水稻发芽率测定中污染性微生物的鉴定及多样性.pdf

为探明可能影响水稻（Oryza sativa L.）种子发芽率测定结果的污染性微生物种类，对来自广东省种子质量监督检验工作中抽检的8份水稻种子样品在萌芽过程中产生的发霉状污染物进行了高通量测序与微生物种类鉴定。结果表明，这些样品在发芽率测定试验中所产生的污染性细菌来自20个门35个纲71个目104个科208个属，其中变形菌门（Proteobacteria）为优势门类，其平均相对丰度为63.2%，-变形菌纲（Gammaproteobacteria）为纲水平上的优势类群（占48.2%），而梭菌属（Clostridium，占20.2%）、伯克氏菌属（Burkholderia，占 18.0%）、肠杆菌属（Enterobacter，占 7.5%）、克雷伯氏菌属（Klebsiella，占 5.1%）为平均相对丰度较高的4个属；上述水稻种样品产生的污染性真菌含有7个门17个纲37个目61个科85个属87个种，其中子囊菌门（Ascomycota）和毛霉门（Mucoromycota）的平均相对丰度分别为 59.0%和 18.5%，散囊菌纲（Eurotiomycetes，占 42.0%）、毛霉纲（Mucoromycetes，占 18.5%）和粪壳菌纲（Sordariomycetes，占12.9%）为平均相对丰度较高的3个纲，曲霉属（Aspergillus，占38.4%）、根霉属（Rhizopus，占18.5%）和镰孢菌属（Fusarium，占 9.0%）为含量较高的 3 个属，黄曲霉（Aspergillus flavus，占 31.6%）和小孢根霉（R.microsporus，占16.4%）2个种约占污染性真菌总量的1/2。关键词：水稻（Oryza sativa L.）种子；发芽率测定；污染性微生物；多样性；鉴定中图分类号：S511；S432.4文献标识码：A文章编号：0439-8114（2023）07-0051-06DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2023.07.009开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Identification and diversity of the contaminative microorganismsin germination rate test of rice seedsXIAO Wan-yu1，SUN Yi-jia1，ZHOU Xian-yu1，REN Hai-long1，ZHANG Jing1，HUANG Jiang-hua2，XU Dong-lin1（1.Guangzhou Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510335，China；2.College of Agriculture and Biology，Zhongkai University ofAgriculture and Engineering，Guangzhou 510230，China）Abstract：To understand the diversity of contaminative microorganisms that may affect the result of rice（Oryza sativa L.）seed germination rate test，high-throughput sequencing and taxonomic identification for the moldy pollutants produced during the test were carried out on eight rice seed samples collected from the annual seed quality inspection task in Guangdong Province，China.The resultsshowed that a total of 208 genera，104 families，71 orders，35 classes，and 20 phyla of bacteria were identified from the moldy pollutants，with Proteobacteria as the dominating phylum whose average relative abundance was 63.2%，and Gammaproteobacteria as thedominating class（average relative abundance：48.2%）.Clostridium，Burkholderia，Enterobacter and Klebsiella were the four mostabundant bacterial genera whose average relative abundances were 20.2%，18.0%，7.5%and 5.1%，respectively.On the other hand，a total of 87 species，85 genera，61 families，37 orders，17 classes，and 7 phyla of fungi were identified in the aforementioned moldypollutants.Ascomycota