基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究.pdf

果树学报2023，40（8）：1534-1545Journal of Fruit ScienceDOI:10.13925/ki.gsxb.20230008基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究刘有春1，李嘉琦1，魏鑫1，杨艳敏1，张舵1，王兴东1，孙斌1，杨玉春1，王升1，高树清1，王宏光1，徐艺格1，袁兴福2，刘成1*（1辽宁省果树科学研究所，辽宁营口 115009；2辽宁省农业科学院，沈阳 110161）摘要：【目的】利用越橘属栽培品种及野生资源在全基因组范围内筛选差异SNP分子标记，分析其遗传变异，了解不同类型群体间的遗传变异、基因交流、群体结构，为越橘种质创新提供遗传背景依据。【方法】以越橘属9个种的62份种质资源为材料，利用特异性位点扩增片段测序技术（SLAF-seq）获得的基因组SNP标记比对到品种Draper参考基因组上，进行供试材料遗传研究。【结果】测序获得169.87 Mb reads数据，平均Q30值94.99%，包含172 513个多态性SLAF标签，筛选到高质量SNP标记4 133 595个，均匀分布在越橘12条染色体上。基于SNP标记的系统进化树准确反映了供试野生、北高丛和南高丛类群遗传差异以及品种间系谱遗传关系，反映出野生类型与栽培品种遗传差异显著，供试野生种具有独立的遗传背景且种间无基因交流发生，但野生种到栽培种存在单向的基因流；栽培品种类群存在明显的亚群结构，亚群间存在普遍的基因交流；半高丛品种北陆和南高丛品种军号与北高丛类型紧密聚类，矮丛品种美登、半高丛品种北村、黑珍珠遗传背景倾向于野生种。【结论】栽培品种近亲杂交和骨干亲本高频率使用导致品种间基因交流频繁、同质性高、遗传基础狭窄，野生种具有独立的遗传背景，但存在野生种到栽培种的单向基因流，应加大野生资源发掘利用以拓宽越橘遗传基础。关键词：越橘；SLAF-seq技术；SNP；遗传群体结构中图分类号：S663.9文献标志码：A文章编号：1009-9980(2023)08-1534-12收稿日期：2023-02-03接受日期：2023-04-02基金项目：国家现代农业产业技术体系专项（CARS-29-yc-10）；辽宁省“揭榜挂帅”科技攻关专项（2021JH1/10400036）作者简介：刘有春，副研究员，博士，研究方向为蓝莓遗传与育种。Tel：[phone]，E-mail：*通信作者Author for correspondence.Tel：[phone]，E-mail：Genetic variation and structure analysis of different type blueberries(Vaccinium spp.)based on SLAF-seq technologyLIU Youchun1,LI Jiaqi1,WEI Xin1,YANG Yanmin1,ZHANG Duo1,WANG Xingdong1,SUN Bin1,YANG Yuchun1,WANG Sheng1,GAO Shuqing1,WANG Hongguang1,XU Yige1,YUAN Xingfu2,LIUCheng1*(1Liaoning Institute of Pomology,Yingkou 115009,Liaoning,China;2Liaoning Academy of Agricultural Sciences,Shenyang 110161,Lia-oning,China)Abstract:【Objective】Blueberry belongs to the genus Vaccinium of family Ericaceae,and has recentlyreceived much attention as blueberries have high contents of anthocyanins,flavonols,procyanidins andother types of phenolic compounds,which can improve night vision,increase anti-cancer activity andreduce the risk of heart disease.The consumption and cultivation acreage of blueberries is thus continu-ally increasing worldwide.By 2020,the total cultivated area of blueberries in the world was 2 056 700hm2and 66 400 hm2in China,with a total production of 347 200 t.Blueberries are very rich in species,including the tetraploid highbush blueberries(Vaccinium corymbosum),lowbush blueberries(V.augusti-folium)and hexaploid rabbiteye blueberries(V.ashei),and the diploid species V.uliginosum,V.vitis-idaea,V.macrocarpon etc.However,their inter-or introgenetic background and phylogenetic relation-，等：遗传变异和群体结构研究第8期ship are still unclear,resulting in an unclear background of blueberry genetic diversity.The study couldimprove the understanding of the genetic basis of blueberries,by means of the genome-wide SNP mark-ers to recognize the genetic variation and gene introgression between different blueberry populations.