修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫.pdf

修饰的 ORF5 基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA 疫苗的体液免疫江云波,方六荣,肖少波,牛传双,张辉,陈焕春*(华中农业大学 动物医学院,湖北 武汉 430070)摘要:为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5 基因 DNA 疫苗的免疫效力,将通用型辅助性 T 淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5 的中和表位和覆盖表位间,获得修饰后的ORF5 基因ORF5M。在此基础上,进一步构建了ORF5M 的真核表达质粒 pCI-52M。间接免疫荧光证实体外表达后,免疫 BALB/c 小鼠,检测免疫后的 ELISA 抗体和中和抗体,并与未经修饰的ORF5 基因真核表达质粒pCI-52 进行比较。结果表明,修饰后的DNA疫苗pCI-52M诱导的 ELISA 抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的 DNA 疫苗 pCI-52,是一种具有良好开发前景的 PRRS 新型疫苗。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF5 基因;PADRE表位;DNA疫苗中图分类号:S852.65;Q78文献标识码:A文章编号:1005-4545(2005)01-0001-03收稿日期:2003-09-21基金项目:武汉市青年科技晨光计划资助项目(20025001041)作者简介:江云波(1980-),男,硕士。*通讯作者猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的新传染病 1。免疫接种是预防和控制该病的主要措施,但现有的商品化疫苗(弱毒苗和灭活苗)均存在一定程度的缺陷。其中弱毒苗虽然免疫效果较好,但存在散毒和返强的危险性,并且返强的几率相当高 2;灭活苗与弱毒苗相比,虽然安全性较好,但产生的保护力不强,需要反复多次的免疫接种,而且效果不稳定,还经常导致免疫失败 3。可以说,缺少安全、有效的疫苗是目前预防和控制PRRS发生与流行甚至大暴发的主要障碍,迫切需要安全、有效、廉价的新型疫苗。由 ORF5 基因编码的糖基化囊膜蛋白 GP5,是 PRRSV的主要结构蛋白,参与体液免疫与细胞免疫,因此是发展新型疫苗的良好目标基因。Pirzaden 等 4用编码 GP5 的真核表达质粒免疫猪,可使接种猪产生抗 GP5 的特异性抗体,接种猪可免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变,并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。Kwang等 5用编码 4 种结构蛋白(GP4、GP5、M、N)的基因构建了 4 种 DNA 疫苗免疫猪,以由 GP5 构建的表达质粒激发的抗体具有最强的中和病毒的能力。但上述研究均发现,表达GP5 蛋白的DNA疫苗诱导的中和抗体不高(18)。最近,Ostrouski 等 6在采用噬菌体表面展示技术确定 GP5 中和表位时,发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位,此表位具有类似于HIV中覆盖表位的覆盖效应 7,也正是这一覆盖表位的覆盖效应,导致 GP5 中和表位无法充分暴露,从而难以激发很强的中和抗体。基于这一发现,本试验对 ORF5 基因进行了修饰,即将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)8插入GP5的中和表位和覆盖表位间,并比较了修饰与未修饰的ORF5基因DNA疫苗的免疫反应。1材料与方法1.1毒株、质粒和细胞PRRSV YA 株系本实验室分离的高致病力野毒株,由本室保存。真核表达质粒 pCI-neo 购自Promeaga公司。PRRSV YA株完整ORF5基因的原核表达质粒 pKG-53 和真核表达质粒 pCI-52 均由本室方六荣博士构建并保存9。Marc-145 细胞由德国巴伐利亚州动物保健中心 Czerny 博士赠送,Hela 细胞购自中国典型培养物中心。BALB/c小鼠购自湖北省预防医学科学院实验动物中心。1.2工具酶与试剂各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶均为 TaKaRa 产品。脂质体转染试剂盒 LipofectaM INETM2000为Invitrogen公司产品。DNA快速回收试剂盒购自上海生工生物工程公司。HRP 标记的羊抗鼠 IgG、FITC 标记的羊抗兔IgG均为SBA公司产品。1.3ORF5 基因的修饰与表达质粒构建采用 PCR 扩增和拼接方法,将编码PADRE表位的核苷酸序列引入ORF5 基因的中和表位与覆盖表位之间,其中引物 P51 和 P5m1 可扩增ORF5 基因N端 96bp,并同时引入长 39bp的PADRE表位,两端依次设计 Xho和 Pst酶切位点。P5m2和 P52,可扩增ORF5 基因后一部分的 507bp,两端依次设计Pst和Xba酶切位点。上述引物均由上海生工生物公程公司合成。引物序列如下:P51:5-GAACTCGAGAGTATGT TGGGGAAAT GCTT GACC-3P5m1:5-T TTCT GCAGAGCGGCAGCCTT CAGGGT CCAGGCAGCCACGAACT TGGCGTTGGCGTTGACGAGC-3P5m2:5-T TTCT GCAGAGCAACAGCAGCCTCT C-3P52:5-T TTT CTAGAGACGACCCCATTGTT CCGC-3ORF5 基因 2 部分序列的扩增条件均为:95.0 5min变性后进入循环,95.0 1 min,55.0 1 min,72.0 1 min,35 个循 环后 72.0延 伸 10 min。