生物催化概念下苯佐卡因合成实验的改进_王金丽.pdf

实验教学生物催化概念下苯佐卡因合成实验的改进王金丽丁蕊张守林张幸谢兰贵（南京师范大学化学与材料科学学院江苏南京 ；南京师范大学食品与制药工程学院江苏南京 ）摘要对氨基苯甲酸乙酯（苯佐卡因）的制备是大学有机化学实验教学中的重要内容之一。传统的实验方案是将对硝基苯甲酸在浓硫酸的作用下与乙醇发生酯化反应，然后以铁粉和盐酸为还原条件，将中间产物对硝基苯甲酸乙酯转化成苯佐卡因。本文设计在酯化和硝基还原的步骤中，分别引入超声辅助和生物酶催化的合成手段，使反应可以在温和、环境友好的条件下进行。该方案通过在本科教学实验中引入生物催化的概念，成功避免了强腐蚀性硫酸或盐酸的使用，有效减少了污染性废弃物的产生，在实验安全和绿色合成方面，具有明显的优势。关键词苯佐卡因绿色合成安全性生物催化 ：绿色化学，又称环境友好化学，主要从原料的安全性、过程的节能性和产物与试剂的环境友好性等方面对化学生产进行考评。通过开发符合绿色化学理念的新生产技术和新工艺方法，有效减少有害试剂的使用和污染性废弃物的产生，从源头上减少化学工业对环境带来的负面影响，是绿色化学的长期追求。同样地，利用科研成果中的前沿技术，探索符合绿色化学概念的综合实验方案，以环境友好、安全性高的绿色合成方法代替传统的合成路线，是本科有机化学实验教学改革的重要目标之一。通过新方案和传统方案的对比，不仅能够让学生认识和了解国际最前沿的学术研究进展，而且有利于学生树立安全和环保意识。苯佐卡因（）是对氨基苯甲酸乙酯的俗名，临床上常用作局部表面麻醉剂，同时也是奥索仿、奥索卡因、普鲁卡因等多种药物的生产前体，在药物合成工业中占有重要地位。苯佐卡因的合成是大学有机化学基础实验教学中的常见内容之一，传统实验方案主要以对硝基苯甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与乙醇发生酯化，生成对硝基苯甲酸乙酯，然后在氨水、盐酸或者醋酸溶液中，用过量的铁粉或锡粉进行还原，将硝基转化成氨基，从而得到苯佐卡因。这些方法具有原料易得、产率稳定等优点，但从绿色化学理念的角度考虑，又明显存在着一些待改进的问题：（）反应需使用强腐蚀性硫酸或者盐酸，实验过程存在一定安全隐患，且在反应后会产生酸性废液；（）铁粉或锡粉作为还原剂，在反应过程中被氧化为金属盐副产物，产生量较大，处理困难，并且会对环境造成不利影响。有关该实验的改进已有一些报道，主要涉及寻找温和的反应条件、简便的操作方法和提高反应收率等。生物催化法通常使用水或其他绿色溶剂作为介质，条件温和，环境友好，为建立绿色制造工艺奠定了基础。酶作为一种天然的生物催化剂，可以在中性、常温和常压条件下使用，具有很高的活性和选择性，产生的副产物很少，且具有生物兼容性，在工业应用中变得越来越重要。因此，利用生物酶催化实现化学转化是当前有机化学的重要研究热点，也是绿色化学的重要发展方向之一。硝基还原酶是一类依赖于黄素单核苷酸（，）或黄素腺嘌呤二核苷酸（，）的细胞质酶，可利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（）实现芳香硝基化合物的还原代谢。南京师范大学张幸课题组已成功高效表达硝基还原酶，并在近期研究中发现硝基还原酶的粗酶液具有良好的催化性能。使用粗酶液避免了酶纯化等繁琐步骤，易于大量获得，并可以极大地保留酶的活性。笔者利用该项研究成果，对本科教学中苯佐卡因合成的实验方案进行了改进与创新设计。使用对硝基苯甲酸为起始原料，在超声条件下，以温和化学教育（中英文）（：）年第 卷第 期通信联系人，：；的对甲基苯磺酸为催化剂进行酯化反应，得到对硝基苯甲酸乙酯。然后利用酶催化反应技术将其还原，在室温下即可将硝基转化为氨基，得到苯佐卡因。