟草叶片有明显的环斑，番茄叶部叶脉明显发紫，侵染莴苣类蔬菜时早期症状为褪绿，中期黄化，后期表现为坏死斑。很多关于植物病毒侵染寄主植物的 电子显微学报 第 卷病毒粒体分布与亚细胞病变特征来自典型症状的样品制样观察，对于病原诊断鉴定有参考价值，如 侵染寄主植物后表现为典型症状的叶部组织细胞中，病毒粒体呈簇状聚集于细胞质内的内质网池，叶绿体基粒片层膜降解，线粒体增多等，但发病前期或早期及发病后期的病毒粒体分布与亚细胞病变的超微结构特征研究较少。植物病毒侵染具有潜伏期，即病毒复制增殖但无明显症状，而早期症状轻微容易忽略，出现典型症状时已处于发病中期，采用药剂防治没有效果，因此加强早期诊断，采取针对性强的预防措施对于病毒病的绿色防控具有重要意义。发病后期出现的坏死症状，是病毒突破寄主植物通过自噬途径的免疫机制而产生的过敏性应激反应，明确后期病毒粒体分布与亚细胞病变特征对于研究病毒致害与寄主植物抗病毒机制可提供重要依据。本研究在前期研究基础上，采集了昌都市卡若区莴笋斑萎病不同发病时期的样品，应用 专化性引物进行反转录多聚酶链式反应（）扩增克隆和测序分析，确定采集样品感染，应用负染色制样透射电子显微镜观察的结果表明采集样品中仅发现类似 的病毒粒体，表明采集样品仅受到 感染。进而应用超薄切片制样方法系统研究了 粒体在不同发病时期在莴笋叶部细胞中的分布与亚细胞病变特征，为西藏昌都市等高原区域莴笋斑萎病的早期诊断、监测预警与绿色防控提供依据。材料与方法 实验材料 年 月份在西藏自治区昌都市卡若区蔬菜种植基地采集了疑似感染 的早、中、晚不同发病时期的莴笋斑萎病植株，田间发病率达到以上，早期症状为叶部轻微褪绿，中期症状为叶部褪绿及坏死斑，后期症状为叶部黄化坏死斑、植株严 重 矮 化（图 ），编 号 分 别 为、。采集未感染病毒的莴笋植株作为健康阴性对照。检测 根据已报道的 基因序列设计引物，：，：，扩增目的片段大小为。采用（，美国）提取莴笋斑萎病早、中、后期样品总，采用反转录试剂盒 （康为，中国）制备。反应体系为 聚合酶 、上游特异引物（）、下游特异引物（）、模板 、，总体系为 。其中 的扩增体系为：；，个循环；最后 ，扩增的产物经 琼脂糖凝胶电泳进行检测。对电泳检测的 产物进行纯化回收，并连接在 克隆载体（），之后热激转化在 大肠杆菌（）。在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上进行涂板、划线、筛选后，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。根据序列比对结果确定是否为 侵染。负染色和超薄切片样品制备及透射电子显微镜观察 负染色制样 阴性对照取叶部组织，感病样品取病健交界处的叶部组织（根据以往经验该部分组织细胞中病毒粒体分布较完整），戊二醛固定液滴加于样品并将样品切丝渗透出汁液，吸取 汁液滴于封口膜上，每个样品用 个铜网作为 次重复，用镊子夹取 目铜网正面朝下吸附汁液 ，再用磷钨酸（）染色剂染色 ，用滤纸吸掉多余的染液，烘烤灯下烘烤 或自然干燥后置于 透射电子显微镜（）下观察，每个铜网观察 个以上有效视野，将典型病毒粒体或类似病毒粒体拍照和统计分析。