微生物学实验教学大纲-《工业微生物学实验》实验教学.docx

微生物学实验技术实验教学大纲一、课程的性质与任务 微生物学实验是配合微生物教学开设的一门培养学生动手能力和综合素质的实验课程，通过实验使学生加深对所学知识的理解和掌握，使学生掌握微生物实验技术的基本操作和技能，同时使学生初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的学科前沿接轨。 二、 实验目的与基本要求 1. 掌握观察、培养微生物的基本操作和技能。包括：显微镜的使用、无菌操作、培养基的配制和灭菌。 2. 掌握常用微生物的染色方法，进一步掌握植物病源微生物的鉴定和分类。 3. 通过实验加深对植物病源细菌、真菌的形态、大小及二者之间的差别。 4. 根据所学知识和技能，能够自行设计微生物实验。 5. 利用微生物的生理生化反应鉴别植物病源微生物。三、实验考核方式及办法实验成绩评定方法：实验课成绩单独按五级分记录考试成绩。凡实验成绩不及格者，该门课程必须重修。学生的实验成绩应以平时考查为主，一般应占总分的70%，其平时成绩又要以实验实际操作的优劣作为主要考核依据。在学期末或课程结束时，为复习和巩固实验教学内容，进一步对学生作补充了解，也可举行一定的实验操作考试，但无论采取何种方式进行考核，都必须按实验课的目的要求，以实际实验工作能力的强弱作为评定成绩的主要依据。因此，最终的集中考试结果只能占总成绩的30%。评定各级成绩时，可参考以下标准：（一）优秀（很好）能正确理解实验的目的要求，能独立、顺利而正确地完成各项微生物实验操作，会分析和处理实验中遇到的问题，能掌握所学的各项实验技能，能较好地完成实验报告及其它各项实验作业，有一定创造精神和能力。有良好的实验室工作作风和习惯。（二）良好（较好）能理解实验的目的和要求，能认真而正确地完成各项实验操作，能分析和处理实验中遇到的一些问题。能掌握所学实验技能的绝大部分，对难点较大的操作完成有困难。能一般完成实验报告和其它实验作业。有较好的实验习惯和工作作风。（三）中等（一般）能粗浅理解实验目的要求，能认真努力进行各项实验操作，但技巧较差。能分析和处理实验中一些较容易的问题，掌握实验技能的大部分。有30%掌握得不好。能一般完成各项实验作业和报告。处理问题缺乏条理。工作作风较好。能认真遵守各项规章制度。学习努力。（四）及格（较差）只能机械地了解实验内容，能一般按图、或按实验步骤“照方抓药”完成实验操作，能完成60%所学的实验技能，有些虽作但不准确。遇到问题常常缺乏解决的办法，在别人启发下能作些简单处理，但效果不理想。能一般完成实验报告，能认真遵守实验室各项规章制度，工作中有小的习惯性毛病（如工作无计划，处理问题缺乏条理）。（五）不及格（很差）盲目地“照方抓药”，只掌握50%的所学实验技能。有些实验虽能作，但一般效果不好，操作不正确。工作忙乱无条理。一般能遵守实验室规章制度，但常有小的错误。实验报告较多的时候有结果，遇到问题时说不明原因，在教师指导下也较难完成各项实验作业。或有些小聪明但不努力，不求上进。四、实验报告要求实验完毕，应用专门的实验报告纸，根据预习和实验中的现象及数据记录等，及时而认真地写出实验报告。微生物学实验报告一般包括以下内容：实验（编号） 实验名称（一）实验目的（二）实验原理（三）主要试剂和仪器 列出实验中所要使用的主要试剂和仪器。（四）实验步骤 应简明扼要地写出实验步骤流程。（五）实验数据及其处理 应用文字、表格、图形、将数据表示出来。根据实验要求及计算公式计算出分析结果并进行有关数据和误差处理，尽可能地使记录表格化。（六）问题讨论 包括实验教材上的思考题和对实验中的现象、产生的误差等进行讨论和分析，尽可能地结合分析化学中有关理论，以提高自己的分析问题、解决问题的能力，也为以后的科学研究打下一定的基础。五、实验项目一览表 微生物学实验项目一览表序 实验项目 实验 实验 适用 学号 名称 类型 要求 专业 时1 细菌的单染色法和革兰氏染色法 验证性 必做 生物类 42 细菌的芽孢染色和鞭毛染色 验证性 必做 生物类 43 植物病源微生物的形态观察 综合性 必做 生物类 44 植物病原细菌及其所致病害症状观察 综合性 必做 生物类 45 植物病原菌物一般形态和接合菌门真菌基本形态及所致病害观察 综合性 必做 生物类 46 担子菌门真菌的基本形态及所致病害的观察 综合性 必做 生物类 47 有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的观察 综合性 必做 生物类 48 病原物的分离培养与接种 综合性 必做 生物类 49 植物的抗病性和病原菌的生理分化 设计性 必做 生物类 4六、实验项目的具体内容： 实验一 细菌的单染色法和革兰氏染色法1、目的、 1）掌握显微镜油镜正确使用方法； 2）学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色法和革兰氏染色法；3) 单染色法注意固定时不能烤，水洗水流不宜大急； 4) 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色的程度；涂片要薄，否则影响脱色；菌龄也影响染色结果，掌握好染色的时机。