基于网络药理学和实验验证探讨附子治疗变应性鼻炎的作用机制研究.pdf

海南医学院学报 2023，29（15）Journal of Hainan Medical University基于网络药理学和实验验证探讨附子治疗变应性鼻炎的作用机制研究李琳，丁顺，徐正扬，严旌仁，张启萌，牟忠林（海南医学院第一附属医院耳鼻喉科头颈外科，海南 海口 570102）摘要 目的：研究附子治疗变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的关键作用靶点基因和信号通路。方法：使用 TCMPS和 PubChem 数据库，用口服生物利用度和药物相似度作为筛选条件筛选出附子的活性成分及作用靶点基因，使用 GeneCards数据库筛选出 AR的靶点基因。利用在线工具 Venny2.1筛选出附子治疗 AR的作用靶点基因；利用 STRING 数据库获取药物疾病作用靶点的蛋白互作（Proteinprotein interaction，PPI）网络，通过 MCC 算法找出关键靶点基因。通过 GO 富集和 KEGG 富集分析找到潜在的生物学过程和信号通路。最后，进行了动物实验证明附子对 AR 的治疗作用。结果：使用 TCMSP、PubChem 和 GeneCards 数据库筛选出附子中 21 种活性化合物成分和附子对 AR 的潜在治疗靶点基因 68 个。PPI网络分析找出前十个关键靶点基因，分别为：PTGS2、TNF、IL6、AKT1、ALB、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA 和 JUN。GO功能和 KEGG 通路富集分析显示附子对 AR 的作用靶点显著富集的功能和通路与 AR 密切相关。最后通过动物实验验证附子对 AR的治疗是有效的。结论：AR患者鼻黏膜组织中 IL6和 TNF的表达增加，与变应性鼻炎疾病活动相关指标呈正相关。附子通过抑制小鼠鼻黏膜中 Toll 样信号通路的活化，降低 IL6 和TNF的表达活性，从而改善了 AR小鼠的炎症改变。关键词 网络药理学；附子；变应性鼻炎；Toll样受体信号通路；IL6；TNF中图分类号 R285.5 文献标识码 A 文章编号 10071237（2023）15116211Study on the mechanism of Fuzi in the treatment of allergic rhinitis based on network pharmacology and experimental validationLI Lin，DING Shun，XU Zhengyang，YAN Jingren，ZHANG Qimeng，MU Zhonglin （Department of Otolaryngology，Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University，Haikou 570102，China）Foundation Project：This study was supported by Natural Science Foundation of Hainan Province（820RC627）Author：LI Lin，Email：.Correspondence to：MU Zhonglin，M.D.，Professor，Email：.Received：20230302 Revised：20230615 JHMU，2023；29（15）：11621172View from specialist:It is creative,and of certain scientific and educational value.ABSTRACT Objective：To study the key target genes and signaling pathways in the treatment of allergic rhinitis（AR）with radix aconiti lateralis preparata（aka Fuzi）.Methods：The TCMPS and PubChem databases were used to screen the active ingredients and target genes of Fuzi using oral bioavailability and drug similarity as