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61微生物限度检测 （MICROBIAL LIMIT TESTS）

此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。在样品检测过程中须进行无菌操作。若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。

准备实验 (Preparatory Testing)
本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。方法如下： 将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：
（1） 增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者
（2） 中和一定数量的干扰因子；或者
（3） 结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用： 大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。然后重复前面的实验，用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20（Fluid Casein Digest-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium）论证待测样品里的防腐剂或其他抑菌因子被中和。若产品中含有抑菌物质且产品是可溶性的，则采用“无菌实验（Sterility Tests <71>）”里的“薄膜过滤法 (Membrane Filtration Method)”进行(微生物限度)检测会更适宜（suitable）。
在抑菌物质得以适当中和、稀释液体积大幅度增加后仍不能排除抑制因子，以及不适宜用“薄膜过滤法”的情况下，可能会因为产品本身的杀菌作用导致细菌无法生长。当产品不能检测出接种菌种的情况下，应用光谱法确定产品的抑菌/杀菌成分。

缓冲液和培养基 (Buffer Solution and Media)
按照下列配方配制培养基，或者使用规范厂商生产的培养基干粉进行培养基配制，所使用的干粉培养基应该与在此列出的培养基成分比例相似。
在按列出的配方进行培养基配制时，用水溶解固体物质，必要时可以加热以得到完全溶解的均匀溶液。在使用前用盐酸或氢氧化钠将培养基的pH值调节到要求范围，调节pH值应在25±2O条件下进行。
若培养基配方有琼脂，应使用湿度不超过15%的琼脂。溶解水为纯化水（Purified Water）。

PH 7.2 磷酸(盐)缓冲液
储备液——称34g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶，加水500mL溶解。用氢氧化钠TS调节pH 至7.2±0.1（约175mL），然后加水至容量瓶刻度，混匀。分装溶液后灭菌。冰箱保存。

