解淀粉芽孢杆菌BW_13培养基和培养条件优化_章小洪.pdf

第 卷第期 年月浙 江 工 业 大 学 学 报 收稿日期：作者简介：章小洪（），男，浙江兰溪人，硕士研究生，主要从事应用微生物学抗真菌药物的研究，：通信作者：崔志峰教授，：解淀粉芽孢杆菌 培养基和培养条件优化章小洪，汪琨，朱廷恒，崔志峰（浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 ）摘要：为了提高解淀粉芽孢杆菌 抗真菌活性物质的产量，本实验首先用单因素研究不同碳源，氮源和微量元素对 产生抗真菌活性物质的影响，并使用均匀设计法对培养基进行优化 结果表明：玉米粉和低浓度的 对 产生抗真菌活性物质的促进效果明显 最佳培养基配方和发酵条件为：玉米粉，蛋白胨，氯化锰，初始发酵 ，装液量 ，接种量为，培养温度，摇床转速 ，培养时间 优化后 发酵液抑菌圈提高到 ，比优化前提高了 关键词：解淀粉芽孢杆菌；抗真菌活性物质；培养基优化；均匀设计中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：，：，：；植物致病真菌对农业生产的危害极大，但目前控制植物真菌病害仍主要采用化学农药 随着人们对农作物产品质量和安全性的日益重视，生物防治正在逐步取代化学农药 在过去的几十年中，寻找新的微生物来源的抗真菌物质替代传统化学合成抗真菌剂是农业生防研究的重点芽孢杆菌是重要的农业生防菌，芽孢杆菌产生的抗真菌物质主要包括脂肽类和蛋白类，如脂肽类抗生素包括 ，和 具有广谱抗真菌活性和良好的稳定性，已经成为研究的热点 蛋白类抗真菌物质包括几丁质酶，葡聚糖酶等，它们主要作用于真菌细胞壁另外，近来的研究还发现芽孢杆菌产生的挥发性 小 分 子 具 有 很 强 的 抗 真 菌 的 作 用，等发现芽孢杆菌产生的挥发性壬醛和甲基丁醇具有抗真菌作用本实验室从土壤中分离得到一株抗真菌作用较强的解淀粉芽孢杆菌 ，其发酵液对酿酒酵母 菌 株 和 灰 葡 萄 孢 菌株具有明显抑制作用，部分纯化的抗真菌活性物质对本实验室构建的几丁质合酶和基因敲除的酿酒酵母菌株 具有特异性抑制作用，并有良好的稳定性，具有开发的潜力 本实验通过均匀设计等方法对 菌株产生抗真菌活性物质的培养条件进行了初步优化材料与方法 材料 供试菌株解淀粉芽孢杆菌 ，本实验室分离保存；酿酒酵母 ，日本广岛大学宫川都吉教授惠赠 培养基 培 养 基：胰 蛋 白 胨，酵 母 提 取 物，氯化钠，；培养基：酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，；含琼脂的 培养基：酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，琼脂，；初始发酵培养基：可溶性淀粉，蛋白胨，培养基均在 灭菌 方法 种子液的制备和初始发酵条件用牙签挑取新鲜 单菌落至 培养液，摇床培养 ，作为种子液 取 种子液（体积分数为）至 初始发酵培养基的摇瓶（摇瓶体积 ）中，置于 ，摇床中培养，得到发酵产物 培养基的单因素试验碳源的筛选：使用 葡萄糖、蔗糖、玉米粉、甘露醇、甘油分别取代初始培养基中的可溶性淀粉，发酵 测定发酵液抑菌圈 每组个平行 以初始发酵培养基作为对照氮源的筛选：使用的牛肉浸膏、鱼粉蛋白胨、尿素、硝酸铵分别取代初始培养基中的蛋白胨，发酵 