LC-MS原理简介PPT.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,什么是质谱仪,?,质谱仪是按照离子的质荷比,(m/z),不同,来分离不同分子量的分子,.,测定分子量进行成分和结构分析,.,离子的生成方式有失去或捕获电荷,(,如,:,电子发射,质子化或去质子化,),1,主要组成部分,:,1.,进样部分,2.,离子源,3.,质量过滤器,(,分析器,),4.,离子检测器,2,离子源,质量过滤,/,分析器,检测器,进样部分,样品板,LC,或,GC,EI,源,FAB,源,MALDI,源,ESI,源,Quadruopole,Ion trap,Time-of-flight,电子倍增器,闪烁计数器,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,3,进样部分,要求：,大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。,方式：,进样板进样,进样头进样,毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）,4,C:MALDI,激光解吸附离子源,Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MALDI,源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与,FBI,有相似之处。,1,、使用基质，但基质为固体。,2,、,MALDI,用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。,对基质的要求是能吸收,337nm,紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,5,6,7,常用基质,1,、,氰基,4,羟基肉桂酸,CCA,多肽,2,、,3,5,二甲氧基,4,羟基肉桂酸,SA,蛋白,3,、龙胆酸（,2,5,二羟基苯甲酸,DHB,聚合物,4,、吡啶甲酸,PA,5,、,3,羟基吡啶甲酸,3HPA,MALDI,源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析,8,常用基质结构,DHB,SA,CCA,9,MALDI,的优缺点,优点,1,、质量数可达,300,000Da,。,2,、,attomole,至,femtomole,级灵敏度。,3,、软电离方式，无或极少碎片离子。,4,、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。,5,、适于分析复杂混合物。,缺点,1,、分辨率低。,2,、,1000,Da,以下基质峰干扰。,3,、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。,4,、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。,5,、不能分析非共价键相互作用。,6,、定量时需要内校准。,7,、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。,8,、对各种赋形剂的容忍度低（如,含磷酸缓冲液，大于,150mM,的盐等。,10,Sample submission,In solution,as concentrated as possible,volume 10-20 ul Minimum Concentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes,The sample should NOT contain any,Azide SDSBrij 35 Tris baseCHAPS Triton X-100,Treduced Triton X-100DMSO TweenDMF ZwittergentGlycerol any other detergentPhosphate buffersSalts and buffers 100 mM,The following components are ACCEPTABLE,Acetic or formic acidAcetonitrile,ethanolGuanidine/HCl 4MHexafluoroisopropanol up to 40%MethanolSodium chloride 10 mMUrea 1M,11,D:ESI,离子源,Electrospray Ionization,4000v,强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。,一般分析物分子量,2000Da,带多电荷,12,13,NANO-ESI,喷雾照片,14,ESI,特点,1,、,ESI,产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带,10,个以上电荷，使得,m/z,大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。,2,、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。,15,电荷数和质量数的计算,已知,m,j,=,(,m+n,j,),/,n,j,m,k,=(m+n,k,),/,n,k,n,j,=n,k,+1,推算出,n,j,=(m,k,-1),/,(m,k,-,m,j,),n,k,=(m,j,-1),/,(m,k,-m,j,),m=m,j,n,j,-n,j,=m,k,n,k,-n,k,m/z,相对丰度,m,j,m,k,16,ESI,优缺点,优点,1,、质量数可达,70,，,000,Da,2,、灵敏度高达,femtomole,级。,3,、软电离，可观察生物分子非共价反应。,4,、易于和,LC,串联，直接分析流速为,1ml/min,的,LC,洗脱液。,5,、没有基质干扰。,6,、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。,7,、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。,8,、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。,9,、特别适于测多肽的修饰。,10,、样品前处理简单可直接分析,RP-HPLC,脱盐处理的溶液。,缺点,1,、耐盐能力低。,2,、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。