饲料添加牛至精油对异育银鲫.织结构及血液生化指标的影响_王俊维.pdf

为研究牛至精油对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)生长性能、消化酶活性、肠道组织结构和血液生化指标方面的影响，实验选取平均初始体质量为(37.18 0.26)g 的健康异育银鲫630 尾，设置 0(空白对照)、25、50、100、200、400 和 800 mg/kg 7 个牛至精油添加剂量组，进行池塘网箱养殖 8 周后采样检测分析。结果显示:添加 400 和 800 mg/kg 牛至精油组的增重率、肥满度和特定生长率显著高于空白对照组，且饵料系数显著降低;添加 800 mg/kg 牛至精油组的增重率、肥满度和特定生长率显著高于 25 和 50 mg/kg 牛至精油组。与空白对照组相比，添加 200 和 400 mg/kg 牛至精油组的鱼体胰蛋白酶、脂肪酶和 淀粉酶活性显著升高。其中，淀粉酶与脂肪酶活性呈先升高再降低趋势，且均在牛至精油水平为200 mg/kg 时达到最大值，并显著高于25 和800 mg/kg 组，与 100 和 400 mg/kg 组之间无显著差异。添加 200 和 400 mg/kg 牛至精油组的鱼体后肠的肠壁厚度、肠绒毛高度、肠绒毛宽度和杯状细胞数量均显著高于空白对照组，而添加800 mg/kg 牛至精油组鱼体后肠的肠绒毛高度和绒毛宽度显著高于50 和200 mg/kg 组，与400 mg/kg 组之间无显著差异。各实验组的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和总胆红素(TBIL)与空白对照组相比均无显著性差异;添加 50、100、200、400 和 800 mg/kg 牛至精油组血液中谷草转氨酶(AST)活性显著低于空白对照组，而各实验组之间差异不显著。综上，饲料添加牛至精油能有效提高异育银鲫的生长性能，促进其肠道消化酶活性和改善肠道组织形态结构。综合异育银鲫生长性能、肠道组织结构及消化酶活性和血清生化指标，建议饲料牛至精油添加量为 100 400 mg/kg。关键词:异育银鲫(Carassius auratus gibelio);牛至精油;生长性能;消化酶;肠道组织结构;血清生化中图分类号:S965.117文献标识码:A文章编号:1000-6907-(2023)02-0069-08异育银鲫(Carassius auratus gibelio)生长速度快、个体规格大、易养殖，是重要的大宗淡水养殖品种，目前已经在江苏、山东以及湖北等地大面积推广养殖。近年来随着养殖环境的恶化，异育银鲫养殖病害问题多发，如大红鳃病、孢子虫病、鳃出血病1 3 等，给异育银鲫养殖业带来了巨大压力。肠道是鱼类最大的免疫器官之一，其发挥着多种作用，例如对营养物质进行消化和吸收、抵抗病原微生物和食物抗原对机体的影响等4。因此，如何通过饲料途径维护养殖鱼体生理健康、增强鱼体抗病力已引起产业广泛关注。与传统添加剂相比，中草药及其天然产物易被吸收且无残留、无污染，是一种绿色高效的水产饲料添加剂。已有研究表明，饲料中添加中草药及其提取物能够促进水产动物生长，改善水产动物消化酶活性，提高抗氧化、抗炎和抗病能力5。天然牛至精油是从中草药牛至中提取出的一种挥发性精油，其多以香芹酚(香荆芹酚)、百里香酚、-萜品烯和 p-异丙基甲苯等为主要成分6。牛至精油在水产养殖中在抗菌7 8、抗氧化9、免疫促进10、促生长11、抗寄生虫12 等方面具有广泛的应用。ABDEL LATIF 等13 研究表明，添加牛至精油可以改善鲤(Cyprinus carpio)的肠道组织形态，保护肝脏功能，提高生长性能指标和饲料利用参数。因此，为减少抗生素使用量，保障养殖品安全，在养殖过程中使用中草药来改善肠道健康已逐渐得到广泛关注并成为研究热点。本研究以异育银鲫为对象，在基础饲料中添加DOI:10.13721/ki.dsyy.2023.02.012淡水渔业2023 年不同剂量的牛至精油，探讨其对异育银鲫生长、消化酶、肠道组织结构、肝脏的影响，以期为牛至精油在水产养殖中的应用提供理论基础。1材料和方法1.1实验动物和设计实验用异育银鲫苗种由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心试验基地提供。