and Mucoromycota represented 59.0%and 18.5%，respectively，of the fungal community.Eurotiomycetes（42.0%），Mucoromycetes（18.5%）and Sordariomycetes（12.9%）were the three most abundant fungal classes，whereas Aspergillus（38.4%），Rhizopus（18.5%）and Fusarium（9.0%）were the three most abundant genera.Furthermore，Aspergillus flavus（averagerelative abundance：31.6%）and Rhizopus microsporus（average relative abundance：16.4%）made up near one half of the fungal abundance.Key words：rice（Oryza sativa L.）seed；germination rate test；contaminative microorganisms；diversity；identification湖北农业科学2023 年水稻（Oryza sativa L.）是中国种植面积最广的粮食作物，为了确保使用优良的水稻种子，实现优产、高产，用种前需对其进行种子质量检验。发芽率是反映种子质量的一个关键指标，在种子质量监督检验工作中是必检的项目。根据 农作物种子检验规程发芽试验（GB/T 3543.41995），水稻种子发芽率测定历时 14 d。在此过程中，常出现受检种子和/或幼苗因本身携带各类病原菌1，2或受环境中的微生物污染而出现发霉、腐烂的现象，可能对测定结果的准确性产生较大影响，需重做测定。探明水稻种子样品萌芽过程中可能出现的污染性微生物的种类，对于在发芽率测定前对种子样品进行适宜的预处理（如消毒、灭菌等），提高种子质量检验的结果准确性和工作效率，以及筛选健康种子、预先避免水稻种传病害的发生，均具有参考价值。本研究挑选广东省种子质量监督抽检的 8份水稻种子样品，采用微生物培养与高通量测序分析等方法，对其在发芽率测定过程中产生的污染性微生物的种类进行了鉴定，以期为水稻种子质量控制及种传病害预防提供理论依据。1材料与方法1.1种子样品供试水稻种子 8份，来自 2021年广东省种子质量监督检验中的抽检样品，其编号分别为sd1（华航48号）、sd2（软华优1179）、sd3（富两优236）、sd4（深优 9516）、sd5（广泰优华占）、sd6（泰丰优 208）、sd7（恒丰优华占）、sd8（裕优 9822）。上述种子样品均来自市售的小包装（每包 500 g）商品，包装完好，种子无包衣，开始本试验时保质期限均大于6个月，抽样后于20 下干燥保存。1.2种子萌发及污染性微生物样品采集对上述种子样品按照农作物种子检验规程（GB/T 35431995）中的要求进行净种子分离和发芽率试验。对每份样品随机选取400粒净种子（100粒4个重复），置于1张湿润的滤纸上，放入发芽盒中，在光照培养箱（30，12 h光照12 h黑暗）内保湿培养14 d后，按GB/T 3543.41995中的方法测定发芽率（正常幼苗数/置床种子总数100%），并观察幼苗的污染情况。萌芽结束后，在生物安全柜中用灭过菌的金属样品勺将发芽盒中幼苗根部和/或发芽纸上出现的发霉样污染物刮下，每份种子样品（4个发芽盒）中的污染物合并溶解于 20 mL灭菌双蒸水中，所得溶液保存于-20 备用。在本研究中，把sd1sd8在萌芽过程中产生的污染性微生物分别命名为样品SD1SD8。1.3污染性微生物种类鉴定将污染物样品 SD1SD8 经干冰运输交由南京派森诺基因科技有限公司进行总DNA提取、PCR 扩增与高通量测序。采用FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒（美国 MP Biomedicals）对污染性微生物菌液进行总 DNA 提取，并以 NanoDrop 2000 型分光光度计进行纯度与浓度检测。以所得总DNA为模板，采用真菌ITS1区通用引物5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 与 5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3对样品中所含的真菌 DNA进行扩增，采用细菌 16SrDNA V3-V4 区 通 用 引 物 5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3 与 5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3（H=A/C/T，V=A/C/G，W=A/T）对样品中所含的细菌 DNA 进行扩增。所得扩增产物按标准流程进行文库建库并经Illumina Miseq/Hiseq平台进行高通量测序。测序完成后，所得原始数据经去除接头及引物序列、paired-end序列拼接，再按barcode标签序列识别并区分各样品的测序结果，最后对序列数据进行质控过滤，得到各样品的有效测序数据。采用Usearch 软 件（http：/ taxonomic units）对所有非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，获得各个OTU的代表序列。