PCR 产 物 ORF5m1 与ORF5m2 分别用 Xho和 Pst及 Pst和 Xba酶切后,同时与用Xho与Xba酶切的pCI-neo真核表达质粒载体连接,获得修饰改造后的表达 ORF5 基因的真核表达质粒 pCI-52M。1.4间接免疫荧光检测体外表达大量制备表达质粒并经PEG8000 纯化后,待Hela细胞长至 60%70%单层时,在脂质体(LipofectaMINET M2000)介导下以纯化的表达质粒转染细胞,具体操作按试剂盒说明书进行。在转染后 48h,每孔用PBS(pH7.4)洗涤 3 次,甲醇室温固定 5 min 后,进行间接免疫荧光染色。于转染孔中加入适当稀释倍数的一抗(抗GP5的多克隆兔血清),37作用 1 h 后,PBS 洗涤 3 次,每次 5min,然后加入FITC标记的二抗,37作用 45min后,PBS洗涤风干后直接观察荧光。1中 国 兽 医 学 报2005年 1月第 25 卷第 1 期Chin J V et SciJan.2005Vol.25No.11.5动物分组及免疫56 周龄雌性BALB/c小鼠随机分为 pCI-neo、pCI-52和 pCI-52M 3 个免疫组(每组 6只)。后腿肌肉注射免疫 2 次,间隔 2 周,每次 100Lg/只。1.6ELISA 抗体检测以 pKG-53原核表达的 GP5 蛋白包被酶标板,分别检测免疫后 2、4、6 周实验动物血 清中的ELISA 抗体水平。1.7中和抗体检测分别采集实验动物免疫后 2、4、6 周血清,56灭活 30 min,进行微量中和试验检测。其中血清作2-1、2-22-6倍比稀释,病毒液为 100TCID50(含 20%新鲜补体),于 37、5%CO2培养,逐日观察并记录结果。2结果2.1真核表达质粒的构建与鉴定真核表达质粒 pCI-52M的构建图见图 1。经酶切与PCR鉴定证实构建正确。2.2真核表达质粒的体外表达pCI-52、pCI-52M以及空白载体 pCI-neo 分别转染 Hela 细胞,转染后 48 h 进行间接免疫荧光染色,结果pCI-neo为阴性,重组质粒pCI-52 和pCI-52M 均呈很强的荧光着色(图 2),说明真核表达质粒 pCI-52和pCI-52M均能较好地在体外表达ORF5 基因。图1DNA 疫苗的构建结构图图 2真核表达质粒在Hela 细胞上的表达A.pCI-neo 真核表达质粒;B.pCI-52真核表达质粒;C.pCI-52M 真核表达质粒2.3ELISA 抗体水平pCI-52、pCI-52M 和 pCI-neo 免疫BALB/c 小鼠,采用大肠杆菌表达和纯化的 GP5 蛋白作抗原,检测免疫后 2、4、6 周血清中 ELISA 抗体水平,结果见图3。经 修饰 改造 后的 DNA 疫 苗 pCI-52M 免 疫组 诱导 的ELISA 抗体要明显高于未经修饰的 DNA 疫苗 pCI-52 免疫组(P 0.05),表明修饰后的 GP5 具有更好的免疫原性。图 3DNA疫苗免疫小鼠的ELISA抗体2.4中和抗体水平进一步采用Nariyasu等 10报道的改良的中和抗体检测方法,检测免疫后 2、4、6 周中和抗体水平,结果与ELISA抗体结果一致(图 4)。未经修饰的DNA疫苗pCI-52 免疫组的中和抗体水平不高,并且上升得较为缓慢,而修饰改造后的DNA疫苗pCI-52M免疫组的中和抗体快速上升,于第 6 周达到最高为 1(15.3804.214),与 pCI-52免疫组差异极显著(P 0.01)。图4DNA疫苗诱发的中和抗体水平3讨论PRRS是一种极难防疫并且严重危害全球养猪业的新病毒性疫病11。由于现有的弱毒苗存在很高的返强几率并导致疫病的大暴发,而灭活苗的免疫效果又不理想,因此世界各国学者都致力于新型基因工程疫苗研究,力求获得一种更安全、高效、廉价的新型疫苗,控制该病的发生与流行。作为PRRSV最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白,ORF5 是设计 PRRS 新型疫苗的良好目标基因12。目前所报道的几种PRRS新型疫苗,包括亚单位疫苗、病毒载体疫苗(腺病毒和伪狂犬病病毒)和DNA疫苗,其中DNA疫苗的免疫效果优于其他 2 种疫苗。但从目前国内外有关 PRRSV DNA 疫苗(主要是 ORF5基因)研究结果看,普遍存在难以诱发较早和较高的抗体水平4,5。最近,Ostriuski等 6有关GP5 存在一个覆盖表位的观点可能是 ORF5 DNA 疫苗难以诱发较高的中和抗体的原因。2中 国 兽 医 学 报2005 年 1 月第 25 卷第 1 期Chin J V et SciJan.2005Vol.25No.1为了消除这一覆盖表位的覆盖效应,本研究对ORF5 基因进行了修饰,并引入了一个通用型辅助性 T 淋巴细胞表位(PADRE)。从动物试验结果看,经修饰后获得结构优化的DNA 疫苗 pCI-52M 所诱发的体液免疫反应明显要强于未经改造的常规DNA疫苗pCI-52。尤其表现在中和抗体水平方面,前者所产生的中和抗本水平较后者显著提高,并且激发中和抗体较快,于免疫后 6 周达到 1(15.3804.214),而后者(常规 DNA 疫苗)则只有 18,表明修饰后的 ORF5M 基因具有更好的免疫原性。PADRE 是 Alexarder 等 8在多聚丙氨酸骨架导入 HLA-DR 分子锚定序列构建的一种通用性 Th 细胞表位,其诱导Th 细胞反应的能力比自然源性 Th 表位高1 000倍。PADRE可为 B 细胞、CT L 细胞表位以及碳水化合物抗原提供强有力的辅助作用,诱导高效的 Th 反应8。本研究在改造 ORF5时,将 PADRE 引入,其目的一方面是使 GP5 的中和表位充分展示,另一方面是进一步增强体液免疫和细胞免疫。从本研究结果看,修饰后的 ORF5M 诱导的体液免疫反应明显优于未修饰的ORF5。由于缺少合适的靶细胞,本研究未能进行修饰后的 ORF5M 是否能诱导更强的细胞免疫反应的观察。此外,由于检测手段的限制,我们目前还不能阐明体液免疫的增强到底是因为 PADRE 插入后使 GP5 中和表位充分展示而导致的增强,还是PADRE本身在起作用,或两者的共同作用的结果。但不管其作用机制如何,本研究通过对ORF5 基因的修饰所获得的ORF5M DNA疫苗,是一种值得进一步深入研究,并且具有潜在开发价值的 PRRS 新型疫苗。