新生大鼠海马脑片培养方法.pdf

新生大鼠海马脑片培养方法王勇，朱小南，陈汝筑，何进，余剑平，汪雪兰（中山大学中山医学院药理学教研室，广东 广州 ；南方医科大学珠江医院临床药理基地，广东 广州 ）摘要：目的建立新生大鼠海马脑片体外长期培养方法。方法取出生后 的新生大鼠海马，切成 厚的脑片，转至带有微孔膜插件的培养皿中进行培养。培养期间进行形态学观察，并通过 法鉴定组织活力，免疫组化法观察胶质细胞对损伤的反应，电生理反应以检测神经细胞功能。结果培养海马脑片逐渐变薄，后结构清晰，细胞形态完整；法显示培养 内的海马组织均能保持高摄入 能力；在 侧枝给予单脉冲刺激，于 区能接收到完整的群峰电位；谷氨酸导致胶质细胞抗胶质纤维酸性蛋白高表达。结论本方法培养 的海马脑片具有正常的活力和功能。关键词：海马；海马脑片，培养的；模型，动物中图分类号：文献标识码：文 章 编 号：（）对神经系统许多功能的研究，最理想的条件是保持在体固有的、立体的神经细胞之间及神经细胞与非神经细胞之间动态联系的基础上进行，这种在体细胞间固有的完整联系通过神经细胞培养是不能实现的。但是，在体研究最大的困难在于实验受制约因素太多，不便控制实验条件和观察实验结果。体外培养的脑片包含了与在体脑组织相同的细胞种类及细胞的三维空间结构，保存了正常完整的突触回路、受体分布、递质传递和其他生理功能 。脑片的体外长期培养为研究药物和毒物对中枢神经的慢性作用 ，、神经损伤与修复 、神经发育 等提供收稿日期：接受日期：基金项目：广东省自然科学基金（）作者简介：王勇（），男，重庆市人，医学博士，副教授，主要从事药理与毒理学、分子生物学研究。联系作者 ：（）：（）了理想的条件。由于体外培养脑片突出的优越性，因此脑片培养技术十分重要。随着脑片培养技术的不断改进，目前国外不仅建立了新生鼠海马脑片培养技术，而且还探讨了成年鼠海马脑片的培养技术 。但在培养海马脑片长期成活的基础上，系统地观察培养海马脑片的生理功能尤其是神经冲动传输的研究报道目前还不多。本研究采用微孔膜插件培养海马脑片，并通过多种方法鉴定培养海马脑片的存活和功能。材料与方法 动物、试剂与仪器新生 的 乳大鼠由中山大学实验动物中心提供，培养基、马血清购于 公司，膜插件（）为 公司产品；噻唑蓝（）、抗胶质纤维酸性蛋白（，）抗体、焦油紫均购于 公司。体视显微镜（）、振动切片机（）、电位记录系统（）、显微镜（）和细胞培养箱（）。脑片培养脑片制备参照 等 方法。将出生后 的乳鼠用 乙醇浸泡消毒后，断头取脑，迅速置于预冷的解剖缓冲液中，分离出完整的海马。将海马放置于振动切片机的载物平台上，在解剖缓冲液中以 厚度进行切片。膜插件处理：在每一培养皿中放置一个膜孔为 的膜插件，加入 含 马血清的 培养液使培养插件膜润湿至半透明，并于培养脑片前 放入 细胞培养箱中以调节培养基的酸碱度。脑片孵育：经过漂洗的每 块海马脑片被置于同一膜插件上，在解剖镜下使其分布均匀。脑片中国药理学与毒理学杂志 年 月；（）：（）：，神经元胞体形态对培养 的海马脑片进行焦油紫染色，结果显示：在 培养期间，海马脑片从 至 及齿状回都有神经细胞的规律分布，在高倍镜下证实神经细胞胞体形态清晰，胞核为淡染区（图）。培养海马脑片对电刺激的反应在培养 的海马脑片 侧枝给予一波宽为 ，强度为 的单脉冲刺激，从 区可接收到完整的群峰电位，分别于培养 ，和 的海马脑片中进行电刺激仍能得到同样的结果（图 ）。，培养海马脑片对损伤的反应通过免疫组化检测海马脑片中星形胶质细胞 的激活以观察海马脑片中星形胶质细胞对损伤的反应，从而判断星形胶质细胞的功能。当海马脑片培养至 后，采用免疫组化观察星形胶质细胞对损伤刺激的反应。可见在培养基中加入谷氨酸前，培养海马脑片中 表达甚微（图 ），当培养基中加入谷氨酸后，星形胶质细胞被激活，表达明显增加（图 ）。