牛至精油(98%)购自上海源叶生物科技有限公司。以基础饲料为空白对照组饲料，向基础饲料中添加不同含量的牛至精油制作 6 组饲料，添加量分别为 0(空白对照)、25、50、100、200、400 和 800 mg/kg，基础饲料组成与营养水平如表 1。表 1基础饲料组成与营养水平(风干基础)Tab.1Composition and nutrient levels of basal diets(air dry basis)%项目含量原料鱼粉7.00豆粕15.00棉粕11.00菜粕23.00米糠15.35豆油3.50面粉22.00维生素 C0.05氯化胆碱0.10磷酸二氢钙2.00预混料1)1.00合计100.00营养水平水分10.68粗脂肪6.38粗蛋白质33.59注:1)预混料为每千克饲料提供:Cu 5 mg，Fe 180 mg，Mn 35 mg，Zn 120 mg，I 0.65 mg，Se 0.5 mg，Se 0.07 mg，Mg 300 mg，K 80mg，VA 10 mg，VB18 mg，VB28 mg，VB620 mg，VB120.1 mg，VC 250 mg，VD34 mg，VK36 mg，泛酸钙 20 mg，烟酸 25 mg，叶酸 5 mg，肌醇 100 mg。1.2饲养管理实验开始前将异育银鲫放入池塘网箱暂养，用基础饲料驯化 2 周后，经 24 h 饥饿处理后，选择规格、体质量 (37.18 0.26)g基本一致的健康异育银鲫 630 尾。实验设计分为 7 组，每组 90尾，每个组 3 个重复，每个重复 30 尾，养殖于室外 2 666.7 m2池塘网箱。投饲量为鱼体质量的 2%4%，每天投喂 3次。实验期间水温25 32，pH 6.8 7.5，溶氧58 mg/L，氨氮 0.01 mg/L，硫化氢 0.1 mg/L。每隔 2 周根据鱼体质量适当调整投饲量，每日记录循环养殖池塘的水温及溶氧，观察异育银鲫的生长状态，并记录死亡情况，实验周期为 8 周。1.3样品采集与测定1.3.1样品采集饲养结束后，停食24 h，对每个网箱中鱼进行称重和计数;每个网箱随机挑选10 尾鱼用20 mg/L的 MS 222 麻醉处理后测量其体重、体长;用抗凝剂润洗的 2 mL 无菌注射器取尾静脉血，随即转入抗凝管中，离心收集上清液(4，2 500 r/min，10 min)，分装后 20 保存备用;解剖剪取前肠用预冷生理盐水快速冲洗后用纸吸干水分，置于自封袋中 80 冰箱保存备用;剪取后肠转移至4%的多聚甲醛固定液中固定备用。1.3.2生长指标测定计算特定生长率(SG)、增重率(WG)、饵料系数(FC)、肥满度(CF)和存活率(S)，计算公式如下:WG=(Wt W0)100%/W0SG=(lnWt nW0)/t100%FC=Wf/(Wt W0)CF=Wt(g)/L(cm)3100S=Nt/N0100%式中:Wt为鱼体末质量(g)，W0为鱼体初始质量(g)，t 为实验天数，Wf为投喂饲料总质量(g)，L为鱼体体长(cm)，Nt为终末尾数，N0为初始尾数。1.3.3肠道消化酶活测定前肠组织用 0.85%的生理盐水进行组织匀浆，于 4 下 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液用于测定消化酶活性。采用福林 酚法测定胰蛋白酶活性，采用甲基试卤灵底物法测定脂肪酶活性，采用碘 淀粉比色法测定-淀粉酶活性，具体操作按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。胰蛋白酶以37 条件下，每分钟水解干酪素生成1 g酪氨酸作为 1 个活性单位;-淀粉酶以 37 条件下，每毫克组织与底物作用30 min，水解 1 mg 淀粉07第 2 期王俊维等:饲料添加牛至精油对异育银鲫生长、消化酶活性、肠道组织结构及血液生化指标的影响为1 个活性单位;脂肪酶以37 条件下，每毫克组织在反应体系中与底物反应 1 min 消耗 1 mol 底物为 1 个活性单位。1.3.4肠道组织形态检查取出固定过夜的后肠组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，透蜡，包埋，切片，37 过夜烘干。苏木精 伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察肠道组织结构，测定肠壁厚度、肠绒毛长度、肠绒毛宽度、杯状细胞数量。