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微生物饲料添加剂 乳酸菌的微生物学检验

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一、概述
乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。乳酸细菌主要包括23个属，通常在饲料中用作有益微生物的菌种有干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、乳酸乳杆菌(Lactococcus Lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。APT培养基通常用于分离绿色乳杆菌和其他乳杆菌及肉食杆菌。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基，还有利用磺胺二甲恶唑、制大肠菌素和结晶紫等作为选择因子。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。此外还有如溴甲酚紫培养基、CHALMERS培养基等也常用于乳酸菌的分离。
以下举几个例子来说明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属（Lactobacillus）的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛，接触酶阴性，和苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、蔗糖反应为阴性，阿拉伯糖、葡糖酸盐、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反应为阴性。由于嗜酸乳杆菌在生长中可以产生一些抑菌物质，如有机酸、细菌素及类细菌素，可以抑制肠道中有害微生物生长繁殖，起到平衡肠道菌群的作用。并能产生B族维生素，包括各种叶酸、生物素、维生素B6和维生素K等，分泌各种有益物质，如乳酸、乙酸等，降低肠道pH值。粪肠球菌主要存在于人类或动物肠道，是人类和动物肠道的正常菌群等。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形，能在胆汁七叶苷琼脂上生长，不产生色素。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状，接触酶阴性，不产细胞色素，在不加啤酒花的麦芽汁中生长，能利用半乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖产酸，不分解蛋白质，不产吲哚，不水解马尿酸盐。某些菌株能利用蔗糖和乳糖产微量的酸。不能利用麦芽糖、甘露醇、糊精等产酸，能产丁二酮。

二、检测方法
1 范围
本方法规定了微生物饲料中各乳酸菌(包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、戊糖片球菌)及其总数的测定及鉴定方法。
本方法适用于微生物饲料中乳酸菌的检测。

2 术语：
乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌数总数：试料在一定条件下培养后，所得1 mL试料中所含乳酸菌菌落的总数。

3 设备和材料
3.1 恒温培养箱：36±1℃。
3.2 冰箱：0~4℃。
3.3 恒温水浴：46±1℃
3.4 电炉：可调式。
3.5 吸管：容量为1、10、25 mL。
3.6 广口瓶或三角瓶：容量为500 mL。
3.7 平皿：直径为9 cm。
3.8 试管：18×180 mm。
3.9 显微镜。
3.10高压灭菌锅。
3.11烘箱。

4 培养基和试剂
4.1 改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。
4.2 改良MC培养基（Modified Chalmers培养基）。
4.3 0.1%美兰牛乳培养基。
4.4 6.5%氯化钠肉汤。
4.5 pH9.6葡萄糖肉汤。
4.6 40%胆汁肉汤。
4.7 淀粉水解培养基。
4.8 精氨酸水解培养基。
4.9 乳酸杆菌糖发酵管。
4.10 七叶苷培养基。
4.11 革兰氏染色液。
4.12 3%过氧化氢溶液。
4.13 蛋白胨水、靛基质试剂。
4.14 明胶培养基。
4.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。
4.16 生理盐水：将蒸馏水加入8.5 g的食盐中做成1000 mL的溶液。在121℃下灭菌15min。

5 乳酸菌菌落总数的测定
5.1 检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序如下：

试料

作成几个适当倍数的稀释液

选择2~3个适当稀释度，各以1 mL之量加入灭菌平皿内

每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基

72±1℃
36±1℃

菌落计数

报告

图：乳酸菌检测程序图

5.2 操作步骤
5.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的试料25 mL（或25 g）放入含有225 mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。
5.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
5.2.3 另取1 mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。
5.2.4 选择2~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
5.2.5 稀释液移入平皿后，应即时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15 mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1 mL稀释液试料用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20 min内完成。
5.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温培养箱内培养72±1 h取出，观察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。
5.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。
表1 乳酸菌菌落特征

改良TJA
改良MC
杆菌
平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm，如棉絮团状菌落。
平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2±1mm，可有淡淡的晕。
球菌
平皿底为黄色，菌落光滑，湿润，微白色，边缘整齐。
平板底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕。
注：干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状，

6 乳酸菌的鉴定
进行革兰氏染色，显微镜检查，并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定，则作以下试验。
6.1 菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24~48 h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。
6.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。
6.3几种乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。
6.4肠球菌的鉴别试验，见表3。
6.5 肠球菌属与片球菌属容易混淆，其鉴别可见表4。
表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应

七叶苷
纤维二糖
麦芽糖
甘露醇
水杨苷
山梨醇
棉籽糖
蔗糖
干酪乳杆菌
+
+
d
+
+
+
-
d
嗜酸乳杆菌
+
+
+
-
+
-
d
+
植物乳杆菌
+
+
+
+
+
+
+
+
注：d──有些菌株阳性，有些菌株阴性；#──弱、慢或阴性。
表3 肠球菌的鉴别表
名称
α-半乳糖苷酶
L-阿拉伯糖
甘露醇
蜜二糖
山梨醇
丙酮酸发酵
粪肠球菌
-
-
+
-
D+
+
屎肠球菌
V
V
V
V
D-
-
注：D+，通常阳性；D-，通常阴性；V，不同或可变。
表4 链球属与片球菌属的鉴别特征

链球菌属
片球菌属
细胞形态
球或卵圆形
球形
排列
成对，链
四联，成对
接触酶
-
d
厌氧条件下生长良好
+
+
从葡萄糖产气
-
-
抗万古霉素
-
+
注：d──有些菌株阳性，有些菌株阴性。

7 结果计算及表述
7.1 乳酸菌总数
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。
7.2 各乳酸菌数
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定，根据证实为某乳酸菌菌落计算出该皿内的此乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此乳酸菌数。如含有屎肠球菌的试料中10-6稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的屎肠球菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为屎肠球菌的是4个，由1克试料中含屎肠球菌数为：。.