【Methods】In this study,a total of 62 germplasm resources of 9 blueberry species were used as materi-als.The specific amplified fragment sequencing technology(SLAF-seq)was used to facilitate sequenc-ing and accompanied by the reference genome of southern highbush blueberry draper.The sequencingreads were compared with the reference genome using BWA software(v 0.7.17),and data quality wascontrolled using GATK(v 4.1.7.0)and SAM tools,respectively;the intersection of SNP markers ob-tained by the two methods was used as the final reliable SNP marker dataset.Based on the final reliableSNP,the vcf tools software(v 0.1.16)was used to remove markers with a deletion rate over 20%or aMAF less than 0.05.The SNP hylo software(v 20140701)was used to filter SNPs with a depth of lessthan 3 and a deletion rate of less than 20%to obtain SNPs for further data statistics and analysis.First,the phylogenetic tree was drawn using the obtained SNP markers,and the validity and accuracy of themarkers were verified by combining the phylogenetic tree and the traditional classification of the testmaterials.Then,the genetic structure of the test materials was analyzed using the Admixture software tounderstand the genetic background and individual genetic composition.To display the genetic back-ground differences and genetic relationships of the test materials more intuitively,the SNP Relate(v1.30.1)software package in R was used for Principal Component Analysis(PCA),and the ggplot2(v3.3.6)was used for visualization.【Results】We harvested 169.87 MB reads data,with an average Q30value of 94.99%and an average GC content of 40.24%,and detected a total of 319590 SLAF tags in 62blueberry materials.172 513 polymorphic SLAF tags were verified by comparison with the referencegenome.A total of 76 299 105 population SNP markers were detected using the GATK and SAM toolsmethods.A total of 4 133 595 population SNP markers were screened by integrity0.8 and minor allelefrequency(MAF)0.05,5.08%of the total SNP were evenly distributed among 12 chromosomes ofblueberry.The phylogenetic tree was constructed based on the SNP markers and reflected the