微生物饲料添加剂.docx

微生物饲料添加剂 乳酸菌的微生物学检验

www.饲料检测网.中国
www. 饲料检测网.cn

一、概述
乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。乳酸细菌主要包括23个属，通常在饲料中用作有益微生物的菌种有干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、乳酸乳杆菌(Lactococcus Lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。APT培养基通常用于分离绿色乳杆菌和其他乳杆菌及肉食杆菌。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基，还有利用磺胺二甲恶唑、制大肠菌素和结晶紫等作为选择因子。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。此外还有如溴甲酚紫培养基、CHALMERS培养基等也常用于乳酸菌的分离。
以下举几个例子来说明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属（Lactobacillus）的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛，接触酶阴性，和苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、蔗糖反应为阴性，阿拉伯糖、葡糖酸盐、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反应为阴性。由于嗜酸乳杆菌在生长中可以产生一些抑菌物质，如有机酸、细菌素及类细菌素，可以抑制肠道中有害微生物生长繁殖，起到平衡肠道菌群的作用。并能产生B族维生素，包括各种叶酸、生物素、维生素B6和维生素K等，分泌各种有益物质，如乳酸、乙酸等，降低肠道pH值。粪肠球菌主要存在于人类或动物肠道是人类和动物肠道的正常菌群等。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形，能在胆汁七叶苷琼脂上生长，不产生色素。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状，接触酶阴性，不产细胞色素，在不加啤酒花的麦芽汁中生长，能利用半乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖产酸，不分解蛋白质，不产吲哚，不水解马尿酸盐。某些菌株能利用蔗糖和乳糖产微量的酸。不能利用麦芽糖、甘露醇、糊精等产酸，能产丁二酮。

二、检测方法
1 范围
本方法规定了微生物饲料中各乳酸菌(包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、戊糖片球菌)及其总数的测定及鉴定方法。
本方法适用于微生物饲料中乳酸菌的检测。

2 术语：
乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌数总数：试料在一定条件下培养后，所得1 mL试料中所含乳酸菌菌落的总数。

3 设备和材料
3.1 恒温培养箱：36±1℃。
3.2 冰箱：0~4℃。
3.3 恒温水浴：46±1℃
3.4 电炉：可调式。
3.5 吸管：容量为1、10、25 mL。
3.6 广口瓶或三角瓶：容量为500 mL。
3.7 平皿：直径为9 cm。
3.8 试管：18×180 mm。
3.9 显微镜。
3.10高压灭菌锅。
3.11烘箱。

4 培养基和试剂
4.1 改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。
4.2 改良MC培养基（Modified Chalmers培养基）。
4.3 0.1%美兰牛乳培养基。
4.4 6.5%氯化钠肉汤。
4.5 pH9.6葡萄糖肉汤。
4.6 40%胆汁肉汤。
4.7 淀粉水解培养基。
4.8 精氨酸水解培养基。
4.9 乳酸杆菌糖发酵管。
4.10 七叶苷培养基。
4.11 革兰氏染色液。
4.12 3%过氧化氢溶液。
4.13 蛋白胨水、靛基质试剂。
4.14 明胶培养基。
4.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。
4.16 生理盐水：将蒸馏水加入8.5 g的食盐中做成1000 mL的溶液。在121℃下灭菌15min。

5 乳酸菌菌落总数的测定
5.1 检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序如下：

试料

作成几个适当倍数的稀释液

选择2~3个适当稀释度，各以1 mL之量加入灭菌平皿内

每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基

72±1℃
36±1℃

菌落计数

报告

图：乳酸菌检测程序图

5.2 操作步骤
5.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的试料25 mL（或25 g）放入含有225 mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。
5.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
5.2.3 另取1 mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。
5.2.4 选择2~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
5.2.5 稀释液移入平皿后，应即时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15 mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1 mL稀释液试料用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20 min内完成。
5.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温培养箱内培养72±1 h取出，观察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。
5.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。
表1 乳酸菌菌落特征

改良TJA
改良MC
杆菌
平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润边缘不整齐，直径3±1mm，如棉絮团状菌落。
平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2±1mm，可有淡淡的晕。
球菌
平皿底为黄色，菌落光滑，湿润，微白色，边缘整齐。
平板底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕。
注：干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状，

6 乳酸菌的鉴定
进行革兰氏染色，显微镜检查，并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定，则作以下试验。
6.1 菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24~48 h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。
6.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。
6.3几种乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。
6.4肠球菌的鉴别试验，见表3。
6.5 肠球菌属与片球菌属容易混淆，其鉴别可见表4。
表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应

七叶苷
纤维二糖
麦芽糖
甘露醇
水杨苷
山梨醇
棉籽糖
蔗糖
干酪乳杆菌
+
+
d
+
+
+
-
d
嗜酸乳杆菌
+
+
+
-
+
-
d
+
植物乳杆菌
+
+
+
+
+
+
+
+
注d──有些菌株阳性，有些菌株阴性；#──弱、慢或阴性。
表3 肠球菌的鉴别表
名称
α-半乳糖苷酶
L-阿拉伯糖
甘露醇
蜜二糖
山梨醇
丙酮酸发酵
粪肠球菌
-
-
+
-
D+
+
屎肠球菌
V
V
V
V
D-
-
注：D+，通常阳性；D-，通常阴性；V，不同或可变。
表4 链球属与片球菌属的鉴别特征

链球菌属
片球菌属
细胞形态
球或卵圆形
球形
排列
成对，链
四联，成对
接触酶
-
d
厌氧条件下生长良好
+
+
从葡萄糖产气
-
-
抗万古霉素
-
+
注：d──有些菌株阳性，有些菌株阴性。

7 结果计算及表述
7.1 乳酸菌总数
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。
7.2 各乳酸菌数
菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定，根据证实为某乳酸菌菌落计算出该皿内的此乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此乳酸菌数。如含有屎肠球菌的试料中10-6稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的屎肠球菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为屎肠球菌的是4个，由1克试料中含屎肠球菌数为：。.