培养基
除另有指出，培养基应在高压灭菌器中加热灭菌。（见<1211>“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”）。保存时间（exposure time）取决于培养基的灭菌体积。
1、液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------20g
大豆卵磷脂-------------------------5g
聚山梨醇酯20---------------------40mL
水-------------------------------960mL
将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于960mL水中，48~50℃水浴加热约30分钟得均匀溶液。加40mL聚山梨醇酯20，混匀，按需要分装。
2、大豆酪蛋白消化物琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物-----------------15.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物------------5.0g (Papaic Digest of Soybean Meal)
氯化钠----------------------------5.0g
琼脂-----------------------------15.0g
水------------------------------1000mL
灭菌后pH值：7.3±0.2
3、液体大豆酪蛋白消化物培养基
按照<71>无菌试验里的方法进行配制。
酪蛋白胰酶消化物------------------17.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物-------------3.0g
氯化钠-----------------------------5.0g
磷酸氢二钾-------------------------2.5g
葡萄糖（C6H12O6 H2O）--------------2.5g
纯化水---------------------------1000mL
4、甘露醇-盐琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物-------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物-------------5.0g
牛肉膏-----------------------------1.0g
D-甘露醇--------------------------10.0g
氯化钠----------------------------75.0g
琼脂------------------------------15.0g
酚红-----------------------------0.025g
水-------------------------------1000mL
混匀，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。灭菌后pH值：7.4±0.2
5、Baird-Parker琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物-------------------10.0g
牛肉膏------------------------------5.0g
酵母膏------------------------------1.0g
氯化锂------------------------------5.0g
琼脂-------------------------------20.0g
氨基乙酸（糖胶）-------------------12.0g
丙酮酸钠---------------------------10.0g
水---------------------------------950mL
搅拌加热，煮沸1分钟。灭菌，冷却至45~50℃，然后加入10mL灭菌后的亚碲酸钾（1:100）和50mL乳状蛋黄。轻柔混匀。
6、Vogel-Johnson 琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
酵母膏-----------------------------5.0g
甘露醇----------------------------10.0g
磷酸氢二钾-------------------------5.0g（Dibasic Potassium Phosphate）
氯化锂-----------------------------5.0g
氨基乙酸（糖胶）------------------10.0g
琼脂------------------------------16.0g
酚红-----------------------------25.0mg
水-------------------------------1000mL
溶解后煮沸1分钟。灭菌，冷却至45~50℃，然后加20mL灭菌后的亚碲酸钾（1：100）。
灭菌后pH值：7.2±0.2
7、溴棕三甲铵琼脂培养基
白明胶胰酶消化物-------------------20.0g
氯化镁------------------------------1.4g
硫酸钾-----------------------------10.0g
琼脂-------------------------------13.6g
溴棕三甲铵--------------------------0.3g
丙三醇----------------------------10.0mL
水--------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：7.2±0.2
8、假单胞菌琼脂培养基 检测荧光生二氢荧光素
酪蛋白胰酶消化物-------------------10.0g
动物组织胃蛋白酶消化物-------------10.0g
无水磷酸氢二钾----------------------1.5g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）---------------1.5g
丙三醇----------------------------10.0mL
琼脂-------------------------------15.0g
水--------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：7.2±0.2
9、假单胞菌琼脂培养基 检测绿脓菌溶素
白明胶胰酶消化物--------------------20.0g
无水氯化镁---------------------------1.4g
无水硫酸钾--------------------------10.0g
琼脂--------------------------------15.0g
丙三醇-----------------------------10.0mL
水---------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：7.2±0.2
10、液体乳糖培养基
牛肉膏------------------------------3.0g
白明胶胰酶消化物--------------------5.0g
乳糖--------------------------------5.0g
水--------------------------------1000mL
灭菌后需尽快冷却。
灭菌后pH值：6.9±0.2
11、液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基
酪蛋白胰酶消化物--------------------5.0g
乳糖--------------------------------4.0g
磷酸钠-----------------------------10.0g
亚硒酸钠----------------------------4.0g
L-胱氨酸--------------------------10.0mg
水--------------------------------1000mL
终pH：7.0±0.2
混匀后加热得均匀溶液。在流动蒸汽中加热15分钟，不可灭菌。
12、液体连四硫酸盐培养基 （四硫磺酸钠亮绿TTB）
酪蛋白胰酶消化物--------------------2.5g