signifi-cant genetic differences among wild,northern highbush and southern highbush blueberry and the genet-ic relationships among cultivars,confirming the effectiveness and reliability of SNP markers in thisstudy.The analysis of population structure based on SNP loci showed that there were significant geneticdifferences between wild types and cultivars,with the increase of K value,there was no subpopulationin wild types all the time,indicating that the tested wild types had independent genetic background andthere was no gene exchange between the types,but there was unilateral gene flow from wild species tocultivars,suggesting that materials from wild species were used in the cultivation process of some culti-vars,However,the cultivars had an obvious subgroup structure,suggesting that there was universalgene exchange between the subgroups.The classification of half-highbush blueberry Northland andsouthern highbush blueberry Reveille was closely clustered with the northern highbush type,The genet-ic background of the lowbush blueberry Blomidonand and half-highbush blueberry Northcountry andBlackpearl tended to be wild species at the genome-wide level.【Conclusion】The frequent use of back-bone apparent varieties in breeding has increased the pattern of gene introgression between the bred cul-tivars,resulting in high genetic homogeneity in blueberries nowadays.The wild blueberry species aredifferent in habitats and geographic distribution from the cultivars,and have an obviously different ge-netic background.Key words:Blueberry;SLAF-seq;SNP;Genetic structure刘有春，等：基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究1535果树学报第40卷越橘，又名蓝莓（blueberry），果实富含花青苷、超氧化物歧化酶（SOD）、黄酮和其他酚类化合物等功能性营养成分，有助于提高视力、增强抗癌能力和降低心脏病发生等，备受市场关注和消费者青睐1-2。种植高效益和巨大的市场潜力使越橘成为目前全球发展最快的果树树种，到2020年，全球越橘栽培总面积20.567万hm2，中国由2008年的0.12万hm2快速增加到 2016 年的 2.20 万 hm2后，又增加到 2020 年的6.64万hm2，总产量34.72万t，产量和面积跃居全球第一位3，在中国经济发展中发挥了重要作用。越橘为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vacciniumspp.）植物，全世界越橘属植物约有400个种4，染色体倍性多样性丰富。高丛越橘（Vaccinium corymbo-sum）、兔眼越橘（V.ashei）、矮丛越橘（V.augustifoli-um）是世界范围内主要的商品化栽培种，其中高丛越橘品种（包括半高丛、北高丛和南高丛类型）为四倍体（2n=4x=48），而兔眼蓝莓是六倍体（2n=6x=72）5-6，笃斯越橘（V.uliginosum）、红豆越橘（V.vitis-idaea）、蔓越橘（V.macrocarpon）等野生种为二倍体（2n=2x=24）7类型。最新研究发现，四倍体越橘基因组大小高达1.68 Gb，杂合度高，整个基因组上包含 128 559 个基因，每个单倍型染色体上平均有32 140 个蛋白质编码基因8，是目前组装质量最好的四倍体越橘基因组，为高通量测序获取大规模SNP（single nucleotide polymorphisms）标记深入挖掘遗传变异信息、群体遗传进化和遗传多样性研究奠定了条件基础。