PFGE(脉冲场凝胶电泳) 标准操作规程(SOP).docx

PFGE（脉冲场凝胶电泳） 标准操作规程(SOP)
关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳
目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型

图谱分析：
采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。
系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。

第一天
一、  胶块的制备
1、  在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬
浊液（CSB）；
2、  在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；
3、  在模具上标记好对应样品的名称； 
4、  用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，
用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。
5、  取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵
育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、  从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl蛋白酶K（储存液浓度为
20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。
7、  制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。
8、  在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻
混匀。
9、  将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。
注意事项：
（1）  用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2）  细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3）  在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。
（4）  混合物加入模具时不能产生气泡。
（5）  在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。
二、  细胞的裂解
1、  在50ml的screw-cap tube上做好标记。
2、  配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。
3、  每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。
4、  如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。
（1）  可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。
（2）  一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。
5、  保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、  将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。
7、  将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块
1、  从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉
CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。
注意：
把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。
2、  每管中加入15ml预热的纯水。
3、  确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。
4、  倒掉水，用纯水再洗一次。、
5、  倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。
6、  倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。
7、  倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。
四、胶块内DNA的酶切
1、  在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。
2、  按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。
试剂  µl/胶块  µl /10胶块
纯水  180µl  1800µl
Buffer D  20µl  200µl
总体积  200µl  2000µl
注意：缓冲液要置于冰上。
3、  在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。
4、  小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。
5、  用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。
6、  用同样的方法处理标准株H9812的胶块。
7、  将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。
8、  在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。
试剂  µl/胶块  µl /10胶块
纯水  175µl  1750µl
Buffer D  20µl  200µl
酶（10U/µl）  5µl  50µl
总体积  200µl  2000µl
注意：
（1）  将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。
（2）  用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。
9、  每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。
10、  在37℃水浴中孵育至少2小时。
五、加样
（一）将胶块直接粘在梳子齿上
1、  调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使
其水平。
2、  从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
3、  用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
4、  每管加入200µl 0.5×TBE。
5、  把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳
子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。
6、  用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。
7、  把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面
相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
8、  记录加样顺序。
（二）将胶块直接加在加样孔内
1、  调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶
槽使其水平。
2、  把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃－60℃平 
衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
3、  小心拔出梳子。
4、  从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
5、  用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
6、  每块胶加入200µl 0.5×TBE平衡。
7、  用小铲将胶块加入加样孔。
8、  用溶化的胶封闭加样孔。
注意：
a)  可以在加样孔中加入0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。
b)  记录加样顺序。
六、电泳
1、  确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触
碰电极。
2、  加入2.2L 0.5×TBE,关上盖子。
3、  打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）
和缓冲液在管道中正常循环。
4、  打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右）。
5、  打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。
6、  设置电泳参数。
7、  记录电泳初始电流（通常120－145ma）。
8、  结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。
第二天
七、图像的获取
1、  取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，
1：10,000稀释，即在400ml水中加入40µl储存液）。
注意：
EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。
2、  将托盘放在摇床上摇25-30分钟。
3、  放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。
4、  戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加
入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。
5、  用Gel Doc 2000拍摄图像。
注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。
6、  转换成*.1sc文件用于处理分析。
八、数据的分析

图像的读取

电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力≥768 x 640像素，能够用BioNumerics software (Applied Maths, Inc.)软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。
运用GEL DOC 2000的简单说明：
QUANTITY ONE软件
1、  点击QUANTITY ONE按钮打开该软件。
2、  点击菜单FILE→GEL DOC。
注意：需要10－20秒打开窗口。
3、  打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。
图像的获取
1、  按下EPI-LIGHT按钮打开白光。
2、  把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。
3、  保证调准网格线和过饱和按钮被选中。
4、  改变镜头的MIDDLE RING以调整图像的大（顺时针）小（逆时针），使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。
5、  如果需要，按BOTTOM RING以调整相机的焦距。
注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。
6、  按下EPI-LIGHT关掉白光，按下UV按钮打开透射紫外光。
7、  点击AUTO EXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTO EXPOSE自动关闭而MANUAL EXPOSE被激活。
8、  点击MANUAL EXPOSE的↑↓按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP RING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色）。
注意：如果出现对话框“曝光可以在0.03－360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。
9、  当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。按下UV按钮关掉紫外光（如果开门时UV灯打开，它会自动关闭）。

图像的输出
1、  保存图像（*.1sc）：FILE→SAVE。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。
2、  打印文件：FILE→PRINT→VIDEO PRINT，也可以直接点击屏幕上的PRINT按钮。
3、  转为*.TIFF格式：FILE→EXPORT TO TIFF IMAGE→EXPORT，选择正确的路径。
4、  关闭QUANTITY ONE程序：FILE→EXIT。
5、  取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70％的异丙醇洗干净。
试剂储存液的配制
1、1 M Tris@HCl, pH 8.0*
121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。
或者157.6 g Tris-HCl溶于800 ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。
2、10 N NaOH*
400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。
  3、0.5 M EDTA, pH 8.0*
18   6.1 g Na2EDTA@2H2O溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，分成数份，高压灭菌。
4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)*十二烷基硫酸钠－用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, PFGE
将20克SDS小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35°- 45°C轻轻混匀溶解，定容至100ml。
5、20 mg/ml 蛋白酶K储存液*
100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml离心管中，每管500-600 μl，-20°C保存备用。
6、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE), pH .8.3*
0.9 M Tris base (108 g)
0.9 M Boric Acid (55 g)
0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M)
溶于1000 ml灭菌的纯水中，高压灭菌
注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。
7、Ethidium Bromide（EB）*
10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 μl储存液)，（500ml水中加50ul）。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。