动物组织胃蛋白酶消化物--------------2.5g
牛胆盐Bile Salts--------------------1.0g
碳酸钙------------------------------10.0g
硫代硫酸钠--------------------------30.0g
水---------------------------------1000mL
煮沸溶液使固体物质溶解。使用当天加入5g碘化钾和6g碘到20mL水中配制成的溶液，然后加10mL亮绿（1:1000），混匀。加入亮绿后的溶液不可加热。
13、亮绿琼脂培养基
酵母膏------------------------------3.0g
动物组织胃蛋白酶消化物--------------5.0g
酪蛋白胰酶消化物--------------------5.0g
乳糖-------------------------------10.0g
氯化钠------------------------------5.0g
蔗糖-------------------------------10.0g
酚红--------------------------------80mg
琼脂-------------------------------20.0g
亮绿-------------------------------12.5g
水--------------------------------1000ml
煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。使用前灭菌，用融化后的培养基倒平皿，冷却凝固后使用。 灭菌后pH值：6.9±0.2。
14、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶 琼脂培养基
戊醛糖------------------------------3.5g
L-赖氨酸----------------------------5.0g
乳糖--------------------------------7.5g
蔗糖--------------------------------7.5g
氯化纳------------------------------5.0g
酵母膏------------------------------3.0g
酚红--------------------------------80mg
琼脂-------------------------------13.5g
脱氧胞啶钠--------------------------2.5g（Sodium Desoxycholate）
硫代硫酸钠--------------------------6.8g
柠檬酸铁铵-------------------------800mg
水--------------------------------1000mL
终pH：7.4±0.2。
搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。溶解后立即转移到50℃水浴，在培养基凝固前倒平皿。
15、亚硫酸铋琼脂培养基
牛肉膏----------------------------5.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物------------5.0g
葡萄糖----------------------------5.0g
磷酸钠----------------------------4.0g
硫酸亚铁-------------------------300mg
亚硫酸铋--------------------------8.0g
琼脂-----------------------------20.0g
亮绿------------------------------25mg
水------------------------------1000mL
终pH：7.6±0.2。
搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。溶解后立即转移到50℃水浴，在培养基凝固前倒平皿。
16、三糖-铁-琼脂培养基(TSI)
酪蛋白胰酶消化物-----------------10.0g
动物组织胰酶消化物---------------10.0g
乳糖-----------------------------10.0g
蔗糖-----------------------------10.0g
葡萄糖----------------------------1.0g
硫酸铵亚铁---------------------- 200mg（Ferrous Ammonium Sulfate）
氯化纳----------------------------5.0g
硫代硫酸钠-----------------------200mg
琼脂-----------------------------13.0g
酚红------------------------------25mg
水------------------------------1000mL
灭菌后pH：7.3±0.2。
17、麦康凯（MacConkey）琼脂培养基
白明胶胰酶消化物-----------------17.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------1.5g
动物组织胃酶消化物----------------1.5g
乳糖-----------------------------10.0g
牛胆盐混合物----------------------1.5g
氯化钠----------------------------5.0g
琼脂-----------------------------13.5g
中性红----------------------------30mg
结晶紫---------------------------1.0mg
水------------------------------1000mL
煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。灭菌后pH：7.1±0.2。
18、Levine曙红亚甲基蓝琼脂培养基
白明胶胰酶消化物-----------------10.0g
磷酸氢二钾------------------------2.0g
琼脂-----------------------------15.0g
乳糖-----------------------------10.0g
Eosin Y--------------------------400mg
亚甲基蓝---------------------------65g
水------------------------------1000mL
加白明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾和琼脂于水，加热溶解后冷却。使用前融化，按如下量比加入其他液态成分，混匀：每100mL琼脂溶液加入——5mL乳糖溶液（1：5）、2mL Eosin Y溶液（1：50）、2mL亚甲基蓝溶液（1：300）。配制后的溶液应澄清。灭菌后pH：7.1±0.2。
19、Sabouraud葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖------------------------------------------------------40g
同比配制的动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物--------------10g
琼脂--------------------------------------------------------15g
水--------------------------------------------------------1000mL
混合，煮沸得均匀溶液。
灭菌后pH：5.6±0.2。
20、马铃薯葡萄糖琼脂培养基
取300g剥皮的马铃薯，放入500mL蒸馏水中煮溶，过滤，加蒸馏水至1000Ml，然后加入以下物质：
琼脂-----------------------------------15g
葡萄糖---------------------------------20g
加热溶解后灭菌。灭菌后pH：5.6±0.2。使用前倒平皿。待培养基冷却到45℃时加入酒石酸溶液（1：10）调节pH3.5±0.1，调节pH后不得再加热。