screening conditions，and the GeneCards database was used to screen the target genes of AR.The online tool Venny2.1 was used to screen the target genes of Fuzi for the treatment of Allergic Rhinitis；the STRING database was used to obtain the proteinprotein interaction（PPI）network of drugdisease targets，and the key target genes were identified by the MCC algorithm.The potential biological processes and signaling pathways were identified by GO enrichment and KEGG enrichment analysis.Finally，animal experiments were conducted to demonstrate the therapeutic effect of Fuzi on allergic rhinitis.Results：The TCMSP，PubChem and GeneCards databases were used to screen the 21 active compound components of Fuzi and 68 potential therapeutic target genes of Fuzi for Allergic Rhinitis.PPI network analysis identified the top ten key target genes，namely：PTGS2，TNF，IL6，AKT1，ALB，STAT3，CCL2，CXCL8，VEGFA and DOI：10.13210/ki.jhmu.20230616.003网络出版地址：https：/ 海南省自然科学基金项目（820RC627）作者简介 李琳，Email：。通讯作者 牟忠林，博士，教授，Email：。收稿日期 20230302 修回日期 20230615 网络出版时间：20230619 10：39：181162李琳等.基于网络药理学和实验验证探讨附子治疗变应性鼻炎的作用机制研究JUN.GO functional and KEGG pathway enrichment analysis showed that the significantly enriched functions and pathways of Fuzi on allergic rhinitis were closely related to allergic rhinitis.Finally，animal experiments were conducted to verify that Fuzi is effective in the treatment of allergic rhinitis.Conclusion：Increased expression of IL6 and TNF in nasal mucosal tissues of patients with allergic rhinitis was positively correlated with indicators related to the disease activity of allergic rhinitis.Fuzi ameliorated the inflammatory changes in mice with allergic rhinitis by inhibiting the activation of tolllike signaling pathway in the nasal mucosa and decreasing the expression activity of IL6 and TNF.KEYWORDS Network pharmacology；Fuzi；Allergy rhinitis；Tolllike receptor signaling pathway；IL6；TNF变应性鼻炎（allergy rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科最常见的疾病之一，是一种鼻黏膜症状性、炎症性与免疫性疾病1。