,3,、样品需先气化，混合物不适用。,4,、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。,5,、定量时需内校准。,17,质量分析器（过滤器）,第一节：质量分析器的主要指标,A,、质量范围（,/,）,所能测量的质荷比范围,M+nH,B,、灵敏度,一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。,n,18,D,、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力,分辨率,R=M/,a,=M,/(M,M,)b,a,公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比,b,公式定义为相邻的相交,10,的两个峰,M M,按,a,式计算的分辨率约为,b,式计算的两倍,。,19,不同分辨率谱图效果,20,离子阱质量分析器,三维的四极杆，,RF,加在环形电极上。,21,质量分析器的串联,目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析,Collision-induced dissociation(CID),Ion source ion daughter ion,granddaughter ion,选择离子,M,S,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,22,空间串联质谱仪,A,、串联四极杆（三级四极杆）,triple-Quadrupole Analyzer,Q,为过滤单元,Q,为碰撞单元,Q,为分析单元,23,24,时间串联,质谱仪,A,、离子阱质谱仪：,25,几种串联,质谱优缺点对比,优点,缺点,三级四极杆,质量精度高，分辨率好,碰撞能量低，碎片不完全。,RTOF,价廉,前体离子选择困难,子离子分辨率低。,FT,MS,质量精度最高，,子离子分辨率好，,非常适合多级,质谱,低能量碰撞，需超导磁体，,价高。,离子阱,相对价廉，,质量精度高，分辨率好，,适合多级,质谱,低能量碰撞,Q,TOF,质量精度高，分辨率好，前体离子选择性好，,E,SI,、,MA,L,D,I,均可接。,需高真空，,价高。,26,27,第五章、质谱在生物学中的应用,一、肽质量指纹谱鉴定蛋白。,二、串联质谱鉴定蛋白技术,28,三、肽序列标签技术,通过测部分氨基酸序列，结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量进行数据库检索，称为肽序列标签技术。,29,四、,O,标记从头测序技术,蛋白酶解时，酶解液中,H,2,O,和,H,2,O,各占,50,，,酶解后肽段的羧基端上的羟基氧,O/O,丰度比,1,：,1,，使,Y,型离子系列的,M+2/M,同位素峰的丰度高于正常未标记,O,的离子的同位素丰度比。,18,18,16,18,16,18,30,五、磷酸化蛋白质的鉴定,A,：,MA,结合磷酸酶水解,磷酸化蛋白,MS,蛋白酶水解,MS,磷酸酶脱,HPO,3,MS,通过比较几级质谱图，比较质量数少,80,Da,或,80,倍数的肽段。,31,B,、串联质,谱进行母离子、中性丢失 扫描，分析含,H,PO,3,的,肽段产生的特征离子，直接从混合肽段中找出磷酸化肽段。,32,C,、,PRD-,MA,LDI-,M,S,用源后衰变技术寻找质量数少,80Da,或,98Da,的,肽段来判断磷酸肽。,33,D,、用,IMAC,技术分离,/,富集磷酸,肽对比前后质谱变化寻找磷酸肽。,IMAC,immobilized metal affinity,固相金属亲和色谱。,IMAC,对磷酸肽有高选择结合能力，,富集后用高,P,H,或磷酸盐洗脱后测,质谱。,34,E,、磷酸化位点的确定,找到,磷酸,肽后，串联质谱子离子扫描模式对,磷酸,肽进行序列分析。,35,F,、磷酸化定量分析,1,、,N,稳定同位素标记法：,N,培养基,14,15,N,培养基,14,36,2,、同位素亲和标记法,细胞池,1,细胞池,2,混合,消除氘,消除氢,亲和纯化,酶解,MS,磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生,消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，,亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子，再接上一个亲和标签（如生物素,biotin,），混合,酶解，提取含,biotin,的肽段进行,MS,检测。,37,六、糖基化蛋白的鉴定,A,、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键，将反应前后的质,谱图比较，可知糖,链的平均质量。,38,B,、,糖基化位点的确定,先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段，获得其肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶切除糖链，其肽质量指纹谱将发生变化，含糖肽段发生丢失位移，通过网上数据库检索其序列，找到位点。,39,C,、用凝集素直接提取含糖,肽段，再结合质谱技术分析,凝集素对含糖,肽段有专一亲和性,40,七、质谱在蛋白质组学中的应用,A,、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍,B,、同位素亲和标签技术,ICAT,专一与,Cys,共价结合,41,优缺点,优点,1,、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。,2,、烷化反应在盐、去垢剂,/,稳定剂（如,SDS,、尿素盐酸胍等）存在下都可进行。,3,、只分析含,Cys,残基的肽段，降低分析复杂性。,缺点,ICAT,本身分子量较大（,500,Da,左右）增加数据检索复杂性。,无法分析不含,Cys,的蛋白。