通过 GenBank BLAST 比对，按相似度90%且 coverage90%的标准筛选用于后续分类的 OTU序列（不满足该条件的序列被归为“unclassified”），再采用 RDP classifier 贝叶斯算法对 97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，鉴别每个OTU对应的物种分类信息。细菌 16S rDNA 片段采用 RDPclassifier 比对 RDP 数据库，真菌 ITS 片段序列使用Blast 比对 UNITE 数据库，最终分别在门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）等分类阶元上统计各样本的群落组成。采用 Mothur 软件计算各样品中微生物群体的丰富度指数（Chao1和 ACE）、多样性指数（Shannon和 Simpson）及测序文库覆盖率（Coverage）。2结果与分析2.1种子样品的发芽率及污染率置床培养 14 d 后，样品 sd1sd8 的发芽率为77%89%，其中2个样品（sd3为79%，sd6为77%）发芽率低于 GB 4401.11996中规定的国家质量标准（80%），但在使用容许误差（5%）下可判定为合格。8个样品的发霉率为5%13%，表现为死种子或腐烂幼苗，表明污染性微生物可对部分水稻种子样品的发芽率测定结果产生较大影响。52第 7 期2.2污染性细菌的群落结构经对测序结果进行序列优化和 OTU 聚类，从 8份水稻种子萌芽过程中产生的污染性微生物样品（SD1SD8）中获得 83 282129 765 条细菌 DNA 序列，合为7171 517个OTU，8个样品共获得5 352个不同的细菌OTU（表1）。采用RDP classifier对这些OTU进行分类学分析，结果表明，8个样品所含有的分类地位明确的细菌共来自20个门35个纲71个目104个科208个属（表1）。根据Shannon指数的计算结果，SD4的细菌群体多样性最高，SD5的多样性最低；根据Chao1及ACE指数的计算结果，SD4的细菌群落丰富度最高，SD1次之，SD5和SD7的群落丰富度较低，与群体多样性的比较结果基本一致（表1）。从群落丰富度最高的样品 SD4中鉴定到明确的门、纲、目、科的数量并非最多（但鉴定到的明确属数量最多），群落丰富度最低的样品 SD5 中含有的明确门、纲、目、科、属数量也均非最少（表1）。在 8 个样品（SD1SD8）中平均相对丰度大于1%的细菌有 4 个门，分别为变形菌门（Proteobacteria，占 63.2%）、厚壁菌门（Firmicutes，占 25.2%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，占 8.0%）和放线菌门（Actinobacteria，占 1.8%）（图 1），其中在 SD8中变形菌门占79.3%。在纲水平上，-变形菌纲（Gammaproteobacteria）在 8 个 样 品 中 均 为 优 势 类 群（占 38.6%57.6%），-变形菌纲（Alphaproteobacteria）在 SD3和SD8中（分别占18.8%和21.6%）、梭菌纲（Clostridia）在其他6个样品中（占13.4%41.7%）为相对丰度次高的类群。在目水平上，-变形菌目（Betaproteobacteriales）和梭菌目（Clostridiales）各自在 4个样品中为优势类群，肠杆菌目（Enterobacteriales）在 5 个样品中为相对丰度次高的类群，这 3个目的相对丰度合计约占细菌总量的2/3。在科水平上，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）依次为平均相对丰度最高的3个类群，合计约占细菌总量的2/3。在属水平上，梭菌属（Clostridium）、伯克氏菌属（Burkholderia）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）依次为平均相对丰度排名前 4 的 4 个类群（占5.1%20.2%），合计占细菌总量的1/2以上（图1）。2.3污染性真菌的群落结构基于测序结果的 OTU 聚类显示，从 8 份水稻种子污染物样品（SD1SD8）中分别获得 114 758129 029条真菌 DNA序列，合为 24245个 OTU，8个样品共获得355个不同的真菌OTU。采用RDP classifier对这些OTU进行分类学分析，结果表明，8个样品所含有的分类地位明确的真菌共来自7个门17个纲 37 个目 61 个科 85 个属 87 个种（表 1）。根据Shannon指数的计算结果，SD1的真菌群体多样性最高，远高于其他7个样品，SD2和SD6的多样性较低；根据 Chao1 及 ACE 指数的计算结果，SD1 的真菌群落丰富度最高，远高于其他7个样品，SD6的真菌群落丰富度最低；从样品 SD1中鉴定到明确的各级分表1水稻发芽率测定过程中产生的污染性微生物群落的多样性类型细菌真菌样品名称SD1SD2SD3SD4SD5SD6SD7SD8总计SD1SD2SD3SD4SD5SD6SD7SD8总计序列条数94 811111 10683 28286 993129 765100 151105 56094 687806 335123 123121 114121 881121 650124 527129 029118 911114 758974 993OTU个数1 0851 0309681 