变应性鼻炎可降低患者生活质量并导致其他疾病产生，如哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停等2，约 80%的变应性鼻炎的患者临床症状在20岁之前出现并在 2040岁达到高峰，然后逐渐下降3。AR属于一种多因素的疾病，它的致病机理复杂，牵扯了多种炎性细胞和炎性介质4。目前 AR的治疗选择包括患者教育、避免接触过敏原、药物疗法、免疫疗法、中医针灸、中医方剂和手术等5。西医药物治疗是目前 AR 最主要的治疗方式，但这些药物往往容易引起如疲劳、激素抵抗和镇静等副作用6。因此目前需要一种有效且安全的药物来防治 AR7。自古以来，附子是临床治疗 AR 的代表中药，附子具有平喘、提高免疫功能、抗氧化、散寒止痛、抗寒抑菌的作用8，9。但是目前附子对 AR 治疗的具体作用机制仍有待确定。传统基于单一组分的机制研究无法实现对中药药效的全面、系统的理解，网络药理学具有整体性、系统性的特征已被广泛运用于中医药的研究，应用网络药理研究附子治疗 AR的机制是可行的。本研究应用网络药理学方法获得附子治疗 AR的主要活性化合物成分及作用靶点基因，通过富集分析筛选出附子治疗 AR 潜在的生物学过程和信号通路。在此基础上，建立 AR 小鼠模型，观察附子对AR 的治疗作用。为进一步研究附子治疗 AR 的药理机制奠定基础。1 材料与方法 1.1数据库及软件分析通 过 中 医 药 系 统 药 理 学 数 据 库 及 分 析 平 台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数 据库以生物活性成分为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）20%和（druglikeness，DL）0.1作为筛选条件，找到附子相关的活性化合物成分10。药代 动 力 学（absorption，distribution，metabolism，and eexcretion，ADME）是筛选附子生物活性化合物成分重要的限制因素，是指药物化合物的吸收、分布、代谢和排泄。在药代动力学中，口服生物利用度 OB和 DL是最重要的药代动力学特性。OB是指口服药物从胃肠道吸收进入循环系统的速率和程度11。DL 是药物设定的定性概念，可作为中草药“类药物”成分选用的依据。1.2附子的作用靶点基因筛选在 TCMSP 数据库筛选出的附子活性化合物，通过 PubChem 数据库12，设置筛选物种类别，将靶蛋白名称转为“gene symbol”表示，得到附子主要活性化合物对应的靶点基因，然后利用 UniProt 数据库对基因名称进行标准化命名13，在去除重复基因后获得附子活性化合物对应的靶点基因。1.3AR的靶点基因筛选GeneCards 数据库是一个人类基因信息数据库14，在 GeneCards数据库中，通过使用“allergic rhinitis”这个词来搜索找到与 AR相关的靶点基因。1.4附子和 AR重叠靶点基因的获得通过在线工具 Venny2.1 筛选出附子与 AR 的重叠基因15，韦恩图是一种常用的统计学图表，它主要用于显示元素集合重叠区域的图示。附子治疗 AR 的靶点基因即是这些被筛选出来的重叠基因通过使用韦恩图显示。1.5“化合物基因疾病”网络图构建通过数据库筛选出附子治疗 AR 的靶点基因，使用 Cytoscape 软件构建化合物基因疾病（compoundgenedisease，CGD）网络图进行可视化，利用网络分析工具得出每个节点的连接度，表示于该节点直接连接的节点数目，连接度越大说明改节点在网络中的作用越重要16。1.6蛋白互作网络图构建附子和 AR的重叠基因通过 STRING 数据库进行蛋白质互作（proteinprotein interaction，PPI）网络研究，在 0.4的置信水平下构建了 PPI网络图17。将基于数据库信息生成的 PPI 网络导入 Cytoscape 软件 中，再 使 用 Cytoscape 中 CytoHubba 插 件 依 据MCC算法筛选出最核心的前十位基因，这些基因是附子治疗 AR的前 10个重要枢纽基因18。