,42,2DLC-MS,的基本原理,43,Why 2D LC/MS?,可鉴定极端具有,pI,、疏水性、分子量的蛋白质,适合膜蛋白,重复性好,容易自动化,上样量大,高灵敏度（溶液酶切）,可根据样品灵活配置（但最后一维一般为,RP,）,44,Then why,SCX,/RP/MS?,SCX,和,RP,的分离原理是互补的,SCX,按荷电情况，,PR,按疏水性,流动相是兼容的,pH,3,，,ACN/water/salt,SCX,流动相中的盐可以在,RP,时有效去除,Tryptic peptides,在,SCX,柱上可以有效保留,Tryptic peptides,在,SCX,条件下是稳定的,45,Separation power,Peak capacities,2DE,500-10,000 protein spots,Affinity Chromatography,2,Ion exchange Chromatography,10protein level,Gelfiltration,10,Reversed Phase Chromatography,50,Ion Exchange Chromatography,25,Reversed Phase Chromatography,100peptide level,2DLC(IEX/RPC),2,500,Linear IT MS,n,18,000 mph*,*,measurements per hour,46,MS/MS,MS,Gel,Gel spot,Proteolytic,peptides,Mixture,of Proteins,Digestion,Proteolytic,peptides,Digestion,LC,Protein Identification Workflows,Peak Finding,Peak list,Search of a Sequence Collection,Identified and Proteins,Protein Candidates,Significance Testing,Protein Function?,Sequence Similarity Search,47,RPC,IEX,RPC trap,RPC trap,on-line elution by salt plugs to trap column,IEX,off-line gradient elution,with“classical”fraction collection,RPC,2D LC,的三种配置形式,IEX,RPC,in-line MudPIT,48,on-line 2D-LC,优点,全自动,样品体积可根据后续,RPC,调整,在线脱盐、浓缩,自由选择缓冲盐,缺点,SCX,峰容量有限,ACN,浓度在,IEX,和,RPC,得一致,两相分离都没能在最佳状态下进行,RPC,IEX,RPC trap,RPC trap,49,off-line SCX with fraction collection,优点,两维分离都有可能在最佳状态下进行，得到最好分辨率和峰容量,可自由选择缓冲体系,样品体积可根据后续,RPC,调整,速度快（只需一个,SCX,操作）,SCX,馏份可留待以后分析,缺点,自动化程度低,IEX,Gradient elution,with“classical”fraction collection,RPC,50,The secret behind sensitivity,Reducing column dimensions,75 m I.D.columns and 200 nl/min are the standard today,scale,column I.D.,column volume,typical flow rate,gain in,m,(100 mm length),l,l/min,sensitivity,analytical,4.600,1.700,1.000,1,narrow,2.100,350,200,5,micro,1.000,80,40,21,capillary,300,7,4,237,nano,75,0.5,0.2,3.322,75 m I.D.columns and 200 nl/min are the standard today,51,Tandem MS,52,Data dependent MS/MS,基本原则,先做一次全扫描（,full MS),，记录个丰度最高的离子,然后依次对这,X,个离子进行,CID,做,MS/MS(full MS2),然后再做全扫描,下一个,data dependent MS/MS,开始,Dynamic exclusion,某个离子在做了一定次数（比如,2,次）的,MS/MS,后，将在一定时间内（比如,3min,）不再作为侯选离子。,53,+,多肽的裂解,54,碎片离子的命名,55,Residue name(A-Z)monoisotopic massaverage mass,A71.03711 71.0788,B114.53493114.59625,C103.00919103.1388,D115.02694115.0886,E129.04259129.1155,F147.06841147.1766,G57.02146 57.0520,H137.05891137.1412,I113.08406113.1595,J0.00.0,K128.09496128.1742,L113.08406113.1595,M131.04049131.1925,N114.04293114.1039,O0.00.0,P97.05276 97.1167,Q128.05858128.1308,R156.10111156.1876,S87.0320387.0782,T101.04768101.1051,U150.95364150.034,V99.06841 99.1326,W186.07931186.2133,X111.0111.0,Y163.06333163.1760,Z128.55059128.62315,氨基酸残基质量,56,CID,条件下,tryptic peptides,裂解规律,mobile proton model,在低能,CID,条件下，,tryptic peptides,主要产生以,y,离子和,b,离子为主的碎片离子,此外还经常可以看到,y,离子、,b,离子中性丢失,NH3,或,H2O,的峰,脯氨酸（,P,）残基,N-,端侧的肽键特别脆弱，因此含,P,的多肽,MS/MS,图谱一般会有一个脯氨酸,N-,端侧的肽键断裂产生的特别强,y,离子。而脯氨酸（,P,）残基,C-,端侧的肽键一般不断，因此相应的碎片离子基本不出现,如果肽段中,R,数小于其所带质子（,H+,），肽段将以,charge directed,方式裂解，碎片离子丰富；反之，则以,charge remote,方式裂解，碎片离子较少。在,charge remote,方式下,D,、,E,等酸性氨基酸残基,C-,端肽键易断,糖肽上的寡糖基、磷酸肽上的磷酸基在,CID,条件下更容易脱落，因此该类多肽的,MS/MS,图谱的,base peak,一般为母离子脱去修饰基团后产生的,57,ESI-MS/MS vs MALDI-MS/MS,why LTQ/LCQ type instrument so popular in proteomics?,58,59,60,61,