该实验方案避免了强腐蚀性硫酸或盐酸的使用，并利用生物酶催化代替传统的铁粉或锡粉还原条件，符合绿色化学对原料的安全性、产物与试剂的环境友好性的要求。同时反应具有易检测、可重复性好等特点，适于本科综合实验教学。该实验方案综合运用了超声辅助合成、生物催化技术、薄层色谱监测和核磁共振波谱分析技术，实验综合性强，可有效提高学生的综合实验技能和创新意识。实验目的（）了解以苯佐卡因为代表的药物分子和药物中间体的基本合成方法及过程；（）掌握酯化反应和硝基还原的基本原理和操作；（）通过当前方案与原有合成路线的对比，激发学生对新技术的学习热情，培养创新观念，树立环保意识。实验原理 苯佐卡因的合成路线该方案中苯佐卡因的具体合成路线如图所示，原料对硝基苯甲酸首先在催化剂对甲基苯磺酸的作用下，与乙醇发生酯化反应。该反应利用超声作为辅助合成手段，在反应过程中能够使反应物分散均匀、充分接触，达到加速反应的目的。硝基还原酶利用 作为电子供体，将中间产物对硝基苯甲酸乙酯还原为目标产物苯佐卡因。图苯佐卡因的合成路线 硝基还原酶催化反应机制 图硝基还原酶催化对硝基苯甲酸乙酯的还原机制硝基还原酶的还原机制如图所示，电子供体 进入硝基还原酶（）的活性口袋内部，将其电子转移给硝基还原酶内部的辅基因子（），促使其变成还原态，自身则被氧化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（）并从酶分子上解离下来。随后对硝基苯甲酸乙酯与酶的活性口袋结合，靠 近 还 原 态 的并 发 生 电 子 传 递。重新回到氧化态，促使产物从活性中心解离。该还原转化采用双电子还原机制，首先有个电子被传递给硝基基团，生成亚硝基衍生物，然后亚硝基衍生物被进一步还原，生成羟胺衍生物，羟 年第 卷第 期化学教育（中英文）（：）胺衍生物再被酶催化还原，最终生成氨基产物苯佐卡因。反应的副产物为，是细胞代谢的调控分子，可在线粒体的给电子作用下重新转化成还原态 。实验部分 主要试剂与仪器 试剂对硝基苯甲酸，对甲基苯磺酸一水合物，无水碳酸钠，无水硫酸镁，无水乙醇，硝基还原酶粗酶液，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（），磷酸 盐 缓 冲 液（，），石油醚，乙酸乙酯，茚三酮，二氯甲烷，氘代氯仿，均为市售试剂，纯度为分析纯。仪器电子分析天平，循环水式真空泵，手提紫外灯，旋转蒸发仪，超声波清洗机，型 核磁共振波谱仪，离心机，鼓风电热恒温干燥箱，红外光谱仪。实验步骤 对硝基苯甲酸乙酯的制备在 圆底瓶中依次加入对硝基苯甲酸（，）、对 甲 苯 磺 酸 一 水 合 物（，）和无水乙醇（），摇匀。用锡纸和橡皮筋将瓶口扎紧后，用铁架台和十字夹固定，放置于 超声仪中。设置超声温度为，反应时间为。反应完成后，取出反应瓶，冷却至室温，加入 水，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，调节溶液 为 ，析出固体，抽滤、水洗，在 下干燥至恒重，得白色固体 （），收率为。对硝基苯甲酸乙酯的表征对硝基苯甲酸乙酯核磁共振氢谱：用称量纸槽称取 干燥样品，转移到核磁管中，滴管加入 氘代氯仿，用核磁管帽封好，摇匀。将核磁管按要求接入转子，清洁表面后放入核磁共振仪。按规定设置数据收集参数（溶剂 ，扫描次数 次），采样，扫描。实验所得对硝基苯甲酸乙酯的核磁共振氢谱如图，（，）：（，），（，），（，），（，）。图对硝基苯甲酸乙酯的 谱图对 硝 基 苯 甲 酸 乙 酯 的 红 外 光 谱 如 图，（压片）：（=），（），（）。苯佐卡因的制备将上述制备的对硝基苯甲酸乙酯加入 无水乙 醇（浓度 ），摇 匀 备 用。