取样 (Sampling)
每个检测项目需要10mL或10g样品。

操作步骤 (Procedure)
准备检测样品，用与样品物理性质相适宜的方法进行样品处理，处理程序不得改变样品最初的微生物数量和种类。以获得可用于检测操作的溶液或悬液。
对于在一定范围内可溶解但溶解不完全的固体样品，可减少样品量，并加以注明。然后可采用“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。
对于液体样品，溶液或者悬液，或者酒精含量少于30%的水醇溶液，以及易溶且完全溶解于90mL pH 7.2的磷酸（盐）缓冲液或已指明的其他溶媒的固体样品，可采用“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。
对于不溶于水的流体，药膏，乳酪，以及蜡状物，可用最小量限的、已灭菌的乳化剂（如一种ploysorbates），通过机械搅拌、必要时可以进行不超过45℃加热的方法将其制备成悬液，然后将悬液按“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。
对于气雾状态的液体样品。。。。。。。。。

好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）
对于易溶、溶液透明可采用“平板法（Plate Method）”的样品采用平板法进行检测；否则可采用“多管法（Multiple-tube Method）”。无论采用何种方法，首先精确量取10.0g样品（固体）或10.0mL样品（液体）。将样品加入到pH 7.2的磷酸（盐）缓冲液、液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20中至100mL。如果1：10的样品溶液过分粘稠无法吸取，可继续稀释至1：50或1：100等稀释度直到获得可吸取的溶液。按照“准备试验”要求消除抑菌因素后方可进行好氧微生物总数检测。准备好的接种溶液应在1小时内加入样品。
平板法（Plate Method）
必要时对样品溶液进行稀释，直到每1mL液体中含菌量在30到300个之间。吸取1mL供试液到1个已灭菌平皿，共做两个平皿的平行样。迅速地在每个平皿里加入15~20mL加热溶解后冷却到45左右的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基，盖上皿盖，顺或逆时针旋转平皿使供试液和培养基混匀，然后静置到室温待平皿冷却凝固。，倒置平皿，培养48~72小时。培养完成后观察平皿内微生物生长状况，进行菌落计数。取两个平皿的平均菌落数作为每g或每mL样品的微生物含量。如果1：10的稀释度未检出微生物，则结果表达为“样品微生物含量少于10个/g or mL”。
多管法(Mulptiple-tube Method)
向14支大小相同的试验试管中加入9mL灭菌液体大豆酪蛋白消化物培养基。将其中12支试管分为4组，每组3支。（头3组分别标记为“100”，“10”和“1”），另外3支试管的1组作为对照（controls）。（剩余2支试管分别标记为“A”和“B”）。
向标记“100”的一组3支试管和第四支试管（A）里，各加入1mL样品溶液或悬液，混匀。然后从试管（A）里取出1mL加入到剩下的试管（B）里，混匀。这两支试管（A、B）分别含有样品100mg（或100ul）和10mg（或10ul）。
然后从试管（A）里取出1mL溶液分别加入到第二组标记“10”的3支试管里，从试管（B）里取出1mL溶液分别加入到第三组标记“1”的3支试管里。丢弃试管A和B里未使用的溶液。盖上试管口，培养所有的试管。培养结束后观察试管内的生长情况：
3支对照试管应保持澄清；含样品溶液的试管，根据表1的计数规则，对每克或每mL样品可能含有的微生物数量进行计数。
表1多管法(Mulptiple-tube Method)的最可能细菌总数
每组试管里观察到生长情况的试管数量
每克或每mL样品最可能含有的微生物数量
每支试管里含有样品量mg（或mL）
100（100 uL）
10（10uL）
1（1 uL）
3
3
3
> 1100
3
3
2
1100
3
3
1
500
3
3
0
200
3
2
3
290
3
2
2
210
3
2
1
150
3
2
0
90
3
1
3
160
3
1
2
120
3
1
1
70
3
1
0
40
3
0
3
95
3
0
2
60
3
0
1
40
3
0
0
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金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法
向样品中加入液体大豆酪蛋白消化物培养基至100mL，混匀后培养。然后检查培养基生长情况。如果有生长情况，用接种环挑取少许在Vogel-Johnson （或Baire-parker、或Mannitol-Salt）琼脂培养基上划线接种，以及溴棕三甲铵琼脂培养基。各涂布一个平皿。盖上皿盖倒置培养。若培养后培养基上未发现具有表2和表3所列出的培养物特征的菌落生长，则可判断此样品不含有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

表2 金黄色葡萄球菌在选择性琼脂培养基上的微生物学特征
选择性培养基 菌落的微生物学特征 革兰氏染色
Vogel-Johnson琼脂培养基 黄色圈围绕的黑色菌落 阳性球菌（群生）
Mannitol-Salt琼脂培养基 黄色圈围绕的黄色菌落 阳性球菌（群生）
Baird-Parker琼脂培养基 黑色，有光泽，周围有2~5mm透明圈 阳性球菌（群生）

表3铜绿假单胞菌在选择性和诊断性琼脂培养基上的微生物学特征
选择性培养基 菌落的微生物学特征 紫外荧光反应 氧化酶试验 革兰氏染色
溴棕三甲铵琼脂培养基 通常为绿色 绿色 阳性 阴性杆菌
假单胞菌琼脂培养基 检测荧光生二氢荧光素,通常为五色或黄色 黄色 阳性 阴性杆菌
假单胞菌琼脂培养基 检测绿脓菌溶素,通常为绿色 蓝色 阳性 阴性杆菌