1.3.5血液生化指标检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、总胆红素(TBIL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)等相关指标使用全自动生化分析仪 BS 400 2080 检测。1.4数据分析实验结果用平均值 标准差(mean SD)表示，采用 SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析(one way ANOVA)和 Duncan 氏法多重比较，统计检验 P0.05 表示差异显著。2结果2.1饲料添加牛至精油对异育银鲫生长性能的影响如表 2 所示，8 周实验结束后，不同牛至精油饲料对异育银鲫 S 没有显著影响。随着饲料中牛至精油添加量的增加，实验组的末均重、WG、CP 和 SG 均呈上升趋势，且 400 和 800 mg/kg 组的末均重、WG、CF 和 SG 均显著高于空白对照组。另外，800 mg/kg 组的 WG、CF 和 SG 显著高于 25 和 50 mg/kg 牛至精油组。尽管室外网箱养殖实验受到养殖期间的夏季高温影响较大，造成WG 偏低和 FC 普遍较高，但 FC 随着牛至精油添加量的增加呈下降趋势，200、400 和 800 mg/kg组的 FC 显著低于空白对照组。各实验组间 FC 不存在显著性差异。表 2饲料添加牛至精油对异育银鲫生长性能的影响Tab.2Effect of dietary oregano essential oil levels on growth performance of C.auratus gibelio牛至精油水平/(mg/kg)初均重/g末均重/gWG/%FCCFS/%SG/(%/d)037.24 0.2681.01 1.22a117.5 4.14a1.92 0.06a2.74 0.12a97.78 3.851.39 0.03a2537.38 0.1781.46 1.06ab117.9 3.23ab1.88 0.03ab2.78 0.33ab94.44 6.941.39 0.03ab5037.19 0.1781.89 2.70ab120.2 7.15ab1.89 0.11ab2.79 0.14ab100.00 0.001.41 0.06ab10036.98 0.0482.59 1.54ab123.4 3.96abc1.85 0.06ab2.80 0.10ab95.56 5.091.43 0.03abc20037.10 0.2184.08 0.78b126.6 2.19bc1.79 0.03b2.83 0.20abc96.67 0.001.46 0.02bc40037.51 0.2584.77 1.05b126.0 3.45bc1.78 0.04b2.87 0.26bc96.67 3.331.46 0.03bc80036.88 0.0585.19 0.44b131.0 1.12c1.74 0.02b2.93 0.17c97.78 1.921.50 0.01c注:同列数据上标相同字母或无字母表示差异不显著(P 0.05)，不同小写字母表示差异显著(P 0.05)。下同。2.2饲料添加牛至精油对异育银鲫消化酶活性的影响由表 3 可知，随着饲料中牛至精油添加量的增加，胰蛋白酶活性呈上升趋势，且 200、400 和800 mg/kg 组显著高于空白对照组。淀粉酶与脂肪酶活性随饲料牛至精油水平升高呈先升高再降低趋势，且均在牛至精油水平为 200 mg/kg 时达到最大值，并显著高于 0、25 和 800 mg/kg 组，与100 和 400 mg/kg 组无显著差异。2.3饲料添加牛至精油对异育银鲫肠道组织结构的影响饲料添加牛至精油对异育银鲫肠道结构的影响如表 4 和图 1 所示。与空白对照组相比，200、400和 800 mg/kg 组鱼体后肠的肠绒毛高度、绒毛宽度和肠壁厚度均显著性增加。800 mg/kg 组鱼体后肠的肠绒毛高度和绒毛宽度显著高于50 和200 mg/kg组，与 400 mg/kg 组无显著差异。与空白对照组相比，50 和 800 mg/kg 组鱼体后肠的杯状细胞数量差异不显著，200 和 400 mg/kg 组杯状细胞数量显著升高。