在 烧杯中依次加入干净的磁力搅拌子、为 的磷酸盐缓冲液（）、上述制备的对硝基苯甲酸乙酯溶液（）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（，）、硝基还原酶粗酶液（终浓度 ）。然后将烧杯置于磁力搅拌器上，于室温下以 转速搅拌。反应 过 程 中，利 用薄层 色 谱 分析 法（）检测反应。在薄层硅胶板上从左到右依次用 的毛细管点上原料点、原料与反应液的混合点、反应液点。然后用石油醚（）乙 酸乙酯（）的展开剂进行展开。待溶剂前沿展开化学教育（中英文）（：）年第 卷第 期 图对硝基苯甲酸乙酯的红外光谱图至合适高度时，利用紫外灯照射显色，观测原料点是否剩余。再将薄层硅胶板浸没在茚三酮显色剂中后取出，用加热枪烘干，观察紫红色产品点（氨基与 茚 三 酮 作 用 显 示 紫 红 色）。并 基 于 上 述 检测结果，判断反应是否基本结束。酶催化反应结束后的 分析结果如图，在 波长下可以观察到反应体系中原料点已经不可见，判断原料基本反应完全。基于茚三酮显色结果初步判断紫红色点为对硝基苯甲酸乙酯的还原产物苯佐卡因。（）图对氨基苯甲酸乙酯（苯佐卡因）的 谱图反应结束后，将反应液转移入离心管，置入离心机，设置转速 ，时间为 。离心结束后，将离心管中的上层清液转移至 的分液漏斗中，并用二氯甲烷萃取（次），合并有机相，然后用无水硫酸镁干燥 ，过滤，蒸发除去溶剂得粗产品。用烧杯取 目硅胶约，加入石油 （）图酶催化还原反应的 分析醚，搅拌均匀后倒入砂芯层析柱（）。沉降完成后加入石油醚，用加压球增压直至流速恒定，然后在石油醚液面相切于硅胶面时，加入薄薄的一层石英砂。用少量的二氯甲烷将样品溶解，再均匀地滴加到层析柱上层，待样品吸附于硅胶后，分批加入展开剂（）进行分离。收集含有产物的流出液，并用旋蒸仪除去溶剂，干燥至恒重，得白色固体 ，产率。苯佐卡因的表征苯佐卡因核磁共振氢谱的测定：用称量纸槽称取 干燥样品，转移到核磁管中，滴管加入 氘代氯仿，用核磁管帽封好。将核磁管按要求接入转子，清洁表面后放入核磁共振仪。按规定设置数据收集参数（溶剂 ，扫描次数 次），采样，扫描。实验所得苯佐卡因的核磁共振氢谱如图，年第 卷第 期化学教育（中英文）（：）（，）：（，），（，），（，），（，），（，）。苯佐卡因的红外光谱如图，（压片）：，（），（=），（）。（）图苯佐卡因的红外光谱图总结该实验适合纳入面向高年级化学、食品以及制药类相关专业本科生的有机化学综合实验课程，建议实验时长，与传统苯佐卡因合成实验的教学时长基本一致，。该实验方案设计将酶催化反应引入实验教学，通过与超声合成技术的有机衔接，成功避免了强酸试剂和过量金属还原剂的使用，降低了实验过程的危险性和污染性。在安全实验的前提下，切实贯彻绿色合成理念，同时实现了最新科研成果在基础教学中的灵活应用，引导学生对实验原理进行深层次思考，激发学生的创新能力。反应产物分别使用 薄层色谱、核磁共振氢谱和红外光谱进行分析和表征，有效综合了合成技术与波谱分析手段。在基础教学中，让学生真实地认识到常规分析手段对生产生活的重要性，加深学生对波谱分析原理的认知及其在实际生产过程中的应用理解。参考文献朱文祥化学教育，（）：，张颖，许海，周 屹 博，等化 学 教 育（中 英文），（）：孙尔康，张剑荣有机化学实验 版南京：南京大学出版社，王莉贤有机化学实验上海：上海交通大学出版社，刘金，韦琨，蔡乐，等大学化学，（）：赵杰，崔玉洁，李文丽当代化工研究，（）：王德平，张复兴，朱小明广东化工，（）：马俊林，刘栓柱士堰职业技术学院学报，（）：李远新，曲伟红，赵岚，等广州化工，（）：刘太泽苯佐卡因的合成研究南昌：南昌大学硕士学位论文，（）：白敬大肠杆菌硝基还原酶 的分子改造及其催化特性大连：大连理工大学博士学位论文，（）：（，；，），；化学教育（中英文）（：）年第 卷第 期