1163海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.20231.7富集分析通过 GO 功能数据库可以帮助我们更好地理解基因功能，如细胞成分（cellular components，CC）、生 物 过 程（biological processes，BP）和 分 子 功 能（molecular functions，MF）19。KEGG 功能数据库是可以从中获得基因及基因组信息的数据库20。DAVID 数据库是一款在线分析软件，为了探索靶点蛋白的基因功能以及信号通路方面的具体作用，使用 DAVID 数据库中的功能注释工具对附子中的活性化合物成分与 AR 交互靶点基因进行 GO 功能富集分析和 KEGG 信号通路富集分析21，22，选取GO 功能富集分析中关于细胞成分、生物过程和分子功能的前十个关键词，通过条形图将结果可视化。选取 KEGG 前 20 个关键通路，设置 P0.05，通过分析图将结果可视化。1.8实验验证1.8.1实验材料和方法（1）实验药物：100 g 附子购自海口市中医医院，加入 10 倍量去离子水浸泡10 min，武火煮沸，文火煎煮 2 h，过滤得一煎液；二煎加入 8 倍量去离子水，武火煮沸，文火煎煮 1.5 h，过滤得二煎液，两次煎煮液合并浓缩至生药量为1.52 g/mL 的浓缩液，放置在80 的冰箱中保存。（2）实验试剂：IL6和 TNF抗体购置于爱必信（上海）生物科技有限公司。1.8.2动物模型构建选取购自于西安新区枫东新城实验动物园的 46 周龄雌性小鼠，体重约在（202）g。小鼠被饲养在 SPF级的动物实验室中：温度（222）、湿度（605）%、12 h 光/暗循环环境，所有实验均按照中国国家实验动物护理和使用指南进行。该研究获得了海南医学院伦理委员会的批准（动物伦理编号：HYLL2021382）。经过适应性喂养 1 周后，将 30 只雌性小鼠随机平 均 分 为 正 常 对 照 组（normal control group，NC group）、变 应 性 鼻 炎 组（allergic rhinitis group，AR group）和 附 子 组（radix aconiti lateralis preparata group，Fuzi group）。根据参考文献，经过适当的调整创建了以下的 AR 的小鼠模型23。在前 14 d 中，附子组和变应性鼻炎组小鼠给予腹腔注射致敏液致 敏，致 敏 液 的 成 分 是 卵 清 白 蛋 白（ovalbumin，OVA）40 g和 Al（OH）3 1.5 mg溶于生理盐水，配成共 0.2 mL 的致敏液，每 2 天 1 次，从第 15 天到第 21天，按每只 40 L 5%的 OVA 滴鼻液滴入小鼠双侧鼻腔激发，每天 1 次。第 22 天到 30 天，附子组小鼠按给药剂量为 1.56 g/kg 进行灌胃，每天 1 次，同时为维持鼻部刺激，变应性小鼠组和附子组每隔 1 天用 OVA 滴鼻液激发，正常组小鼠用同体积的生理盐水替代，第 31天，处死所有小鼠。1.8.3HE 染色取各组小鼠的完整鼻腔黏膜，用4%的多聚甲醛水浸泡 24 h，经脱水、浸蜡、包埋、切片等处理后，用苏木精和伊红法对石蜡包埋的鼻黏膜组织进行染色，用光学显微镜来评估和记录组织病理学变化。1.8.4蛋白免疫印迹法检测从各组鼻黏膜组织中分离出蛋白，用于鉴定 IL6和 TNF的表达。将提取的蛋白加入 BSA 标准测定溶液中进行蛋白浓度的鉴定，用 SDSPAGE凝胶电泳对蛋白质进行分离。蛋白质随后被转移到转膜滤纸上，然后用 5%的脱脂牛奶孵化 2 h 后加入一抗并在 4 冰箱下孵育过夜。之后用 TBST 洗膜，加入二抗溶液在室温下孵育 2 h。最后通过显影仪器显影并测量目标带/相应的相对表达水平。1.8.5免疫组化法检测将脱蜡的石蜡切片用二甲苯和酒精中按梯度脱水。通过在 90 的缓冲液中浸泡 6 min 使抗原愈合，然后用 3%的 H2O2孵化10 min 以灭活内源性过氧化氢酶。然后滴加 BSA以封闭组蛋白，在 4 下加入 TNF和 IL6的一级抗体，之后滴加二抗孵育 20 min，再加入辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育 15 min，加入显色液和苏木素溶液。进行封片后使用倒置显微镜进行观察。1.9统计学处理采用描述性统计分析对实验结果进行统计描述，两组间采用 t检验分析，多组间采用单因素方差分析，P0.05 为差异具有统计学意义。所有的统计分析使用 GraphPad Prism 8进行分析。2 结果 2.1附子作用靶点基因的筛选在 TCMSP 数据库中，将 OB 和 DL 作为靶点基因的筛选条件，找到附子的 21 个活性化合物成分。