超薄切片制样 用锋利的双面刀片快速准确地切取莴笋病样的病健交界处 的组织块，阴性对照样品取叶部组织，每个样品设 个组织块重复，浸入 戊二醛固定液，抽真空使组织沉入底部固定 ；用 磷酸缓冲液（）漂洗 次后转入 的 固定液中固定 ，再经过磷酸缓冲液漂洗 次，每次 ，依次进行乙醇梯度脱水 后，丙酮置换乙醇脱水 ，然后用 低粘度包埋剂渗透和包埋，于 下聚合 。使用超薄切片机（）聚合后的样品块进行半薄定位，并切为 的超薄薄片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，置于 透射电子显微镜（）下观察，记录病毒粒体分布与亚细胞病变特征，对典型特征进行拍照和比较分析。第 期王田田等：莴笋感染番茄斑萎病毒（）病毒粒子分布与亚细胞病变特征 图 昌都市卡若区莴笋斑萎病。田间发病症状；发病早期，中期和后期的植株。，；，图 莴笋感染 不同发病时期叶片病样负染色制样观察。，早期发病样品及其病毒分离物；，中期发病样品及其病毒分离物；，后期发病样品及其病毒分离物。，：，；，；，电子显微学报 第 卷 结果与分析 昌都市卡若区莴笋样品的 检测结果 对昌都市卡若区采集的莴笋斑萎病早期、中期和后期样品的 基因专化性引物进行 扩增、克隆和测序，得到的序列在 中进行比对后发现 个样品与已报道的 云南烟草 分 离 株 具 有 最 高 相 似 性，达 到，与 年度检测结果相符。根据国际病毒分类委员会（）关于 的种分类标准（发布），确定卡若区采集莴笋斑萎病 个时期样品都感染了。图 健康莴笋叶片细胞的超微结构。充满亚细胞结构的较为完整的细胞，；高尔基体（）平行膜，过氧化物酶体（），线粒体嵴膜和叶绿体基粒片层膜结构，：；：；：；，叶绿体中的噬锇颗粒及细胞质中的内质网，。：细胞核；：叶绿体；：线粒体；：囊泡；：高尔基体；：细胞壁；：液泡；：过氧化物酶体；：噬锇颗粒；：内质网 ；（），（），；，：；：；：；：；：；：；：；：；：；：早期、中期、后期侵染莴笋样品的负染色电镜观察结果 负染色制样观察发现，阴性对照样品中未发现病毒粒体，早期发病的莴笋病组织（图）浸出汁液中出现含量较少的球状病毒粒体，直径约 （图）；中期发病叶部组织（图）中出现装配较完整的且形成聚集体的球状病毒粒体，直径约（图）；后期发病叶部组织中（图）的病毒粒体相对含量较高，大量病毒粒体聚集病毒粒体直径为 （图）。从早期、中期到后期病毒粒体相对含量呈现由少到多的变化。在采集样品中仅发现类似 的病毒粒体，发病后期粒体大小的差异可能由于装配时期或投影角度不同引起，结合 检测结果，确定该批次样品仅感染。健康莴笋叶部组织的超微结构特征 通过超薄切片制样观察，健康阴性对照样品中，细胞核、叶绿体、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体和内质网等亚细胞结构完整，细胞核双层核膜、叶绿体基粒片层膜、线粒体嵴膜和高尔基体平行膜清晰，少部分叶绿体含有直径 的噬锇颗粒，细胞质内均未发现病毒粒体分布（图）。第 期王田田等：莴笋感染番茄斑萎病毒（）病毒粒子分布与亚细胞病变特征 莴笋感染 发病早期的病毒粒体分布与亚细胞病变 感染早期莴笋叶部组织，少部分细胞的细胞质内囊泡中聚集大量的球状病毒粒体（直径 ），细胞核结构完整，叶绿体基粒片层和基粒间膜降解，出现空泡，噬锇颗粒明显增多，线粒体嵴膜大部分降解，细胞质中分布有纤维状内含体（图，）；大部分细胞中以少量病毒粒体（个）分布在细胞质内，叶绿体片层结构疏松且膨大变形，出现空泡，噬锇颗粒明显增多，线粒体嵴膜部分降解，细胞质内出现较多不规则囊泡（图，）。