5177178957751 0545 35224545393941243033355Shannon指数6.356.136.197.024.725.415.085.816.341.792.713.052.271.813.223.48Simpson指数0.960.940.970.970.860.930.890.910.970.510.790.830.630.570.860.88Chao 1指数1 109.911 071.15975.401 531.92734.88921.96798.281 067.74245.045.2439.1139.441.024.030.033.0ACE指数1 063.5993.0965.71 506.9675.8870.5749.61 035.2245.044.839.038.941.024.030.033.0测序覆盖率1.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.00分类阶元数量/相对丰度1%的分类阶元数量门11/518/412/515/512/411/313/513/520/47/34/23/24/22/23/24/12/27/3纲20/729/621/724/623/620/518/721/735/616/66/25/36/35/46/36/24/317/5目52/960/844/953/960/654/844/854/871/1032/811/27/39/38/46/37/25/337/5科74/884/863/1079/1086/677/861/874/10104/1051/613/311/39/311/58/38/35/361/6属137/9152/8114/9158/10156/6140/6104/6134/8208/1065/615/313/310/313/510/39/47/385/7种61/518/314/310/416/612/49/46/387/7肖婉钰等：水稻发芽率测定中污染性微生物的鉴定及多样性53湖北农业科学2023 年类阶元的数量也最多（表1）。在样品 SD1SD8中平均相对丰度大于 1%的 3个真菌门为子囊菌门（Ascomycota，占 59.0%）、毛霉门（Mucoromycota，占18.5%）和担子菌门（Basidiomycota，占1.6%）（图2），其中子囊菌门在SD5和SD6中占比高达 94.4%和 96.8%。在纲、目水平上，散囊菌纲（Eurotiomycetes）及其下属惟一的散囊菌目（Eurotiales）在SD2、SD5和SD6中占比高达74.0%83.0%，在SD7中也是优势类群（占47.0%）；毛霉纲（Mucoromycetes）下惟一的目类毛霉目（Mucorales）在 SD4中占 66.0%，在 SD3 和 SD8 中亦为优势类群（分别占37.0%、18.0%）；粪壳菌纲（Sordariomycetes）及其下属的肉座菌目（Hypocreales）为 SD1中的优势类群，分别占12.9%和13.2%。在目以下，散囊菌目下的曲霉科（Aspergillaceae，平均占 40.7%）、曲霉属（Aspergillus，平均占 38.4%）、黄曲霉（Aspergillus flavus，平均占31.6%）为优势类群或种类；毛霉目下的根霉科（Rhizopodaceae，平均占18.5%）、根霉属（Rhizopus，平均占18.5%）以及后者下属的小孢根霉（Rhizopus microsporus，平均占16.4%）为优势类群或种类；肉座菌目下的丛赤壳科（Nectriaceae）、镰孢菌属（Fusarium）平均相对丰度分别为9.3%和9.0%，为优势类群（图2）。GroupSD1SD2SD3SD4SD5SD6SD7SD8o_Enterobacteriales f_Enterobacteriaceaeg_Klebsiella5.1%19.8%19.8%g_Enterobacter7.5%c_Gammaproteobacteriag_Herbaspirillum2.7%o_Betaproteobacteriales f_Burkholderiaceaeg_Burkholderia18.0%25.3%25.3%g_Achromobacter2.0%p_Proteobacteria63.2%f_Xanthobacteraceae48.2%o_Rhizobiales1.5%f_Rhizobiaceae1.9%f_Beijerinckiaceaec_Alphaproteobacteria o_Sphingomonadales1.4%f_Sphingomonadaceae13.8%5.1%3.6%o_Azospirillales3.6%f_Azospirillaceaeg_Azospirillum2.8%2.8%2.8%o_Sphingobacteriales f_Sphingobacteriaceaerg_Sphingobacterium2.6%4.8%4.8%g_Mucilaginibacter2.2%p_Bacteroidetesc_Bacteroidia8.0%8.0%o_Cytophagales1.4%c_Clostridiao_Clostridialesf_ClostridiaceaeBacteriag_Clostridium21.4%21.4%21.2%20.2%p_Firmicutes25.2%c_Bacillio_Bacillalesf_Paenibacillaceae3.7%3.7%2.3%p_Actinobacteriac_Actinobacteria o_Corynebacteriales1.8%1.8%1.3%图1水稻发芽率测定过程中产生的污染性细菌优势类群（平均相对丰度1%）54第 7 期3讨论本研究对8份市售水稻种子样品在发芽率测定过程中产生的污染性真菌与细菌群体进行了分子鉴定，结果发现了来自20个门208个属的细菌以及来自7个门85个属的至少87种真菌，表明水稻种子上的污染性微生物具有丰富的多样性。