测定发酵液抑菌圈 每组个平行 以初始发酵培养基作为对照无机离子对抗生素产量的影响：分别在初始发酵培养基中加入 和 的硫酸亚铁、氯化锰、硫酸铜、硫酸镁、硫酸锌、氯化锂，发酵 测定发酵液抑菌圈，每组个平行，以初始发酵培养基作为对照 均匀设计试验对单因素实验筛选出的三种主要的培养基成分（玉米粉、蛋白胨、氯化锰）进行设计，考虑到预实验结果和碳氮源比例，选用三因素四水平（）均匀设计表，差异性为 ，设计表如表所示 其中为玉米粉（质量浓度为 ，平均分成个梯度），为蛋白胨（质量浓度为，平均分成个梯度），为氯化锰（质量浓度为 ，平均分成个梯度）表均匀设计表 实验号 培养条件的单因素试验对优化后培养基的培养条件包括初始发酵（，），发酵温度（，），摇瓶装液量（，），接种量（，）和发酵 时 间（，）分别进行单因素试验，通过测定发酵液抑菌圈直径比较并确定最佳发酵条件 发酵液抗真菌活性检测将发酵液离心，条件为 ，取上清进行过滤（滤膜）使用双层平板法检测抗真菌活性双层平板的下层为 ，上层为 含琼脂的 ，其中上层含 酿酒酵母 然后在 滤纸片上加入发酵液，再将滤纸片置于上层培养基上，培养箱培养，测定抑菌圈直径 数据处理使用 和 结果与分析 发酵培养基单因素试验结果 碳源的确定本实验中初始发酵培养基的碳源是淀粉，说明浙 江 工 业 大 学 学 报第 卷 能够有效利用淀粉，符合解淀粉芽孢杆菌的特性 由图（）可以看出：在玉米粉、葡萄糖和甘露醇中发酵产抗真菌活性物质的能力更强，并且发现甘露醇的作用显著，推测甘露醇可能作为抗真菌活性物质的前提物质相对其他碳源，玉米粉培养基中产生的抗真菌活性物质显著增加，这可能是因为玉米粉为复合碳源，含有少量氮源和其他生长因子，促进抗真菌活性物质的产生 同时考虑到发酵成本问题，玉米粉相对廉价易得，具有大批量发酵的潜力，所以选择玉米淀粉作为最佳碳源 氮源的确定由图（）可以看出：在无机氮源的培养基中产生的抗真菌活性物质产量很低，在蛋白胨、鱼粉和牛肉膏培养基中抗真菌活性物质产量相对较高，而且在蛋白胨培养基中产生的抗真菌活性物质高于鱼粉和牛肉膏，所以选取蛋白胨为最佳氮源 金属离子的确定由图（）可以看出：不同质量浓度的离子对 的影响比较大，硫酸铜和氯化锰对 具有显著的增效作用其中 抑制了 产 抗 真 菌 活 性 物 质 的 能 力，但 在 质量浓度下，产抗真菌活性物质的能力显著提高 这可能因为 在一定质量浓度下可以刺激芽孢的生成，并且芽孢杆菌产生的抗真菌活性物质可能与芽孢数量相关 李瑞芳等 研究表明：对 的次生代谢产物的活性有重要影响，这与本实验结果相一致氯化锰和硫酸锌的影响都极显著（），但硫酸锌与对照相比没有显著提高，所以选择 作为显著影响因子进行后续试验图不同培养基成分对 产生抗真菌活性物质的影响 （）均匀设计试验结果由于双层平板管碟法影响因素多，误差比较大，本实验使用响应面法无法得到很好的拟合结果，所以使用均匀设计法寻找最佳培养基 均匀设计试验结果见表使用 进行均匀设计最大值的估算，得到方程 ，拟合相关系数 ，方程不显著 最佳配方为：玉米 粉 ，蛋 白 胨 ，氯 化 锰 从方程拟合相关系数看：拟合结果具有一定的可信度，进一步做验证试验得到验证试验的第期章小洪，等：解淀粉芽孢杆菌 培养基和培养条件优化结果为 ，发酵液抑菌圈比初始发酵培养基提高 