实验试剂

注意：用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。
1、Tris:EDTA Buffer (TE), pH 8.0*－（10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.0）
  10 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.0  
2 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0 
用灭菌的纯水稀释到1000 ml
在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE －用TE Buffer 于:
⑴. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose
⑵. 细菌裂解后洗胶块
在L. monocytogenes PFGE －用TE Buffer于:
⑴.悬浮菌细胞 
⑵. 细菌裂解后洗胶块
2、Cell Suspension Buffer (CS－100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0
用于E. coli O157:H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE
10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
用灭菌的纯水稀释到100 ml
3、Cell Lysis Buffer（CLB）－50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl)，0.1mg/ml Proteinase K (用前再加入)
用于裂解E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobacter jejuni 
25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
50 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
50 ml 10% Sarcosyl 3
用灭菌的纯水稀释到500 ml，每5 ml CLB加入25μl蛋白酶K储存液(20 mg/ml)，使其终浓度为0.1 mg/ml.
5、0.5X TBE Buffer 
200 ml 5X TBE用纯水稀释到2000 ml或
100 ml 10X TBE用纯水稀释到2000 ml
注意：用来稀释5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌。
6、SeaKem Gold Agarose
－做胶块； －电泳胶
报价 seakem gold 琼脂糖 25g 货号50111，1567元人民币。可打9折。
125g 货号 50150 ，BMA， 6422元。 
北京基因公司 10-66001657；上海 021-64951899；广州 020-85524840；020-85524841
天津 022—23011926；西安 029-2501171；成都 028-85228747；沈阳 024-23341315
济南 0531-6560825；武汉 027-87660490；昆明 0871-5199992；杭州 0571-87229824
长沙 0731-2222682；重庆 023-68614842；南京 025-3248693

7、无菌的超纯水
8、蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液（20mg/ml） 
6、限制性内切酶
E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei
    －XbaI,，AvrII (同切限制内切酶BlnI)，SpeI
    (NotI可用于S. sonnei；但不用于E. coli O157:H7) 
  L. monocytogenes，  －AscI, ApaI
  Campylobacter jejuni, C. coli，－SmaI, KpnI
器 材
1、Dade Microscan Turbidity Meter
Spectrophotometer
bioMérieux Vitek Colorimeter
－调整细胞悬浊液的浓度
2、微波炉－溶胶
3、水浴摇床
－裂解胶块中的细胞(54°C)
－用水和TE(50°C)洗胶块
4、56°C水浴箱－平衡和保温熔化的胶
5、25°C, 30°C, 37°C水浴箱－酶切
6、50°C水浴箱－加热用于洗胶块的水和TE，酶切
7、离心机。
8、最少需要两个水浴箱－一个平衡到56°C，另一个到37°C。如果需要，温度可以上下调动。Listeria PFGE中胶块的ApaI酶切需30°C水浴。
耗 材
1、  无菌的Falcon 2054（12-mm x 75-mm）或Falcon 2057（17-mm x 100-mm）－用于细胞悬浊液的制备
基因公司代理 ，
2、无菌的聚酯纤维或棉签－用于从琼脂平板上刮取细菌
3、无菌的枪头或巴斯得吸管
4、无菌的1.5 ml离心管－用于混合细胞悬浊液和胶、酶切
5、无菌的50 ml screw-cap tubes 或50 ml Oak Ridge tubes －用于装胶块， 
6、  Green Screened Caps（Bio-Rad 1703711）－洗胶块时用
伯乐公司 货号 170-3711。
7、模具
－10孔（可重复利用的，2cm x 1cm x 1.5mm）
－50孔（一次性的，1.5mm x 10mm x 5mm)
8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物－用于切胶块
9、无菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃载物片－用于切胶块
10、  一端宽、一端窄的平铲
药铲，生工等公司的实验室耗材部分有。
11、标准胶槽（14 x 13cm的框和平板） 
12、10孔的梳子（14 cm长，1.5 mm宽）
13、15孔的梳子（21 cm长，1.5 mm宽）－Bio-Rad 170-3627
14、胶水平台
15、盛放EB染液的塑料容器
16、70％异丙醇、5%－10%的漂白剂或其它合适的消毒剂
17、各种体积的无菌烧瓶或瓶子（50 ml - 2000 ml）
18、各种规格的无菌量筒（100 ml - 2000 ml）
19、无菌的吸管（2 ml - 50 ml）
20、保护性手套（无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套）
21、防热性手套
22、冰盒

名称：免疫组化 标准操作规程(SOP)
关键词：免疫组化
目的：规范免疫组化操作
主要步骤:
1、脱蜡和水化 
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟； 
4）70%乙醇中浸泡5分钟； 
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 
2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色步骤 
Elivision Plus 法（二步法）
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）抗原修复；（视具体抗体情况决定是否要做修复，本抗体PCNA不需修复） ；
4）PBS洗2～3次各5分钟； 
5）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟 ，以阻断内源型过氧化酶； 
6）PBS洗2～3次各5分钟；
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）甩去PBS液，滴加Ⅱ抗聚合物增强剂40～50μl，室温静置，或37℃半小时；
12）PBS洗3次各5分钟；
13）甩去PBS液，滴加酶标抗鼠/兔聚合物40～50μl，室温静置，或37℃半小时
14）PBS洗3次各5分钟
15）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
16）PBS或自来水冲洗10分钟；
17）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
18）自来水冲洗10～15分钟；
19）脱水、透明、封片、镜检。