图 莴笋感染 早期叶片细胞的超微结构。，较多 粒体聚集于细胞质内的囊泡中，叶绿体、线粒体出现膜降解，图 为图 虚线框中的放大；，：；，少量 粒体分布在细胞质中（箭头），：。：病毒粒体；：细胞壁；：叶绿体；：噬锇颗粒；：线粒体；：细胞核；：液泡；：囊泡；：纤维状内含体；：病毒原质 ，；，（）：；：；：；：；：；：；：；：；：；：莴笋感染 发病中期的病毒粒体分布与亚细胞病变 病毒粒体相对含量高于感染早期莴笋组织细胞中的病毒含量，病毒粒体呈簇状聚集于细胞质的内质网池，大部分细胞器降解，叶绿体外膜消失，类囊体结构瓦解，分布较多噬锇颗粒；大部分线粒体嵴膜消失，出现空泡化现象；中央大液泡中散 布大量的小囊泡（图，）。部分细胞中有较多病毒粒体聚集于靠近细胞壁的细胞质内质网池中，具有典型的 在寄主细胞中的分布特征（图，）。也有部分细胞中，粒体呈簇状聚集在细胞质内的囊泡中，细胞质内分布较多小囊泡，病毒粒体聚集体周围出现大量的过氧化物酶体，叶绿体基粒片层和线粒体嵴膜大部分降解（图，）。电子显微学报 第 卷图 莴笋感染 中期叶片细胞的超微结构。，较多 粒体分布于细胞质内质网池（箭头），叶绿体和线粒体膜结构降解，图 为图 虚线框中的放大，大量小囊 泡分布在液泡中（箭头），：，：；，粒体呈簇状聚集分布在细胞质的内质网池中，：；，大量 粒体（箭头）聚集于细胞质的囊泡内，：。：线粒体；：病毒粒体；：叶绿体；：噬锇颗粒；：囊泡；：液泡；：细胞质；：细胞壁；：脂质体；：过氧化物酶体 ，（），（）；，（）；，（）：；：；：；：；：；：；：；：；：；：莴笋感染 发病后期的病毒粒体分布与亚细胞病变 粒体相对含量较中期侵染莴笋叶片的病毒含量明显增多，大部分细胞器降解，大量的 粒体聚集分布在囊泡中，线粒体和叶绿体较中期细胞中数量显著减少，叶绿体外膜消失，类囊体（基粒片层）结构降解，线粒体空泡化现象更为严重，细胞质内囊泡中较多自噬小体，残存的叶绿体中噬锇颗粒明显增多且直径较大，约 （图，），粒体聚集的囊泡周围细胞质中出现较多电子密度高的病毒原质（，）（图），部分细胞的细胞质内囊泡中有大量的 粒体（）聚集，部分囊泡中出现大量的自噬体小泡（图）。上述结果表明，莴笋感染 不同发病时期病毒粒体的相对含量及其在寄主细胞中的分布和亚细胞病变特征具有明显的差异，发病中期与已报道的 侵染其它寄主植物的病毒粒体分布与聚集特征相同，即在细胞质的内质网池中形成聚集体，发病早期与后期 粒体在细胞质内囊泡中的聚集方式之前未见报道。负染色与超薄切片观察结果表明，从发病早、中和后期，粒体相对含量呈现逐渐增多的趋势，亚细胞病变程度有轻到重，即病毒粒体相对含量与亚细胞病变程度与植株症状严重度呈正相关，中后期自噬体囊泡明显增多。第 期王田田等：莴笋感染番茄斑萎病毒（）病毒粒子分布与亚细胞病变特征 图 莴笋感染 后期叶片细胞的超微结构。，坏死细胞中残存的原生质体，图 为图 虚线框中的放大，：，；，细胞质内分布的病毒原质、囊泡中的 粒体和自噬体小泡，：。：病毒粒体；：细胞壁；：叶绿体；：线粒体；：小囊泡；：液泡；：囊泡；：噬锇颗粒；：过氧化物酶体；：病毒原质 ，；，：；：；：；：；：；：；：；：；：；：讨论 关于 粒体在寄主细胞中不同时期的分布，应用本生烟（）原生质体培养接种 的侵染实验表明，在早期细胞质的高尔基体平行膜附近出现双层膜包被的病毒粒体（，），中后期大量 粒体聚集于内质网池内，推测由 经过膜融合进入内质网膜内。