关于附子的 21 种生物活性化合物成分的详细信息见表 1。然后通过 PubChem 数据库，在剔除 64个重复基因后共得到附子的 203个作用靶点基因。2.2AR靶点基因及重叠靶点基因的筛选通过 GeneCards 数据库，在去除重复基因后筛选出 AR 相关的靶点基因 1 832 个，然后使用 Venny 2.1 软件建立附子的 203 个靶点基因和 AR 的 1 832个靶点基因的连接，共筛选出 68个重叠基因，AR和附子重叠靶点基因的韦恩图见图 1，这是附子治疗AR的作用靶点基因。2.3“化合物基因疾病”网络图构建化合物基因疾病”网络图是研究中药治疗疾1164李琳等.基于网络药理学和实验验证探讨附子治疗变应性鼻炎的作用机制研究病基本过程的有价值的工具。利用 Cytoscape 软件构建 AR 和附子的“化合物基因疾病”网络图如图2所示，中间红色多边形节点表示疾病，浅绿色长方形节点表示附子主要活性化合物包括去氧穿心莲内酯（deoxyandrographolide）、谷甾醇（sitosterol）、水黄皮素（karanjin）和次乌头碱（hypaconitine）等，深绿色 长 方 形 节 点 表 示 附 子 和 AR 的 重 叠 基 因，如PTGS2、TNF、ALB、CXCL8、IL6、VEGFA、JUN等。每种活性成化合物连接多个靶点，多个靶点也连接多种成分，通过该网络图可以表明附子能通过其中的多种化合物成分作用于多个靶点，从而对AR起治疗作用。2.4PPI网络图的构建使用 STRING 数据库建立一个附子和 AR重叠基因的 PPI网络图，见图 3，该网络包括 68个节点和860个连接，然后利用 CytoHubba插件中 MCC 算法方法筛选出附子治疗 AR 的前 10 个重叠枢纽基因主要为 PTGS2、TNF、IL6、AKT1、AL8、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA、JUN，并构建前 10 位重叠枢纽基因网络图见图 4，这些基因是附子治疗 AR的关键基因。2.5GO功能富集分析将 68个重叠靶点基因输入 DAVID 数据库进行GO 功能富集分析，从而可以说明附子治疗 AR存在表 1 附子 21种活性化合物的详细信息Tab 1 Information on 21 Fuzi compounds in detailMol IDMOL002211MOL002388MOL002392MOL002393MOL002394MOL002395MOL002397MOL002398MOL002401MOL002406MOL002410MOL002415MOL002416MOL002419MOL002421MOL002422MOL002423MOL002433MOL002434MOL000359MOL000538Molecule name11,14Eicosadienoic AcidDelphin_qtDeltoinDemethyldelavaine ADemethyldelavaine BDeoxyandrographolideKarakolineKaranjinNeokadsuranic Acid B2,7Dideacetyl2,7HibenzoylTaxayunnanine FBenzoylnapelline6DemethyldesolineDeoxyaconitine(R)NorcoclaurineIgnavineIsotalatizidineJesaconitine(3R,8S,9R,10R,13R,14S,17R)3hydroxy4,4,9,13,14pentamethyl17(E,2R)6methyl7(2R,3R,4S,5S,6R)3,4,5trihydroxy6(2R,3R,4S,5S,6R)3,4,5trihydroxy6(hydroxymethyl)oxan2yloxymethyloxan2yloxyhept5en2yl1,2,3,7,8,10,12,15,16,17decahydrCarnosifloside I_qtSitosterolHypaconitineOB(%)39.9957.7646.6934.5234.5256.3051.7369.5643.1039.4334.0651.8730.9682.5484.0850.8233.4141.5238.1636.9131.39DL0.200.280.370.180.180.310.730.340.850.380.530.660.240.210.250.730.190.220.80.750.26注：OB：口服生物利用度；DL：药物相似性。