马铃薯DHN家族基因鉴定及干旱胁迫诱导表达分析.pdf

马铃薯遭遇干旱胁迫时，会导致产量下降、品质降低。用生物信息学的方法，对马铃薯 （）基因家族进行全基因组鉴定，对其理化性质、染色体分布等进行分析，利用荧光定量的方法，对其在干旱胁迫下和不同组织中的表达模式进行分析。结果表明，基因家族共鉴定出 个家族成员，分布于 号、号和 号染色体上，理化性质分析表明氨基酸长度为 个，分子量为 ，等电点（）的范围为 。蛋白的二级结构基本以无规卷曲为主，延伸链与 转角的比例相当，仅有 以 螺旋为主。对马铃薯 基因上游 启动子区域顺式作用元件分析发现，基因受到光的调控，平均每个基因中有 个光响应元件；还受到脱落酸（、）、赤霉素（）等激素的调控；与逆境胁迫相关的包括低温响应元件（、）、干旱响应元件（）等；生长发育调控元件包括胚乳表达（）、种子特异性调控（）、分生组织表达（、）。荧光定量结果发现，基因参与干旱应答响应，也有可能参与马铃薯的生长调控。本研究为马铃薯中的耐旱候选基因研究提供参考。关键词：全基因组；马铃薯；干旱胁迫；组织特异性；表达分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：）；河北省张家口市基础研究和人才培养计划项目（编号：）；河 北 省 教 育 厅 自 然 科 学 类 青 年 项 目（编 号：）；河北省马铃薯产业协同创新中心项目（编号：号）。作者简介：纪艺红（），女，河北张家口人，硕士，助理研究员，研究方向为分子抗逆育种。：。通信作者：王磊，博士，讲师，研究方向为马铃薯种质资源创新。：。植物遭受高盐、干旱或重金属等非生物胁迫逆境时，会导致生长发育缓慢、减产及品质降低 。植物会通过一系列防御机制，来应对各种伤害，从而增强对各种非生物胁迫的抵抗能力，帮助植物适应环境，例如积累可溶性渗透物（可溶性糖、甘氨酸甜 菜 碱 等）及 合 成 亲 水 性 蛋 白，如 脱 水 素（，简称 ），一种高亲水性蛋白质，在细胞核、液泡、细胞质、线粒体和叶绿体等植物细胞结构中广泛存在 ，由 最早发现于 世纪 年代 。研究表明，在非生物胁迫的抗逆过程中，脱水素基因扮演着重要的作用 ，目前研究较多的是广泛参与渗透调节相关功能的一类 蛋白 ，该类蛋白可与分子伴侣、渗调蛋白和解毒酶协同作用，在逆境下调控植物细胞的正常代谢活动 。据报道，基因与生物的抗逆性密切相关，当植物遭受如干旱、高盐和温度胁迫等与细胞脱水相关的非生物胁迫时，在营养组织中大量积累，从而保护蛋白质、核酸和细胞膜等 。很多研究表明，脱水素与干旱及盐胁迫的调控相关 。过量表达 类基因可以提高拟南芥、水稻、烟草、草莓、酵母和大肠杆菌等应对抗寒、抗旱或耐盐能力的非生物胁迫能力 。水稻植株过表达 ，抗旱和耐盐性与野生型相比显著增强 。在番茄中，过量表达雪莲 基因，可以提高植株的抗 旱 能 力 。在 小 立 碗 藓 中，和 在盐和甘露醇胁迫下被强烈的诱导上调表达 。与野生型烟草相比，过表达枇杷脱水素基因 能够显著提高转基因烟草植株的抗寒能力 。在辣椒中对盐胁迫起正调控作用，此外，也有研究发现 与重金属的应答和解毒相关 。受低温胁迫上调表达 。在芥菜中，烟草中过表达的 个脱水素基因 和 受重金属诱导，提高了过表达烟草植株对重金属 和 的抵抗能力 。在烟草中，过量表达玉米脱水素基因 ，有利于提高转基江苏农业科学 年第 卷第 期因植株对 胁迫的抗性 。大麦脱水素基因 被干旱、和盐胁迫诱导 。本研究主要对马铃薯中的 基因进行鉴定，分析了它们在染色体上的分布，对马铃薯中 基因启动子区的顺式元件、组织器官表达模式以及非生物胁迫下的表达模式进行研究，有助于了解 基因在马铃薯抗逆分子机制中的作用，为进一步对马铃薯的遗传改良提供理论依据。材料与方法 试验时间及地点本试验于 年 月在河北北方学院旱作农业研究中心实验室完成。马铃薯基因组中 成员的鉴定及染色体定位马铃薯基因组信息、蛋白质和 序列及染色体位置等信息均下载自在线数据资源（，：）。