2、内容、材料和方法细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐(methylene blue chloride，缩写为M B C)；它可被电离成正、负离子：M B Cmethylene blue+ chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)、碱性复红(basic fuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家CGram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。 革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂-碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)； 实验步骤（一）细菌的简单染色1、涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。2、干燥 将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。 3、固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料； 4、染色 玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染0.5-1min。 5、水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6、干燥 自然干燥或用吸水纸 盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。 7、镜检 用油镜观察并绘出细菌形态图。 8、清理 实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。（二）细菌的革兰氏染色 1、 涂片 在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。 2、 固定 将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。3、 染色初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。 脱色 滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。 复染 滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。 4、镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G+)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。实验二 细菌的芽孢染色和鞭毛染色1、目的、（1）学习并掌握芽孢染色法。（2）学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。（3）学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。2、内容、材料和方法细菌的特殊结构有芽孢、荚膜和鞭毛等，对于它们的显微镜检查必须用特殊染色方法，才能获得良好的效果。细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透明状)。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察细菌的鞭毛极细，直径一般为10-20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理雷同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成 菌种 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis )，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）； 实验步骤 （一）细菌芽孢染色（1）取菌种分别制片，固定。（2）在涂片部分用吸水纸条盖住，然后向纸条滴加孔雀绿液至饱和。（3）将涂片逐渐加热至冒蒸汽并不时添加染液以防止吸水纸条干燥。染色28分钟。（4）除去吸水纸条，用蒸馏水轻轻冲洗掉多余染液。（5）用藏花红染液复染3060秒。（6）水洗，风干后油镜镜检。 （二）细菌鞭毛染色（1）用长滴管取无菌水轻轻移入长好菌种的试管内，培育30分钟左右，使细菌自己慢慢游入水中并充分舒展其鞭毛。（2）取一滴菌悬液于玻片的1/3位置上，然后轻轻抬起此端，使菌悬液缓慢流至玻片另一端，平放让其在空气中自然干燥固定。切忌用火焰烘干。（3）在涂片部位滴甲液，染色3-5分钟。（4）用蒸馏水轻轻冲洗。（5）加乙液染30-60秒，可在酒精灯上稍稍加热，冲洗多余的染液。（6）制片干后油镜检查。实验三 微生物的形态观察1、目的（1） 掌握观察放线菌、酵母菌和霉菌形态的基本方法及形态特征； （2） 观察并掌握放线菌、酵母菌和霉菌的菌落特征及菌丝构成； （3） 学会区别放线菌、酵母菌和霉菌的菌落及形态特征。 2、内容、材料和方法和细菌的简单染色一样，放线菌也可用石炭酸复红或吕氏碱性美蓝染料着色后，在显微镜下观察其形态。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片的基本相同，使放线菌生长在玻璃纸琼脂平皿上，将长有放线菌的玻璃纸压印在载玻片上，最容易印在玻片上的是处于菌体生长先端、且易于脱落的孢子；其次是孢子丝；在印片较深时，也有少量气生菌丝被印上。经固定、染色后，用显微镜即可观察到放线菌自然生长的个体形态。 放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝)和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：(a)细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；(c)溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。为了观察霉菌清晰、完整、保持自然状态的形态，可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。 霉菌的营养体是分枝的丝状体，细胞的平均宽度是3-10微米，比细菌要宽得多，所以，显微镜检查时，只要放大400-500倍，甚至放大100倍就可以看清楚。酵母菌是单细胞真菌，其菌落相似于细菌菌落，宽度在5m左右。需在显微镜下才能观察。通过特殊染色，可观察到细胞内部结构。 菌种 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisieae)；曲霉(Aspergillus sp)，青霉(Penicillium sp)，根霉(Rhizopus sp)，毛霉(Mucor sp)；泾阳链霉菌（Streptomyces jingyangensis） 实验步骤 （1）在低倍（或高倍）镜下直接观察孢子丝的形状，可直接将培养皿放在低倍镜下找到菌落边缘，或切取菌落一部分放在载玻片上进行观察并记录。 （2）用印片法观察分生孢子。取一载玻片，在一个切下的菌落上轻轻接触一下，使菌落表面的孢子丝及孢子印在载玻片上，然后反转，使其在空气中干燥、固定。 （3）用美蓝染色1分钟，用水轻轻冲洗，干后油镜检查。 （4）取三片载玻片在中央分别滴美蓝染液、苏丹染液和碘液，用接种环取少量啤酒酵母菌涂于染液中，加盖玻片。 （5）在平皿内培养热带假丝酵母，待长出后在菌落上压一片无菌盖玻片，再培养12天，观察；或在高倍镜下直接观察。 （6）观察真菌的形态特征最好制成玻片培养菌，其步骤如下：A、用镊子自玻片缸中取出一片载玻片，通过火焰后，平放使其冷却。B、用石蜡凡士林在载玻片上做两条脊，使相距1cm（长度小于盖玻片的边长）。C、在脊上放好一无菌盖玻片。 D、趁培养基未凝固，用长吸管吸取少量孢子琼脂，转至载玻片上两条脊之间盖玻片下，使其在中间位置，不宜太多。 E、将此载玻片放在培养皿内的弯玻棒上，使棉球吸湿无菌水，盖好放在25温箱中培养，2-4天用显微镜观察。 F、将灭菌的培养皿中倒入10mL左右的PDA培养基，制成平板，分别点接黄曲霉、黑曲霉、产黄青霉、黑根霉，于25温箱中培养2-4天后用显微镜观察其菌落边缘。实验四 植物病原细菌及其所致病害症状观察1、目的 细菌是引起植物病害的又一类重要的病原生物，虽不象植物病原真菌种类那样繁多，但因其个体微小，形态差异不够明显，所致病害症状复杂，都给细菌病害的研究带来一定的困难，病原细菌的形态观察和分类鉴定需要特有的实验技术，通过本次实验，掌握植物细菌病害的分类鉴定需要特有的实验技术，熟悉植物细菌病害症状类型和病原细菌的基本形态，学习植物细菌病害简易诊断方法及病原细菌初步鉴定的程序和技术，为以后植物细菌病害的正确诊断和病原细菌的分类鉴定打下良好的基础。