参考文献:1 Meulenberg J J.PRRSV,the VirusJ.Vet Res,2000,31:11-21.2 Madsen K G,Hansen C M,Madsen E S,et al.Sequence analysisof Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus of theAmerican type collected from Danish swine herds J.Arch Vi-rol,1998,143:1 683-1 700.3 Nielson T L,Nielsom J,Have P,et al.Examination of virusshedding in semen from vaccinated and from previously infectedboars after experimental challenge with Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus J.Vet M icrobiol,1997,54:101-112.4 Pairzadeh B,Dea S.Immune response in pigs vaccinated withplasmid DNA encoding ORF5 of Porcine Reproductive and Res-piratory Syndrome Virus J.J Gen Virol,1998,58:989-999.5 Kwang J,Zuckermann F,Ross G,et al.Antibody and cellularimmune responses of swine following immunization with plas-mid DNA encoding the PRRS virus ORFs4,5,6and7J.VetSci,1999,67:199-201.6 Ostrowski M,Galeota J A,Jar A M,et al.Identification of neu-tralizing and nonneutralizing epitopes in the Porcine Reproduc-tive and Respiratory Syndrome Virus GP5ectodomainJ.J Vi-rol,2002,76:4 241-4 250.7 Cleveland S M,Buratto E,Jones T,et al.Immunogenic and anti-genic dominance of a nonneutralizing epitope over a highly con-served enutralizing epitope in the g p41 envelope glycoprotein ofhuman immunodeficiency virus type 1:its deletion leads to astrong neutralizing response J.Virology,2000,266:66-78.8 Alexander J,Fikes J,Hoffman S,et al.The optimization ofhelper T lymphocyte(HTL)function in vaccine developementJ.Immunol Res,1998,18:79-92.9 方六荣.猪繁殖与呼吸综合征“自杀性”DNA 疫苗与活病毒载体疫苗研究 D.武汉:华中农业大学,2003.10 Noriyasu T,Shigeki K,Seiya I,et al.Early serodiagnosis ofPorcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus infec-tion of pigs by detection of slow-reacting and complement-re-quiring neutralizing antibodyJ.J Vet Med Sci,1997,59:31-34.11 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pCI-neo and the expression was confirmed by indirect immunofluorescence assay.BALB/cmice were immunized with either the modified expression plasmid pCI-52M or non-modified expression plasmid pCI-52and thehumoral immune responses were elevated at various time points after primary immunization.Results showed that both ELISAand neutralization antibody titers induced by the modified DNA vaccine pCI-52M were higher significantly than those elicited bynon-modified DNA vaccine pCI-52,indicating that the modified DNA vaccine pCI-5M may enhance the potency of PRRSV DNAvaccines and can be considered as a promising vaccine against PRRS.Key words:PRRSV;ORF5 gene;PADRE epitope;DNA vaccines*Corresp onding author3中 国 兽 医 学 报2005年 1月第 25 卷第 1 期Chin J V et SciJan.2005Vol.25No.1