SLAF-seq技术（特异长度扩增片段测序，Spe-cific-locus amplified fragment sequencing）是一种新的简化基因组测序技术，它具有测序深度高、可避免大量重复序列、能获得大量SNP标记和In-Del标记等优点9，已成功应用在高杂合度木本植物中，而在越橘上鲜见相关报道。笔者实验室通过前期开发的越橘EST-SSR标记7已初步掌握了我国越橘种质资源存在与抗寒性、低温需冷量等对应的遗传差异10。开展科学系统的种质资源评价、特异资源筛选及野生资源利用，离不开遗传多样性及遗传结构的精准鉴定。然而，我国越橘种质资源研究中不同类型的越橘群体间遗传变异、基因交流、群体结构问题仍不明确，导致越橘遗传多样性背景不清晰，无法为越橘育种提供有效参考依据。为此，笔者在本研究中以越橘属多种类型（栽培种和野生种）、不同倍性（二倍体、四倍体和六倍体）越橘为试材，通过SLAF-seq技术获得大量SNP标记分析遗传变异和群体结构，探讨遗传背景及开发利用途径，为科学开展新品种选育提供参考和依据。1材料和方法1.1材料供试越橘种质资源材料取自辽宁省果树科学研究所越橘种质资源圃，其中包括野生类型11份，从国外引进栽培品种51份，涉及越橘属9个种（spe-cies）和北高丛、南高丛、半高丛、矮丛、兔眼5个栽培类型（表1）。1.2基因组DNA提取供试材料幼叶利用液氮速冻后存于-80 冰箱备用。用改良CTAB法7提取基因组DNA，用Nano-drop 2000C超微量核酸蛋白测定仪（Thermo Fisher）和Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher）进行DNA的质量和浓度检测，所提基因组DNA OD260与OD280的比值分布在1.82.0，DNA质量浓度达到30 ngL-1，达到测序文库构建要求。1.3酶切建库与测序评估根据酶切片段在基因组上是否均匀分布、大小是否与实验体系相吻合等原则11，采用SLAF-predict软件利用四倍体越橘品种Draper作为参考基因组（http:/gigadb.org/dataset/100537）8，以 Hae、Rsa、RsaHae 和RsaRsa 4种酶切方案进行电子酶切预测实验，根据开发的标签数等确定酶切方案。选择水稻品种日本晴（Oryza sativa ssp.ja-ponica）（http:/rapdb.dna.affrc.go.jp/）作为对照，同步进行平行试验，利用SOAP12软件对日本晴-水稻测序数据和水稻基因组数据进行比对，进行酶切效益评估，确保试验的准确性。1.4SLAF标签获得、SNP标记与验证文库质检合格后用Illumina测序，供试不同倍性的越橘测序数据依照参考基因组倍性（2n=2x=24）统一标准进行分析。利用BWA软件（v0.7.17）将测 序 reads 比 对 到 参 考 基 因 组 上，使 用 GATK（v4.1.7.0）13和SAMtools14分别进行数据质控，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集，用于进一步的数据统计和分析。使用vcftools（v0.1.16）软件，剔除缺失率大于20%或MAF1536，等：遗传变异和群体结构研究第8期小于0.05的标记。使用SNPhylo软件（v 20140701）对SNP进行过滤，过滤标准为：-p 10-c 3-l 0.2-M 0.2（深度低于3的样本比例小于10%，且缺失率小于20%），连锁不平衡R2大于0.2，将vcf文件转置为phy格式后，用Phy-ML3.0软件的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树，并进行1000次bootstrap分析（-mHKY85-b 1000），使用iTOL（v6.6）进行进化树的可视化分析。1.5群体遗传结构分析在进行群体遗传结构分析之前，先使用plink软件（v1.90b）用滑窗法过滤掉连锁不平衡位点，滑窗窗口大小50 kb，滑窗步长10个SNP，连锁不平衡R2阈值0.2（-indep-pairwise 50 10 0.2），根据所筛选出的SNP位点17 747个，占总数0.4%，采用Admixture软件（v1.3.0）进行遗传结构分析（for K in 1 2 3 4 5 67；do admixture-cv file.bed$K|tee log$K.out;done）。利 用 R（v4.2.1）中 的 软 件 包 SNP Relate（v1.30.1）进行PCA（principal component analysis）分析，首先使用snpgdsVCF2GDS函数将目标vcf文件转成gds格式，之后用snpgdsPCA函数对文件进行PCA分析，并使用ggplot2（v3.3.6）进行可视化分析。2结果与分析2.1酶切方案与建库评估Hae、Rsa+Rsa、RsaHae和Rsa不同酶切方案产生的SLAF标签存在差异，其中Rsa酶切产生的SLAF标签最多，共计148 190个，片段长度在414416 bp，在基因组上均匀分布，确定为最终酶切方案。将水稻日本晴的测序reads与其参考基因组进行比对，结果显示双端比对效率为97.26%，酶切效率为92.76%（表2），SLAF建库正常。所有供试越橘属植物测序共获得 169.87 Mbreads数据，各种质样品获得的读长数目在1 722 2856 413 536 bp，其中笃斯越橘数据量最小，N6数据量最大。