2.4饲料添加牛至精油对异育银鲫血液生化指标的影响由表 5 可知，TC、TBIL、TG 和 ALT 在各实验组间差异不显著;AST 活性随饲料牛至精油水平的增加而呈现下降趋势，且 50、100、200、400 和800 mg/kg 组血液中 AST 含量均显著低于空白对照17淡水渔业2023 年表 3饲料添加牛至精油对异育银鲫消化酶活性的影响Tab.3Effect of dietary oregano essential oil levels on the digestive enzyme activity of C.auratus gibelio牛至精油水平/(mg/kg)含量胰蛋白酶/(U/mg prot)脂肪酶/(U/g prot)淀粉酶/(U/mg prot)01 245.14 340.78a1.01 0.17a0.17 0.02ab251 476.17 369.80a1.58 0.05ab0.23 0.02bc501 943.23 723.31ab1.82 0.50abc0.22 0.03bc1002 217.70 1077.41abc2.16 0.78bc0.26 0.05cd2003 044.49 272.85bc2.63 0.98c0.33 0.05d4003 298.36 716.99c2.20 0.51bc0.27 0.08cd8003 389.74 239.00c0.91 0.38a0.14 0.02a表 4饲料添加牛至精油对异育银鲫后肠组织结构的影响Tab.4Effect of dietary oregano essential oil levels on hindgut tissue structure of C.auratus gibelio牛至精油水平/(mg/kg)绒毛高度/m绒毛宽度/m肠壁厚度/m杯状细胞/个0418.08 41.27a143.90 19.64a95.47 18.31a18.50 2.66a50465.33 79.32b150.65 25.66ab109.45 20.31b23.30 4.31ab200512.18 41.00c160.60 20.64b119.18 16.39c24.10 4.11b400534.35 39.28cd195.17 32.73c128.95 12.98d24.00 3.95b800539.08 53.90d190.82 32.24c127.35 15.14cd20.00 3.61ab图 1异育银鲫后肠组织切片Fig.1Histopathological sections(HE stain)of hindgutC.auratus gibelioA:0 mg/kg 组;B:50 mg/kg 组;C:200 mg/kg 组;D:400 mg/kg 组;E:800 mg/kg 组;F:50 mg/kg 组;IV:肠绒毛;IWT:肠壁厚度;VH:绒毛高度;VW:绒毛宽度;GC:杯状细胞。组，而各实验组之间差异不显著。3讨论3.1不同牛至精油添加量对异育银鲫生长性能的影响目前，国内外相关研究发现饲料添加植物精油可以提高水产养殖动物的生产性能14。其中，牛至精油可以从多个方面促进养殖动物的生长，包括提高动物食欲、补充和完善饵料的营养水平、保持肠道菌群平衡、增强肠道上皮细胞对病原微生物的抵抗能力等8，15。本研究结果表明，饲料中添加牛至精油能够改善异育银鲫的生长性能。这可能归因于牛至精油及其组分作用的影响。牛至精油本身具有独特的香味，可以提高鱼体的进食欲望，从而提高饲料的摄入量和食物的适口性，改善鱼体的FBW 和 WG16。生长性能改善的另一个可能原因是香芹酚和百里香酚的影响，它们可能刺激消化酶的分泌和酶的活性，从而促进营养物质的消化和吸收11，17。WALEED 等18 研究发现在低或中等养殖密度条件下，饲料中添加1 mL/kg 的牛至精油能够明显 改 善 尼 罗 罗 非 鱼(Oreochromis niloticus)的WG、SG 和 FC。