图 1AR和附子重叠靶点基因的韦恩图Fig 1Allergic Rhinitis and Fuzi targets depicted in a Venny diagram图 2“化合物基因疾病”网络图Fig 2CompoundGeneDisease network diagram1165海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.2023多种潜在靶点的生物学功能。GO 功能富集分析图见图 5 所示，在 GO 功能富集分析中，其中 GO 功能富集在 BP方面，选取排位前 10位相关条目，主要涉及转录正调控、一氧化氮生物合成过程正调控、平滑肌细胞增殖、肿瘤坏死因子产生的正调控等。在CC 中，选取排位前 10 位相关条目，主要是细胞表面、质膜、蛋白复合物和顶端质膜参与主要的细胞成分。在 MF 中，选取排位前 10 位相关条目，主要包括与转录调控区的 DNA 结合、转录因子的结合、核心启动子近端区的序列特异性的 DNA 结合、蛋白质细胞外基质的结合等。2.6KEGG功能富集分析为了探索附子的活性化合物成分通过靶点基因治疗 AR的作用途径，将附子治疗 AR的共同靶点主要富集在 20 条通路上（P0.05），进一步构建KEGG 功能富集分析图，见图 6 所示，包括 TNF 信号通路、T 细胞受体信号通路、Toll 样受体信号通路、HIF1 信号通路等信号通路。选取 Toll样受体信号通路图进行展示，见图 7，其中绿色代表共同基因，结合 PPI网络图中核心靶点基因包含了 Toll样受体信号通络中 IL6和 TNF枢纽基因，因此选择该通路进行后续研究。2.7附子对 AR小鼠鼻黏膜组织病理变化的影响采用 HE 染色法来观察各组小鼠鼻黏膜组织组织学变化结果见图 8。正常小鼠组细胞排列整齐，图 3重叠基因的 PPI网络图Fig 3PPI network diagram of overlapping genes1166李琳等.基于网络药理学和实验验证探讨附子治疗变应性鼻炎的作用机制研究细胞结构完整。与正常组小鼠相比，变应性鼻炎组的鼻黏膜组织表现出不同程度的黏膜完整性的破坏和塌陷，纤维组织增生和炎症细胞浸润的特征。对比变应性鼻炎组，附子组小鼠明显减少了上述的病理改变。2.8蛋白免疫印迹法检测 IL6和 TNFa的蛋白表达水平通过蛋白免疫印迹法检测各组小鼠鼻黏膜中IL6 和 TNF 的表达灰度值统计表分别见表 23。各组小鼠鼻黏膜 IL6 和 TNF 表达水平的 WB 检测结果见图 9。结果显示变应性鼻炎组小鼠鼻黏膜的 IL6 和 TNF 蛋白的表达和正常对照组小鼠相比，差异均具有统计学意义（P0.000 1）。变应性鼻炎组小鼠鼻黏膜的 IL6 和 TNF 蛋白表达量高于附子组，差异均具有统计学意义（P=0.000 2；P0.000 1）。附子组小鼠鼻黏膜中的 IL6表达与正常对照组相比，不具有统计学差异（P=0.269 7）；附子组小鼠鼻黏膜中 TNF的表达与正常对照组相比，图 4MCC算法分析附子治疗 AR的前 10位枢纽重叠基因网络图Fig 4The top 10 hub gene network of Fuzi therapy in response to Allergic Rhinitis were analyzed using MCC图 5GO功能富集分析图Fig 5Evaluation of targets based on the GO图 6KEGG功能富集分析图Fig 6KEGG functional enrichment analysis diagram表 2 各组小鼠鼻黏膜组织 IL6蛋白的表达灰度值统计表（n=10，x s）Tab 2 Statistical table of grayscale values of IL6 protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group（n=10，x s）组别正常对照组变应性鼻炎组附子组FP灰度值0.75020.05961.33550.09140.84150.0247 71.312 0.0011167海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.2023具有统计学差异（P=0.000 1）。