以 含 有 保 守 结 构 域 的 模型（）作为模板在 （：）中搜索，利用 比对（：），使 用 （：）网站进行验证，最终得到 个含有 保守结构域的 成员。根据基因组的注释信息和 家族基因成员在染色体上所对应的位置，使用 软件绘制 基因的染色体位置图，用 软件进行美化处理。马铃薯 家族成员的序列和结构特征分析使用 网站（：）计算 成员的氨基酸数量、蛋白质分子量（，简称 ）以及理论等电点（，简称 ）；将 家族成员序列上传至 （：），进行亚细胞定位分析；使用 （：）在线预测 个 蛋白质二级结构。使用 （：），搜索识别所有 家族基因的蛋白保守基序（）。使用 （：）确定基因内含子和外显子结构，用 软件进行美化处理。马铃薯 家族成员顺式作用元件预测通过 脚本检索，将马铃薯基因数据库中每个 基因的启动子序列（非翻译区上游 ）上传于 （：），进行搜索检测，将顺式作用元件按功能归类后，使用 （：）将结果进行可视化。马铃薯 家族的表达模式分析使用马铃薯品种冀张薯 号组培苗，采用浓度 的 处理 、后，株混合取样，试验重复 次，在液氮中速冻，存放于 ，提取植株 ，反转录为 ，用于分析干旱胁迫下的表达模式。在开花期取不同组织（花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎）分析各基因在不同组织中的表达模式。使用 对马铃薯 家族进行查找设计引物（表 ），以 为内参基因，反应体系（）：、上下游引物各 、。反应条件：；，共计 个循环。组织中将茎中表达量设为 ，干旱胁迫以未处理的材料（）作为对照，表达量设为 。使用表 引物名称及序列基因名称正向引物（）反向引物（）注：为延伸因子（），为 。江苏农业科学 年第 卷第 期 方法计算和分析，使用 软件绘图。结果与分析 的鉴定及染色体分布通过生物信息学方法，利用 进行搜索，结果共鉴定出 个候选 基因，利用 检测，去除冗余后，在马铃薯中共鉴定出了 个 基因家族成员。通过染色体定位分析（图 ）发现，基因在 号染色体上分布最多，为 个（、），号 染 色 体 上 为 个（），号 染 色 体 上 分 布 个（）。其中，和 分别位 于 染 色 体 的 下 端，、基因位于染色体中间位置，其余染色体上没有发现 基因的分布。蛋白的理化性质和亚细胞定位由表 可知，家族成员的氨基酸长度和理化性质存在较大的差异，包括基因名称、转录本登录号、染色体位置、氨基酸数量（）、分子量（）、等电点（）和亚细胞定位。氨基酸长度为 （）个氨基酸（）。分子量 为 （）至 （），等 电 点（）的 范 围 为 （）（）。个 氨基酸序列（、）理论等电点在酸性范围（）内，个（、）理论等电点在碱性范围（）内。亚细胞定位预测结果表明，各成员均定位于细胞核中。表 基因家族成员信息基因转录本染色体位置蛋白长度（个）分子量（）理论等电点亚细胞定位 （）细胞核 （）细胞核 （）细胞核 （）细胞核 （）细胞核 基因结构和 分析构建基因结构图谱，结果（图 ）显示，该家族成员结构基本相似，内含子数目相同，均只含有 个内含子。为了更全面了解 蛋白的保守基序组成元件，利用在线 程序，预测了 蛋白的 个保守基序。分析发现，结构域存在多种组成形式，如 和 、和 ，含有 个数目不等的 。每个成员的 组成相对保守，每个基因中均有 和 ，基因结构则较为相似（图 ）。蛋白二级结构 蛋白的二级结构基本以无规卷曲为主，延伸链与 转角的比例相当，仅有 以 螺旋为主（图 、表 ）。马铃薯 家族基因的顺式作用元件选取马铃薯基因组 家族基因起始密码子上游 进行分析，结果（图）表明，在马铃薯 家族基因中除启动子区域的核心元件外，共鉴定出 种不同的顺式作用元件，主要由光响应元件、逆境胁迫响应元件、生长发育响应元件等组江苏农业科学 年第 卷第 期成。在马铃薯 基因家族含有的启动子元件中光响应元件数量最多，光响应元件分布在所有家族成员中，平均每个基因中有 个。