凝固酵素检查（Coagulase Test）金黄色葡萄球菌-用接种环从Vogel-Johnson （或Baire-parker、或Mannitol-Salt）琼脂培养基表面挑取典型的可疑菌落，每个菌落分别接种到单独的试管，试管内含有0.5mL兔或马血浆，有或没有任何附加（设施），37℃水浴，每3小时或其他适宜的时间间隔观察一次生长情况，直到24小时。阳性和阴性对照同时进行培养。如果没有发现任何程度的凝结，判断样品符合金黄色葡萄球菌检查。
氧化酶和色素检查（Oxidase and Pigment Tests）铜绿假单胞菌-用接种环从溴棕三甲铵琼脂培养基表面挑取典型的可疑菌落接种到检测荧光生二氢荧光素假单胞菌琼脂培养基和检测绿脓菌溶素假单胞菌琼脂培养基表面，每个可疑菌落分别接种。若需要接种的菌落数太多，可对接种的平皿表面进行分区，每个区域接种一个可疑菌落。然后将培养皿于35℃倒置培养不少于3天。用紫外光扫描菌落表面，观察是否有表3所列的特征。
通过氧化酶检查法确认可疑的菌落是否是铜绿假单胞菌。在菌落培养物上/或将菌落培养物转移到预先浸润了N, N-dimethyl-p phenylenediamine dihydrochloride的滤纸：如果没有出现粉色变为紫色，证明样品符合未检出铜绿假单胞菌的要求。必要时还可以使用其他适宜的途径和生化试验来检定铜绿假单胞菌。

沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法
将样品放入适宜的容器，加入液体乳糖培养基至100mL，培养。然后检查培养基生长情况，若发现生长物，混合并轻柔振荡培养液，用吸管分别吸取1mL，各加入到10mL液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基和液体连四硫酸盐培养基中，混匀培养12~24小时观察结果。（同时需保留液体乳糖培养基残余培养液。）
沙门氏菌属检查（Test for Salmonella Species）-用接种环从液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基和液体连四硫酸盐培养基中挑取培养物，分别划线接种到亮绿琼脂培养基、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基和亚硫酸铋琼脂培养基表面。倒置培养，如果未发现表4所列出的特征菌落，判断样品符合未检出沙门氏菌属的要求。

表4 沙门氏菌属在选择性琼脂培养基上的微生物学特征
选择性培养基 菌落的微生物学特征
亮绿琼脂培养基 细小，透明、无色或粉色到白色不透明（常有粉色或红色环带）
戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基 红色，有或无黑色中心
亚硫酸铋琼脂培养基 黑色或绿色

如果有表4所描述的菌落且经革兰氏染色呈阴性杆菌，则需要对可疑菌落进行进一步的检测。用接种针穿刺接种培养物到三糖-铁-琼脂培养基试管斜面下，培养。如果没有试管出现碱性（红色）或酸性（黄色）端头（有或没有伴随氢化硫黑色物质），则判断样品符合未检出沙门氏菌属的要求。
大肠埃希氏菌检查（Test for Escherichia coli）-用接种环从液体乳糖培养基残余培养液挑取培养物接种到麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上。倒置培养。观察结果，若未发现符合表5所列出的微生物学特征的菌落，则判断样品符合未检出大肠埃希氏菌的要求。

表5 大肠埃希氏菌在麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上的微生物学特征
革兰氏染色 菌落的微生物学特征
阴性杆菌(球杆菌) 红色块状物；可能有汁类沉淀环

如果发现符合表5所描述的菌落，需要进行进一步试验。
将可疑菌落用接种环挑取接种到Levine曙红亚甲基蓝琼脂培养基平皿上，每个菌落接种一个平皿。若需要接种的菌落数太多，可对接种的平皿表面进行分区，每个区域接种一个可疑菌落。倒置培养。如未发现有典型的金属光泽反射并在脉冲光线下无蓝黑色现象，则判断该样品符合未检出大肠埃希氏菌的要求。大肠埃希氏菌的存在情况还可以使用进一步适宜的途径和生化试验来证明。

Total Combined Molds和酵母菌总数检查 (Total Combined Molds and Yeasts Count)
采用好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）下的平板法（Plate Method）进行检测。培养基需使用同样体积的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基代替大豆酪蛋白消化物培养基，并且应在20~25℃培养5~7天。

复测 (Retest)
若按之前的任一方法取10.0g样品进行检测得到的结果有可疑，应另取25.0g样品进行复测。 仍按“操作步骤（Procedure）”的方法进行操作，但应根据加大后的样品量进行相应放大。

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