以上结果表明，IL6 和 TNF 在小鼠鼻黏膜组织中存在并表达，附子可以通过调节 IL6 和 TNF 的表达来减少炎症反应，这反过来又证实了网络药理学分析的结果。2.9免疫组化法检测 IL6 和 TNFa 的蛋白表达水平为了证实网络药理学数据的有效性，对各小组小鼠鼻黏膜进行免疫组化检测，各组小鼠鼻黏膜组织 IL6的表达水平统计表分别见表 4、5。各组小鼠鼻黏膜 IL6 和 TNF 表达水平的免疫组化检测结果见图 10。IL6 和 TNF 蛋白阳性颗粒大部分存图 7Toll样受体信号通路图Fig 7Tolllike receptor signaling pathway图 8HE染色法观察各组小鼠鼻黏膜组织学变化（40）Fig 8Histological changes of tissues in different experimental mice groups as determined by HE staining（40）表 3 各组小鼠鼻黏膜组织 TNF蛋白的表达灰度值统计表（n=10，x s）Tab 3 Statistical table of grayscale values of TNF protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group（n=10，x s）组别正常对照组变应性鼻炎组附子组FP灰度值0.27190.02510.86580.02920.53110.0369 280.532 0.001表4 各组小鼠鼻黏膜组织IL6的表达水平统计表（n=10，x s）Tab 4 Statistical table of the expression level of IL6 in the nasal mucosa tissue of mice in each group（n=10，x s）组别正常对照组变应性鼻炎组附子组FPIL60.200.050.530.120.280.17 41.683 0.0011168李琳等.基于网络药理学和实验验证探讨附子治疗变应性鼻炎的作用机制研究在于细胞膜和细胞浆中，呈棕褐色或棕黄色。正常组小鼠鼻黏膜上皮未受损，未见炎症细胞浸润，而变应性鼻炎组小鼠腺体和黏膜上皮染色较深，鼻黏膜上皮受损，附子组小鼠鼻黏膜损伤明显较轻，腺体增生程度较少，炎症细胞浸润量较少。结果显示变应性鼻炎组小鼠鼻黏膜 IL6 和 TNF 阳性表达高于正常对照组，具有统计学意义（P0.001；P0.001）。附子组小鼠鼻黏膜 IL6 和 TNF 阳性表达高于正常对照组，具有统计学意义（P0.05；P0.05）。附子组 IL6和 TNF表达低于变应性鼻炎组，具有统计学意义（P0.001；P0.05）。结果表明，附子改善小鼠鼻黏膜的炎症反应。3 讨论 AR 主要是由特应性个体接触过敏原后由 IgE介导的炎症性鼻病24。在特应性个体中，暴露于室内和室外过敏原（包括花粉、霉菌、尘螨和动物皮屑）可能会促进抗原特异性 IgE 的产生。过敏原的重新引入会触发早期和晚期反应，导致 AR 的临床表现25。中药具有多成分、多靶点和多作用途径的特性，并且中医治疗具有高治愈率和成本低等特点26，因此越来越多的人选择使用中医药疗法治疗AR27。从中医角度来看，中医认为鼻子可以反映肺的生理和病理表现。由于外邪（中医认为是致病因素）经口、鼻侵入人体，侵入鼻腔，损害肺的宣降功能，导致津液失调，导致体液变成痰和黏液。这最终导致 AR 的形成28。AR 多源于正气不足，在治疗上，一直以益气温阳为主要原则，附子自古是临床治疗虚弱冷综合征 AR 的典型中药29，30，附子辛热温里，助少阴阳气31，具有提高免疫力和抗炎抗氧化等功能32。另一方面，附子治疗 AR 的作用机制尚不清楚，应用网络药理学可以研究草药或草药处方的成分、目标、途径和作用模式的复杂性33，更A：采用 WB法检测各组小鼠鼻黏膜 IL6和 TNF的表达；B，C：各组小鼠鼻黏膜中 IL6和 TNF蛋白表达水平的统计学分析；*P0.001，*P0.000 1图 9各组小鼠鼻黏膜 IL6和 TNF表达水平的 WB检测结果Fig 9WB results of IL6 and TNF expression levels in the nasal mucosa of mice in each group表 5 各组小鼠鼻黏膜组织 TNF的表达水平统计表（n=10，x s）Tab 4 Statistical table of the expression level of