此外，DINADO 等19研究27第 2 期王俊维等:饲料添加牛至精油对异育银鲫生长、消化酶活性、肠道组织结构及血液生化指标的影响表 5饲料添加牛至精油对异育银鲫血液生化指标的影响Tab.5Effect of dietary oregano essential oil levels on plasma biochemical indexes of C.auratus gibelio牛至精油水平/(mg/kg)含量TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)TBIL/(mol/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)05.99 1.361.97 0.232.64 0.522.39 0.66311.81 59.30a255.98 1.042.15 0.112.62 0.732.36 0.51302.64 45.35ab506.00 1.052.14 0.452.66 0.462.29 0.30269.67 45.45bc1006.30 1.122.18 0.332.45 0.872.00 0.52260.68 22.01c2006.42 0.932.22 0.222.66 1.061.98 0.53253.13 25.51c4006.99 1.202.26 0.242.82 0.851.92 0.36252.23 48.08c8006.75 1.172.26 0.392.82 0.591.93 0.52235.36 50.46c发现投喂添加含 100 mg/L 牛至精油的饲料后，欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)的最终体重、增重和比生长率与对照组相比均有显著的正向影响，与本实验结果相似。3.2不同牛至精油添加量对异育银鲫消化酶活性的影响胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等是鱼体重要的消化酶组分20。肠道消化酶活性对饲料消化、吸收、利用均有重要影响21。本研究发现，与对照组相比，添加 200、400 和 800 mg/kg 牛至精油显著提高异育银鲫的脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶活性，从而促进异育银鲫肠道消化吸收且中剂量添加效果更优。饲料中添加植物精油显著提高了消化酶活性，其机理可能是鱼体摄食精油后可刺激胆汁、消化道酶液分泌，提高消化酶活性，从而提高鱼体对营养的消化吸收能力22。ZHANG 等10 研究表明，日粮中添加牛至精油可通过增加蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性水平来促进鲤的消化功能;同样，植物精油在尼罗罗非鱼23 和海鲷(Sparus aura-ta)24 上也有相同发现。因此，本研究认为在基础饲料中添加牛至精油能够显著提高异育银鲫肠道消化酶活性以及饲料消化、吸收、利用效率，进而促进异育银鲫的生长。3.3不同牛至精油添加量对异育银鲫肠道组织结构的影响肠道是机体消化、营养物质吸收的重要场所，机体的消化功能与肠道发育密切相关25。肠道绒毛形态被认为是影响水生动物吸收能力的标志26。肠壁厚度的增加能够增加肠道的柔韧性、促进食物移动，进而促进肠道内营养物质的消化吸收27。本研究中，与对照组相比，添加 200、400 和 800mg/kg 牛至精油显著增加鱼体后肠的肠绒毛长度、宽度和肠壁厚度。添加牛至精油的饲料通过增加肠壁厚度、肠道绒毛长度和肠道绒毛宽度来增加吸收表面积，从而改善鱼类肠道对营养物质的吸收。有研究发现从植物中提取的其他精油被证明也能增加尼罗罗非鱼28 以及非洲鲶(Clarias gariepinus)29 的肠绒毛长度。ASMAA 等30 的研究表明，在尼罗罗非鱼日粮中添加百里香酚后，其小肠绒毛长度显著增加。ABDEL LATIF 等13 研究发现日粮中添加牛至精油可以显著增加肠绒毛长度和肠绒毛宽度，进而提高鲤对营养物质的吸收及消化食物的能力。牛至精油对肠道形态的改善与牛至精油的抗氧化性、抗菌性等有关31。有研究报道表明，牛至精油能够促进肠道有益菌如乳酸菌和双歧杆菌的生长，降低有害菌和条件致病菌的数量，减少其对肠道黏膜的损伤及用于细胞周转的能量消耗32。3.4不同牛至精油添加量对异育银鲫血液指标的影响肝脏是机体胆固醇合成的主要场所，同时肝脏也有维持血液中胆固醇含量稳定的作用33;血液中胆固醇的含量能够在一定程度上反映机体肝脏的健康程度，当机体肝脏损伤时血液中胆固醇的含量往往会升高。