对培养 ，的海马脑片进行同样的观察，胶质细胞的激活反应未见减弱（图 ，）。讨论利用微孔膜插件培养新生鼠脑片是使脑片处于液气交界面，脑片一部分浸没于培养基，另一部分暴露于气体中，既有利于脑片从培养基中摄取营养，又有利于脑片从空气中获得充足的氧。培养脑片的质量受新生鼠鼠龄、脑片厚度和具体脑区的影响。由于出生后 的新生鼠神经细胞形态发育较好且组织易于分离，因此本实验选用出生后 的新生鼠获得所需脑片；由于神经细胞生长要求一定的细胞密度及脑片制备过程中的机械损伤，所以脑片太薄（）并不利于细胞的存活，但是如果脑片太厚（），在培养过程中细胞不易得到充足的氧气和营养，也会导致脑片中细胞存活率降低 ，故本研究脑片厚度为 。实验结果表明，日龄新生鼠 厚的海马脑片在培养 内，其功能和形态均保持完好。因脑片制备过程中的机械损伤，部分细胞水肿和死亡，所以培养初期的海马脑片大体结构稍显模糊，随着培养时间延长，损伤死亡的细胞被清除，脑片变薄，结构变得更为清晰（图 ）。尼氏小体是神经细胞特异性嗜色质，本研究通过焦油紫尼氏染色法清楚地显示了培养海马脑片中神经细胞的正常形态（图 ）。为进一步证实培养的海马脑片存活状况，本实验除对其进行大体的形态学观察外，还通过对培养脑片中细胞生存活力的测定、神经细胞的电生理反应、星形胶质细胞对损伤的反应以证实海马脑片培养成功与否。；（）：，：，（，），（）法通常在细胞培养中用于检测单细胞活力 ，但也有研究表明它用于培养组织活力的检测同样有效 。在存活细胞的细胞器如线粒体、内质网、溶酶体内形成蓝紫色沉淀，通过观察培养组织中蓝紫色沉淀的形成判断组织的存活状况。本实验采用 法检测培养 后的海马脑片组织活力，发现海马脑片组织均呈现出蓝紫色（图 ），提示培养后的脑片具有活力。不过，由于培养脑片厚度的影响，即使采用相差显微镜观察也很难进行存活细胞计数和存活率的计算，且因脑片组织中细胞分布不完全均匀，因此作者认为 等 采用 对组织活力进行定量分析并不十分准确，用 法更适用于对培养脑片组织活力进行定性研究。发育正常、生长良好的神经细胞是否具有良好的兴奋性可以通过观察神经细胞重要特点 神经冲动的传输予以确定。突触传递反映神经细胞间的联系状态，能否顺利进行细胞间的信息传递，不仅取决于神经细胞本身的质量，同时受细胞三维空间的影响，只有神经细胞之间的联系处于良好状态，神经细胞间才能实现信息传递全过程。本实验在培养 的海马脑片 侧支施予一适当的电刺激，能在海马 区的锥体细胞层记录到完整的群峰电位，这不仅说明培养 的海马脑片细胞均存活并处于良好的功能状态，同时反映培养海马脑片中的突触连接正常，能完成细胞间的信息传递。对损伤产生应激反应是胶质细胞功能正常的体现，正常的星形胶质细胞在受到损伤刺激时能被激活形成反应性胶质细胞，表现为胞体和突起肥大，大量合成与堆积 。因此 的大量表达既是细胞损伤的标志，同时也是胶质细胞活力和功能的表现。本研究采用谷氨酸诱导细胞损伤，在加入谷氨酸前，培养 的海马脑片 表达均较低，加入谷氨酸后再进行检测，表达明显增加（图 ）。提示谷氨酸能诱导海马脑片损伤，胶质细胞对谷氨酸介导的损伤能产生正常的激活反应。总之，利用体外组织培养技术既能保持组织固有结构不变，同时又有利于实验条件的控制和实验结果的观察。本实验通过对培养脑片的形态观察，并对组织活力进行监测，进而通过胶质细胞对损伤的反应和神经细胞的电生理反应研究，证实 日龄新生大鼠海马脑片经过 培养仍具有正常的活力和功能。海马脑片的培养成功，可为神经外科学、生理学、药理学、毒理学等多学科的研究提供更理想的实验模型。参考文献：，中国药理学与毒理学杂志 年 月；（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（，），（），（）：，（）：，（，；，）：（），（），：；，；，：（）（本文编辑董立春）；（）