植物激素调控相关元件包括茉莉酸响应元件为 个，分布于 个基因（、）中；脱落酸响应元件 个，分布于 个基因（、）中；赤霉素诱导元件 个（）。逆境胁迫相关元件包括低温响应元江苏农业科学 年第 卷第 期表 蛋白二级结构基因蛋白二级结构（）螺旋延伸链 转角无规则卷曲 件（、）、干旱响应元件（）等。生长发育调控元件包括胚乳表达（）、种子特异性调控（）、分生组织表达（、）等元件。基因组织特异性分析组织表达结果（图 ）显示，各个基因在马铃薯不同部位的表达量存在差异，而且基因间也存在差异。将茎部表达量设为 ，在花中相对表达量最高，与茎相比具有极显著差异，在块茎中几乎不表达；在花、块茎和葡匐茎中的表达量低于茎中的表达量，具有极显著差异；在根中的表达量高于茎，具有极显著差异，葡匐茎中的表达量也较高，具有显著差异；在葡匐茎和叶片中表达量较高，具有极显著差异；基因在各组织中表达量无差异。因此，推测 基因可能会参与调控马铃薯的生长发育，在不同部位中发挥了作用。基因在干旱胁迫下的表达分析为了研究 家族基因在干旱处理下的表达模式，在马铃薯中进行荧光定量分析。结果（图 ）发现，基因积极响应干旱胁迫，受到干旱胁迫时表达量均高于 ，在 时达到最高，与相比具有极显著差异；基因受到干旱胁迫时，表达受到抑制，与 相比，均低于 的表达量，其中 和 时与 相比具有极显著差异；在干旱胁迫时，表达趋势先升高后降低，在 时显著高于，在 和 时基因江苏农业科学 年第 卷第 期表达量降低，低于 ；和 基因表达趋势一致，与 相比没有显著差异。讨论与结论本研究表明，基因参与了非生物胁迫的响应对植物的抗逆、生长发育等起着重要的作用。根据报道，其中苹果中的 家族成员数量最多，共有 个成员 ；最少的为葡萄 和黄瓜 ，仅有个成员；梨 和猕猴桃 中均鉴定到 个成员；萝卜 中鉴定到 个成员，目前，马铃薯 家族基因还未被研究。本研究在马铃薯中共鉴定出 个 基因，与前人在苹果、葡萄、黄瓜、梨、猕猴桃、萝卜等物种中鉴定出的个数有所不同，数目较少，通过对该家族成员的基因复制事件分析，发现该基因家族不存在片段重复和串联重复，推测这可能是该基因家族较少的原因之一。在本研究中，马铃薯 家族基因的等电点为 ，与已经报道的拟南芥、番茄、烟草、白菜的结果一致，说明其编码的蛋白具有相似的功能。马铃薯 个 基因家族均含有 个内含子，基因结构高度一致，说明 可能存在相似的生物学功能。本研究利用 网址分析马铃薯 的保守结构域，结果显示，所有的 蛋白均包含 结构域。通过分析 发现，马铃薯 家族基因含有 个数目不等的 ，每个基因中均有 和 ，组成相对保守，推测该基因家族在功能保守的同时，不同的基因的功能发生分化。通过启动子顺式作用元件发现，马铃薯 家族基因在激素响应、逆境胁迫、光调控及生长发育等方面可能发挥着一定的作用。本研 究 发 现，家 族 成 员 、在不同的器官中表达具有显著差异，因此，推测在生长发育过程中该基因可能参与马铃薯的生长调控，在不同部位的生长发育中发挥了作用。分析马铃薯 家族基因在干旱胁迫 下 的 表 达 模 式，发 现 干 旱 胁 迫 处 理 时，、基因与对照相比具有不同的响应模式，说明马铃薯 基因广泛响应干旱胁迫。分子抗性育种是马铃薯育种中的重要课题之一，马铃薯基因组测序的完成和不断完善，为深入研究这些基因的功能以及上游和下游的调控蛋白提供了基础，本研究通过对 家族基因的分析，为今后提高马铃薯的耐旱性和改良马铃薯耐旱新品种提供理论依据，家族的功能及通过何种途径提高马铃薯的抗性仍需进一步研究阐明。参考文献：，（）：，：，（）：江苏农业科学 年第 卷第 期 ，（）：，（）：，：，：，（）：夏惠，林玲，高帆，等植物脱水素对多种逆境的响应 干旱地区农业研究，（）：，（）：，：，（）：（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（），（）：，（），（）：，：孙小川，段伟科，黄志楠，等萝卜 基因家族的鉴定及表达模式分析 分子植物育种，：江苏农业科学 年第 卷第 期