甘油三脂同样是动物体内一种重要成分，机体能量増加通常伴随着甘油三脂含量的增加，一般情况下，胆固醇升降往往伴随甘油三脂升降34。此外，胆红素属于胆汁色素，总胆红素是直接胆红素与间接胆红素的总称35。肝细胞具有摄取胆红素的能力，能够清除血液中过多的胆红素，若机体内的胆红素超过了肝细胞的处理能力，血液中总胆红素含量便会随之升高36。低温胁迫会造成荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)的总胆37淡水渔业2023 年红素浓度上升，肝脏处理胆红素能力明显降低并产生代谢障碍35。本研究结果发现饲料添加牛至精油对异育银鲫血液胆固醇、甘油三酯和总胆红素影响不显著，表明当前添加牛至精油剂量不会对异育银鲫肝脏造成损伤。AST 和 ALT 是细胞线粒体中重要的氨基转移酶，广泛存在于鱼类的心脏、肾脏、肝脏、鳃等组织中37 38。正常情况下谷草转氨酶和谷丙转氨酶主要存在于肝细胞的线粒体中，血液中二者含量较少;而组织受损或者功能减弱时，细胞膜渗透增大，致使血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶升高39。因此，血液中 AST 和 ALT 的含量可以作为评价鱼类肝脏损伤程度重要指标。SEYYED 等40 研究发现百 里 香 酚 能 够 显 著 降 低 虹 鳟(Oncorhynchusmykiss)血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量，还能够降低血糖含量，减少对肝脏功能的损伤。AB-DEL LATIF 等13 报道，鲤饲料中添加牛至精油对肝功能酶没有显著影响，表明鱼类饲料中添加牛至精油对它们的肝组织没有毒性作用。本实验中，饲料中添加牛至精油能够显著降低血清 AST 含量，表明牛至精油可在一定程度内保护肝脏。4结论本实验研究结果表明，饲料添加牛至精油对异育银鲫生长性能、肠道酶活、肠道组织结构和肝脏保护能力有明显影响。综合异育银鲫生长性能、肠道组织结构及消化酶活性和血清生化指标，建议饲料牛至精油添加量为 100 400 mg/kg。参考文献:1 刘广丰 鲫鱼细菌性出血病、大红鳃及鳃出血的诊断及防治J 科学养鱼，2020(9):52 53 2 任芳芳 异育银鲫武汉单极虫病的病理、PC 分析和药物防控研究D 上海:上海海洋大学，2018 3 吴霆，朱春艳，王瑶，等 异育银鲫病毒性鳃出血病预防与控制技术 J 中国水产，2015(10):92 93 4 FAN Y，PEDESEN O Gut microbiota in human metabolic healthand diseaseJ Nature eviews Microbiology，2021，19(1):5571 5 朱传忠，孙陆宇，解文丽，等 3种饲料添加剂对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、消化酶活性和肝、肠组织结构的影响J 淡水渔业，2018，48(2):94 99 6 韩飞，李瑾，潘悄悄，等 新型天然植物抗生素牛至油的研究进展J 中国新药杂志，2015，24(3):303 307 7 LU M，DAI T H，MUAY C K，et al Bactericidal property oforegano oil against multidrug resistant clinical isolatesJ Fron-tiers in Microbiology，2018(9):2329 8 BUT S Essential oils:their antibacterial properties and potentialapplications in foods a reviewJ International Journal of FoodMicrobiology，2004，94(3):223 253 9 UBEN O，VALEIA N，UBEN G N Antioxidant activity offractions from oregano essential oils obtained by molecular distil-lation J Food 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