很多研究以本生烟等模式植物做接种实验，田间采集感染 的番茄和辣椒等茄科作物的取样时期多为发病中期，粒体在寄主细胞内的分布特征为多个粒体聚集于细胞质的内质网池中。亚细胞病变方面，发现侵染早期和中期高尔基体显著增多，内质网出现多种膜形态的变化，对其它细胞器的变化研究较少。本研究发现莴笋感染 的早期发病植株叶部细胞中已有病毒粒体聚集体分布于细胞质内或细胞质的囊泡中，未见明显的 结构，也未见高尔基体增多的现象，可能因寄主植物的不同（莴笋属于菊科植物）引起，本实验室之前对莴笋同属的生菜感染 中期样品的研究中也发现与本研究相似的病毒粒体分布与亚细胞病变特征。植物病毒粒体在寄主植物不同发病时期的分布在一定程度上代表了病毒粒体在细胞内、细胞间和维管束长距离运动引起系统侵染为害的线索，许多研究集中于核酸和蛋白复合体在细胞内和细胞间的运动，发现 核糖核蛋白复合体（）沿内质网膜系统在细胞内和细胞间运动，关于病毒粒 电子显微学报 第 卷体在细胞内的运动研究较少。本实验室之前的研究发现，粒体由囊泡包被在烟草细胞的内质网膜系统进行细胞内运动，同时，在导管细胞中发现囊泡包被的病毒粒体聚集体通过纹孔膜降解实现长距离运动形成系统侵染，粒体是否通过胞间连丝或其它渠道（如跨细胞的管状结构）进行细胞间运动尚未明确。本研究发现的叶绿体、线粒体在不同发病阶段病变程度由轻到重，中期和后 期 细 胞 质 和 液 泡 中 小 囊 泡 明 显 增 多，与 其它种类侵染寄主引起的亚细胞病变特征相似，。目前已在全球不同区域和多种作物上快速传播，引起农作物产量和质量的严重损失，由于 侵染引起的病害防治中化学农药的过量施用还导致食品安全风险加大。自然条件下 主要通过蓟马传播，年，已发现感染 的辣椒种子可传播病毒，目前通过国家脱贫攻坚援藏项目，在西藏高原地区大量发展温室和大棚蔬菜，普遍侵染各类蔬菜作物，具有病毒病爆发流行的风险，必须加强早期检测和监测预警，及时开展预防为主的绿色防控。应用抗体或核酸检测具有快速经济的优势，但间接检测方法难以避免假阳性或假阴性以及环境样品携带其它病毒的干扰，难以确诊。通过超薄切片制样观察，在寄主植物细胞内发现病毒是准确诊断的重要方法，本研究发现的早期和后期病毒粒体聚集于细胞质内囊泡的特征，可作为莴笋感染 的诊断依据。参考文献：牛继平西藏昌都市蔬菜产业发展建议中国蔬菜，（）：牛继平西藏昌都市蔬菜产业现状与对策 安徽农业科学，（）：张仲凯，马秀英，吴阔，等陆良莴苣类蔬菜斑萎病的侵染循环及其发生流行特点西南农业学报，（）：，：，（）：郑宽瑜，吴阔，董家红，等 番茄斑萎病毒对云南莴苣类蔬菜的侵染危害 植物保护，（）：陈东亮，李明远，李雪梅，等 北京地区莴苣中番茄斑萎病毒的鉴定 中国蔬菜，（）：，：，：，：，：裴卫华，曹玉昕，王田田，等 番茄感染 叶片组织超薄切片的背散射电子大尺度成像和亚细胞精细定位 电子显微学报，（）：张仲凯，郑宽瑜，王田田，等植物病毒粒体在寄主细胞中的原位聚集特征电子显微学报，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，（西南林业大学学报），（）：，第 期王田田等：莴笋感染番茄斑萎病毒（）病毒粒子分布与亚细胞病变特征，：，：，（，；，；，）（），（），（），；（），；（），（），；