TNF in the nasal mucosa tissue of mice in each group（n=10，x s）组别正常对照组变应性鼻炎组附子组FPTNF0.240.080.590.080.320.10 43.732 0.001A：各组小鼠鼻黏膜中 IL6和 TNF的表达；B，C：各组小鼠鼻黏膜中 IL6和 TNF蛋白表达水平的统计学分析；*P0.01，*P0.001图 10各组小鼠鼻黏膜 IL6和 TNF表达水平的免疫组化检测结果Fig 10Immunohistochemical detection of IL6 and TNF expression levels in the nasal mucosa of mice in various groups1169海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.2023准确地预测附子治疗 AR 的靶点基因和主要作用信号通路。本研究利用网络药理学来阐明附子在 AR 治疗中的潜在生理过程。以 OB20%和 DL0.1的筛选条件下，共筛选出附子的 21种生物活性化合物成分和 203 个靶点基因，生物活性化合物成分包括去氧穿心莲内酯、水黄皮素和次乌头碱等，这是附子治疗 AR 的主要活性化合物。去氧穿心莲内酯含有二萜内酯、黄酮和多酚34，在许多研究中，它已被证明具有抗炎特性35，去氧穿心莲内酯具有二萜内酯和五元内酯环的基本结构发挥抗炎作用36。水黄皮素是一种活性呋喃类黄酮，黄酮类化合物是一种抗炎因子。在大鼠模型的研究表明，水黄皮素通过阻断 H+和 K+ATP 酶而具有抗炎的特性37。次乌头碱可以保护上皮细胞免受氧化应激38。在小鼠中，次乌头碱已被证明具有有效的抗炎作用，能够抑制环氧合酶2、肿瘤坏死因子、白细胞介素1和前列腺素 E2的产生39。根据各靶点基因的重要程度，我们选择了前 10个重要枢纽基因 PTGS2、TNF、IL6、AKT1、ALB、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA、JUN。PTGS2是产生前列腺素家族的关键酶，是非甾体类药物的作用靶点，目前已知可参与细胞炎症、细胞凋亡等生理活动，PTGS2转录由多个与炎症信号通路相关的 细 胞 因 子 触 发，包 括 核 因 子 B、激 活 蛋 白 1 和CCAAT 增强子结合蛋白40。TNF 是 TNF 家族的成员，可调节细胞死亡，促进细胞质膜破裂导致炎症因子的释放41。IL6 限制了中性粒细胞的产生，并增加了粒细胞的死亡。在 AR 中，从快速的宿主防御到适应性持续的全身炎症的变化均与 IL6的促炎作用有关。AKT1 是 P13K 信号通路的重要组成部分，促进鼻黏膜细胞存活和增殖42。CCL2刺激损伤部位的单核细胞和巨噬细胞的迁移和黏附，当 CCL2 与其受体接触时会触发一系列炎症反应。CXCL8参与组织愈合和血管过程，并通过与白细胞受体结合43，招募白细胞到炎症和损伤部位。VEGFA 是一种内皮成纤维细胞生长因子，作为血管生成的调节器，可通过控制内皮细胞的完整性和活性，从而产生最佳的血管形态和功能，并刺激动脉内皮细胞和巨噬细胞44，VEGFA在 AR中具有抗凋亡和血管完整性的功能。通过 KEGG 富集分析，在 HIF1、Toll 样受体、T 细胞受体和 TNF 信号通路中发现了附子治疗AR 相关的枢纽靶点基因。HIF1 受体信号通路介导的转录调控是对抗缺氧相关细胞应激的重要组成部分，机体在抗感染时，血液循环减慢，促炎性细胞因子和抗原消耗更多的氧气，导致局部缺氧和HIF 的激活。HIF 可以无限期地存在，并参与核转录因子的激活代谢反应，然后可以激活 IL4产生的巨噬细胞，增强 NLRP3 炎性小体的激活，增强 IL1、IL6 等炎症细胞因子的释放45。在 AR 小鼠中，由于 HIF1 信号通路的激活，炎症细胞可从鼻黏膜浸润到气道的细胞外环境中46。TNF 信号通路是炎症反应的重要通路，虽然它可以导致某些被病毒感染细胞的死亡，但它对正常细胞没有影响，甚至可以刺激它们的发育。T 细胞受体通路是免疫应答的重要组成部分，它们结合外源性肽导致 T 细胞的活化，当递质被激活时，CD4+向 T 细胞发出信号47，而 CD4+细胞又在 AR 的调控中起着重要作用，因此 T 细胞受体信号通路在 AR 的调控中发挥重要作用。Toll 样受体是型跨膜蛋白天然免疫模式识别受体，可识别自然界中的病原体相关分子模式，启动细胞内信号通路，激活先天免疫反应48，TL