农作物种子的污染性微生物有多种鉴定方法，如保湿培养后对长出的菌体进行镜检2，将种子洗涤液置于真菌、细菌培养基进行微生物分离培养1、PCR 或免疫学检测等3。这些方法都难以对种子所携带的微生物种类“能检尽检”，尤其是丰度较低的种类。本研究首次对水稻种子和幼苗周围产生的发霉状污染物进行了高通量测序，可充分揭示水稻种子所携带微生物群体的多样性，较之前的研究中仅鉴定到数量较少的微生物种类4-6，本研究所得结果丰富了该方面的成果。此外，本研究鉴定了水稻种子在长达14 d（从萌发与幼苗期）的发芽率测定过程中产生的污染性微生物，而非仅鉴定种子初始（萌发前）的污染性微生物，对探明影响水稻种子发芽率结果的因素以及种子检验制订质控措施更具参考意义。本研究结果表明，微生物污染有可能影响水稻种子发芽率的合格性判定，而在测定试验前先对种子进行消毒能杀灭哪些污染性微生物，对发芽率测定结果有何影响，有待进一步研究。本研究从水稻种子污染物中鉴定到梭菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等细菌优势类群。其中梭菌属为一大厌氧革兰氏阳性细菌类群，广泛分布于自然界，主要存在于土壤、污水和人畜肠道中，有些种类可产生毒素，能引致人或家畜疾病7，8。伯克氏菌属有少数种可引起人或动物鼻疽病，有些种是植物病原物（其中 Burkholderia glumae可引致水稻细菌性穗枯病）或内生菌，还有部分种类是有助于植物吸收营养、促进生长及拮抗病害的益生菌9，10。肠杆菌属有多个种可引致植物病害11，但也有一些种类可提高植物抗逆性并修复重金属污染的土壤12，13。克雷伯氏菌属细菌广泛存在于环境中，可寄生于人和动物的上呼吸道和胃肠道，或在植物、土壤和地表水等中生存，有些种类可作为固氮菌促进植物生长，有些种类则是食源性致病菌；该属的模式种肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）既可污染蔬菜、食物并引致人类肺炎及消化道疾病等，也可在玉米、香蕉、高粱等多种农作物上引致病害14，15；此外也有该属细菌帮助植物提高抗逆性的报道16。由于根据细菌 16S rDNA序列难以准确鉴定到种，所以尚不明确本研究中水稻种子可能携带的上述各属细菌是否为水稻病原菌，但对种子消毒处理可防止潜在水稻病害的传播。本研究从水稻种子污染物中鉴定到曲霉属、根霉属和镰孢菌属等真菌优势类群，黄曲霉和小孢根霉这2个优势种，其相对丰度分别为31.6%和16.4%；此外还检出黑曲霉（Aspergillus niger）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、新月弯孢霉（CurvulariaSD1SD2SD3SD4SD5SD6SD7SD8Groupo_Xylarialesf_Microdochiaceaeg_Microdochiumc_Sordariomycetes2.1%2.1%2.1%12.9%o_Hypocrealesf_Nectriaceaeg_Fusarium9.0%9.3%9.5%g_Penicilliumf_Aspergillaceae2.3%p_Ascomycota40.7%59.0%g_Aspergillusc_Eurotiomyceteso_Eurotiales38.4%f_Pleosporaceae42.0%41.9%f_Trichocomaceaeg_Talaromyces1.2%1.2%c_Dothideomycetes o_Pleosporales1.1%g_Curvularia3.9%3.4%2.3%2.2%p_Mucoromycotac_Mucoromyceteso_Mucoralesf_Rhizopodaceaeg_Rhizopus18.5%18.5%18.5%18.5%18.5%p_Basidiomycotac_Tremellomycetes1.6%Fungi图2水稻发芽率测定过程中产生的污染性真菌优势类群（平均相对丰度1%）肖婉钰等：水稻发芽率测定中污染性微生物的鉴定及多样性55湖北农业科学2023 年lunata）等种，其平均相对丰度为 2.1%3.1%。由黄曲霉产生的黄曲霉素是粮油作物及制品上常见的强致癌性毒素，黑曲霉是储藏稻谷中的优势菌群，其部分株系可产生有害人体健康的赭曲霉毒素 A17，18；小孢根霉、少根根霉（又称稻根霉，Rhizopus oryzea）等根霉属种类广泛存在于土壤、植物叶脉或食品中，可引致水稻立枯病、玉米根腐病、向日葵烂盘型菌核病等19-21；草酸青霉对马铃薯霜霉菌、苹果镰孢菌等具有拮抗作用22，23；新月弯孢霉可侵染水稻、玉米、小麦等多种作物，可在水稻上引致叶斑病24，25。本研究鉴定到的优势细菌及真菌类群中既有植物病原菌也有益生/生防菌，研究它们在田间生境中的共存与互作将有助于深入了解相关植物病害的流行规律，为病害防治提供有益参考。参考文献：1刘西莉，李健强，朱春雨，等.不同水稻品种种子带菌检测及药剂消毒处理效果 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