2、内容、材料和方法（1）植物细菌病害的症状观察植物细菌病害的症状常作为鉴定属的一种辅助性状，即症状类型和病原属之间有一定的相关性，如棒杆菌属的细菌主要引起萎蔫症状；假单胞杆菌属主要引起叶斑，腐烂和萎蔫症状；黄单胞杆菌属主要引起叶斑和叶枯症状；野杆菌属引起瘤肿等增生性症状；欧氏菌属一般引起软腐，有时也引起萎蔫。此外，多数细菌病害在发病初期，特别在潮湿的自然条件下常呈水浸状或油渍状；在饱和湿度下病斑上常有菌脓形成，干后成为菌痂，掌握症状类型(附1)及其形成的生态条件，对细菌病害的正确诊断是十分重要的。 观察下列病害标本，区分症状类型。水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae)棉花细菌角斑病(X.malvacearum)马铃薯环腐病(Clavibacter sepedonicum)白菜软腐病(Erwinia carotovora)黄瓜细菌角斑病(Pseudomonas lachrymans)苹果根癌病(Agrobacterium tumefaciens)大豆细菌性斑点病(P.glycinea)挑细菌性穿孔病(X.pruni)菜豆细菌性叶烧病(X.phaseoli)水稻条斑病(X.oryzicola) (2)植物细菌病害的简易诊断 植物细菌病害的诊断和病原鉴定是比较复杂的，初步诊断是根据症状特点和显微镜检查病组织中的细菌来完成的，细菌病害，除少数(如苹果根癌病)外，绝大多数能在受害部位的维管束或薄壁细胞组织中产生大量的细菌，并且吸水后形成菌溢，因此，镜检病组织中有无细菌的大量存在(菌溢的出现)是诊断细菌病害简单易行的方法。 取水稻白叶枯病新病叶，在病斑病健交界处剪取22 mm的小块病组织，放在载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖好盖玻片后，立即在显微镜下观察，注意叶组织维管束剪断处是否有大量的细菌，呈云雾状溢出，如将视野调暗观察更易见到，按同样方法用健康组织作镜检反证。实验五 植物病原菌物一般形态和接合菌门真菌基本形态及所致病害观察1、目的、认识菌物营养体和繁殖体的一般形态；认识菌物营养体的变态类型；无性繁殖和有性繁殖的孢子类型。认识接合菌门真菌的基本形态和分类依据。2、内容、材料和方法 （1）菌物的营养体 菌丝和菌丝体 菌丝组织体 菌核、子座和根状菌索。 菌丝体上分化出的吸收养分组织 a、吸器；b、假根；c、附着胞；d、菌环和菌网。(2)菌物的繁殖体孢子 无性孢子：游动孢子、孢囊孢子、分生孢子和厚垣孢子。 有性孢子：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子。 (3)接合菌门真菌 根足霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、笄霉属(Choanephora)、犁头霉属(Absidia)、毛霉目真菌异宗配合现象观察。 实验六 担子菌门真菌的基本形态及所致病害的观察1、目的 通过本次试验掌握担子菌的形态特征及担子菌所致病害的症状特点，为担子菌的分类和病害鉴定打下初步基础。2、内容、材料和方法认识担子菌门真菌担子果的类型，冬孢菌纲黑粉菌目的分科及重要病原菌的生活史，锈菌目的分科及重要病原菌的生活史。 （1）冬孢菌纲 黑粉菌目的主要属：黑粉菌属、条黑粉菌属、轴黑粉菌属、叶黑粉菌属、腥黑粉菌属、实球黑粉菌的病原菌形态和所致病害的症状观察。 锈菌目的主要属：双胞锈菌属、单胞锈菌属、多胞锈菌属、胶锈菌属、栅锈菌属和层锈菌属病原菌形态和所致病害的症状观察。（2）层菌纲外担子菌属、隔担耳属的病原菌形态和所致病害的症状观察。（3）腹菌纲马勃目竹荪的形态观察。实验七 有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的观察 1、目的 本实验的主要目的是熟悉有丝分裂孢子真菌的形态特征和分类概况，熟悉有丝分裂孢子真菌所致病害的基本症状，为有丝分裂孢子真菌的分类和病害鉴定打下良好的基础。 2、内容、材料和方法认识有丝分裂孢子真菌的基本形态和分类依据。 （1）丝核菌属、小核菌属的病原菌形态和所致病害的症状观察。 （2）粉孢属、梨孢属、轮枝孢属、葡萄孢属、尾孢属、链格孢属、黑星孢属、内脐蠕孢属、离蠕孢属、突脐蠕孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。 （3）镰刀菌属的病原菌形态和所致病害的症状观察。 （4）拟棒束孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。 （5）炭疽菌属、痂圆孢属、拟盘多毛孢属、盘二孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。 （6）叶点霉属、茎点霉属、大茎点霉属、壳针孢属、壳囊孢属、壳二孢属、色二孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。实验八 病原物的分离培养与接种1、目的 通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用方法，学习常用的接种方法，掌握根据柯赫氏法则鉴定植物病原物的方法。2、内容、材料和方法 （1）学习田间采样的方法。 （2）学习PDA培养基的制作方法、湿热灭菌方法、干热灭菌方法和无菌平皿的制作方法。 （3）学习病原物的组织分裂方法和稀释分离方法。 （4）学习喷雾、针刺、摩擦接种的方法并观察接种的结果。实验九 植物的抗病性和病原菌的生理分化1、目的利用和培育抗病品种，是防治病害的根本性措施，要搞好抗病育种工作，必须熟练掌握植物抗病性和病原物致病性分化的测定方法，病害的性质不同，其寄主抗病性和病原物生理分化测定的方法也不同。国内外，在水稻对稻瘟病的抗病性方面的研究很多，尤其是生理小种的鉴定工作，许多方法对水稻的研究都是适用的，对其他病害也可借鉴，在理论和实践上颇具代表性，因此选水稻稻瘟病作实验材料，学习植物抗病性鉴定和病原物生理分化测定的基本方法，以便为今后抗病育种工作打下坚实的基础。2、内容、材料和方法(1)繁殖菌种 进行抗病性鉴定，需要足够的菌量，故需对采集标本上的锈菌加以活化繁殖，菌量够用后即开始品种抗病性鉴定，繁殖菌种的方法如下：准备感病品种幼菌，盆播高感稻瘟病的品种。接种：在秧苗长出12片叶时即可接种，接种常用的方法：喷雾法：孢子量多时，可在三角瓶中洗下孢子，调成孢子悬浮液，用喉头喷雾器喷洒，配制孢子悬浮液时，先用少量水调成稠糊状，待孢子表面充分湿润后，再逐步加水稀释，以免孢子漂浮在水面上。为了提高接种效果接种前毛笔加石英砂去掉叶表面的蜡层，以利孢子悬浮液展着和病菌的侵入，方法是用姆指和食指蘸水少许，轻轻捏住叶片，自基部向上摩擦几次即可。保湿：稻瘟病病菌需要在叶面有水滴或水膜的高湿条件下方能萌发侵入，所以接种后必须在保湿框或保湿箱中保湿3548小时，方法是将小花盆放在保湿框中，罩上塑料布，塑料布外再缠上润湿的棉布，保湿过程中，保持1622的温度，对孢子的萌发侵入是很重要的条件。接种后管理a、光照：接过种的秧苗自保湿箱中取出后应放在有日光的地方，冬季在温室中一般还要给以辅助光照，辅助光照多40瓦日光灯或100瓦灯泡，在傍晚和夜间补充照射，对形成孢子或稻瘟病症状的正常反应都很有利，日光灯更好些，因为近照秧苗时，不致于热力伤苗。b、温度：稻瘟病病菌的潜育适温是25左右。c、湿度：在接种后潜育期内，湿度虽不象光照和温度那样重要，但与孢子形成和症状的正常反应也有一定关系，因此，温室中应经常洒水，以提高室内空气湿度。d、防止污染：无论生理小种鉴定，还是品种抗瘟性测定，都要注意保持菌种纯度，防止污染，操作时要严格消毒，接种针每挑取一个标样上的孢子后要经灯焰灭菌，凡改换菌种标样都需用70%的酒精擦手消毒。菌种的保存 保存菌种：保存菌种常用以下两种方法a、干燥保存法：将装有孢子的指形管，用两纱布包住管口，放入干燥器内，再将干燥器放在24的冰箱内，此法可保存13个月。 b、半真空保存法，将孢子装在安培瓶中，瓶中堵以少量的脱脂棉，由抽气机将瓶中气压抽至1mm水银柱，然后将瓶口用火烧封闭，放在24冰箱中，可保存1年左右。接种用的菌种，可分别用不同的小种单接也可将几种混合混接。一般先混合接种，进行初步鉴定和筛选，再分别接种作进一步的鉴定，接种保湿方法同前。(2)生理小种鉴定鉴定步骤从田间收到一个标本(以下称标样)到确定它属何生理小种，大致经过如下程序：标样采集菌种培养孢子洗涤接种鉴定。鉴定方法扩繁菌种，接种的具体方法同抗病性鉴定。生理小种鉴定，是观察某一标本在一整套鉴定品种上的反应型，反应型记载标准如下：调查分级标准：按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准。叶瘟：0级：无病1级：仅有小的针尖大小的褐点2级：较大褐点3级：小而圆以至稍长的褐色的环死灰斑，直径12毫米。4级：典型的稻瘟病斑或椭圆型，长12厘米，常限于两条叶脉间，病斑面积不足叶面积的2%。5级：典型的稻瘟病斑，受害面积小于10%。6级：典型的稻瘟病斑，受害面积为1025%7级：典型的稻瘟病斑，受害面积为2650%8级：典型的稻瘟病斑，受害面积为5175%9级：全部叶片死亡。 然后查阅检索表，最后确定该标样属何小种。所有标样都鉴定之后，统计某一小种出现的频率。在反应型符号的后面，有时还加一些附加符号，这些符号的意义如下：“+”或“-”指反应型的差异范围，“+”指差异的最高限，“=”指差异最低限，“”指差异在“+”和“-”之间。