验证试验结果表明：方程在一定程度上拟合了 产抗真菌活性物质的产量 培养条件的单因子试验 最佳初始 和温度的确定由图（）得出：初始发酵培养基的 对产抗真菌活性物质（抑菌圈直径）的影响较大，在 时达到最大，说明 可能在弱酸性的条件下有利于抗真菌活性物质的产生 但当 降低到以下时抑菌圈急剧下降，通过菌体浓度（数据未给出）可以推测，菌体浓度在 以下时急剧下降，说明 过低影响菌体生长表均匀设计试验结果 试验号玉米粉（）蛋白胨（）氯化锰（）抑菌圈均值 验证组 图不同发酵条件对 产生抗真菌物质的影响 由图（）可以看出：温度达到 为最佳发酵温度，超过 的环境中发酵液的抑菌圈急剧下浙 江 工 业 大 学 学 报第 卷降，培养时只产生少量抗真菌活性物质 但 菌体浓度达到最大，说明 条件只适合菌体生长 这说明 能够在很宽的温度范围内生长，是其最佳生长温度，但不是产生抗真菌活性物质的最适温度 最佳装液量和最佳接种量的确定由图（，）可以看出：接种量时发酵液抑菌圈达到最大，继续增加接种量没有得到更好的效果 装液量的影响更为显著，发酵液的抑菌圈随装液量的增加而减小，但 和 装液量对抑菌圈的影响不大，考虑到发酵成本的问题，选取最佳装液量为 最佳培养时间的确定由图（）得出：产生的抗真菌活性物质在发酵初期显著增加，其中在 和 之间增加极显著，以后增加量不显著（），并且考虑到发酵成本的问题，确定发酵时间为 根据实验结果可以确定最佳培养基为玉米粉 ，蛋白胨，氯化锰 ，最佳培养条件为发酵液 ，装液量 ，接种量，培养温度，摇床转速 ，培养时间 以上述条件进行验证试验表明：优化后 产生的抗真菌活性物质的抑菌圈比初始发酵培养基对照组抑菌圈增加 ，发酵液的抑菌圈提高到 ，见图（）图优化前后 发酵液的抑菌圈比较 结论本实验首先使用单因素试验确定了玉米粉为 的最佳碳源，蛋白胨为最佳氮源，为影响最显著的离子 考虑到双层平板管碟法检测产生的误差比较大 的问题，进一步使用均匀设计法寻找最佳培养基 均匀设计试验中，拟合相关系数 ，拟合结果并不显著，但通过验证试验表明优化后发酵培养基抑菌圈比初始发酵培养基提高 进一步对发酵条件也进行优化后，发酵液抑菌圈提高到 ，比优化前提高了 本实验室同时也在对 产生的抗真菌物质进行分离纯化和作用机理研究，已发现其部分纯化的活性物质对本实验室构建的几丁质合酶和基因敲除 的 酿 酒 酵 母菌株 具有特异性抑制作用，推测可能具有抑制几丁质合酶 的作用 本实验研究使 抗真菌活性物质的发酵产量得到了明显的提高，对于该抗真菌活性物质的进一步分离纯化、结构鉴定和开发研究具有重要的促进作用参考文献：黄曦，许兰兰，黄荣韶，等枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展生物技术通报，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：钱英，汪琨，章小洪，等解淀粉芽孢杆菌 的抗真菌物质初步研究浙江工业大学学报，（）：，（）：，：，：李瑞芳，徐怡，田泱源，等金属离子对枯草芽孢杆菌 发酵液防治稻瘟病菌效果的影响河南工业大学学报：自然科学版，（）：李凡，朱志华，姜凤丽，等管碟法测定生物效价影响因素的探讨及改进中国兽药杂志，（）：（责任编辑：刘岩）第期章小洪，等：解淀粉芽孢杆菌 培养基和培养条件优化