不同样品测序Q30在93.92%95.98%，平均为表 1越橘采样信息Table 1Sampling information of Vaccinium种名Species笃斯越橘V.uliginosum红豆越橘V.vitis-idaea蔓越橘V.macrocarpon云南越橘V.duclouxii乌饭树V.bracteatumSparkleberryV.arboreum矮丛越橘V.augustifolium半高丛越橘V.corymbosum（HHB）北高从越橘V.corymbosum（NHB）南高从越橘V.corymbosum（SHB）兔眼越橘V.ashei类型Types野生 Wild野生 Wild野生 Wild野生 Wild野生 Wild野生 Wild栽培Cultivar栽培Cultivar栽培Cultivar栽培 Cultivar栽培 Cultivar品种份数Accessions ofvariety3231111629123品种名称Name of variety1.笃斯越橘01；2.笃斯越橘02；3.笃斯越橘031.Bog bilberry-01;2.Bog bilberry-02;3.Bog bilberry-034.红豆越橘01；5.红豆越橘024.Lingonberry-01;5.Lingonberry-026.蔓越橘01；7.蔓越橘02；8.蔓越橘036.Cranberry-01;7.Cranberry-02;8.Cranberry-039.云南越橘 9.V.duclouxii10.乌饭树 10.Oriental blueberry11.Sparkleberry12.美登12.Blomidon13.北村；14.北极星；15.北蓝；16.北陆；17.黑珍珠；18.齐佩瓦13.Northcountry;14.Polaris;15.Northblue;16.Northlande;17.Blackpearl;18.Chippewa19.埃利奥特；20.奥罗拉；21.伯克利；22.布里吉塔；23.达柔；24.杜克；25.克瑞顿；26.莱格西；27.蓝丰；28.蓝金；29.蓝鸟；30.蓝片；31.蓝塔；32.利伯蒂；33.鲁贝尔；34.努益；35.钱德勒；36.日出；37.瑞卡；38.塞拉；39.双迪；40.斯巴坦；41.陶柔；42.晚蓝；43.喜来；44.早蓝；45.泽西；46.M7；47.N219.Elliott;20.Aurora;21.Berkeley;22.rigitta;23.Darrow;24.DuKe;25.Croaton;26.Leg-acy;27.Bluecrop;28.Bluegold;29.Bluejay;30.Bluechip;31.Bluetta;32.Liberty;33.Ru-bel;34.Nui;35.Chandler;36.Sunris;37.Reka;38.Sierra;39.D-;40.Spartan;41.Toro;42.Lateblue;43.Sierra;44.Earliblue;45.Jersey;46.M7;47.N248.比洛克西；49.明星；50.奥尼尔；51.海岸；52.久比利；53.库帕；54.密斯梯；55.夏普蓝；56.军号；57.双丰；58.N5；59.N648.Biloxi;49.Star;50.ONeal;51.Gulfcoast;52.Jubilee;53.Cooper;54.Misty;55.Sharp-blue;56.Reveille;57.Sweetheart;58.N5;59.N660.粉蓝；61.红粉佳人；62.精华60.Powderblue;61.Pink lemonade;62.Choice刘有春，等：基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究1537果树学报第40卷94.99%，GC含量占38.91%40.93%，平均为40.24%（表3），表明测序碱基错误率低，获得的数据可靠，可用于后期分析。2.2SLAF标签、SNP分子标记统计样品平均测序深度为10.65，通过对序列进行分析，从62份越橘材料中共检测到319 590个SLAF标签，通过BWA软件将SLAF标签定位到参考基因组上，多态性SLAF标签172 513个，利用GATK和SAMtools 两种方法共得到 76 299 105 个群体 SNP标 记，根 据 完 整 度 0.8、次 要 等 位 基 因 频 率（MAF）0.05 过滤，共筛选得到 4 133 595 个群体SNP标记，占SNP总量的5.08%，各样品完整度为12.92%44.30%，平均为29.77%，杂合率为3.06%9.78%，平均为5.44%，说明供试样品基因组杂合度较高（表4）。根据SLAF标签和SNP标记在染色体上的分布，绘制染色体分布图，SLAF标签和SNP标记比较均匀的分布在越橘12条染色体上（图1），其中在第6号染色体上有SNP的集中分布区域。2.3SNP标记验证笔者在本研究中利用基于SNP标记的系统进化树是否能准确反映供试材料的类群划分和亲缘关系来验证SNP标记的有效性（表5，图2）。如图2（聚类图中心）所示，在系统进化树中，包括野生种和栽培种在内的越橘属9个种62份试材主要形成3个类群。Cluster （绿色）：野生种类群，系统进化树的最原始端，包含供试的所有二倍体野生种、六倍体兔眼越橘，矮丛品种美登、半高丛品种北村、黑珍珠等品种在野生种群中形成分支，反映了从野生中驯化而来的进化过程；Cluster （蓝色）：北高丛越橘品种为主的栽培类群；Cluster （红色）：南高丛越橘品种为主的栽培类群，其中蓝丰、瑞卡、努益3个北高丛品种分属在该类群上。为了更清晰、更明确地体现SNP标记反映的品种间亲缘关系，本研究列出了品种系谱（表5），系谱比对分析发现，在选育过程中拥有相同亲本及互为亲子关系的品种，如库帕与海岸拥有相同父母本，斯巴坦和蓝片拥有相同父本，瑞卡与蓝丰、陶柔与早蓝、蓝鸟与伯克利、奥罗拉与埃利奥特等系亲子关系，均在图2中彼此紧密聚类；骨干亲本的杂交后代聚为一类，如早蓝、达柔、康维尔等为亲本的后代多数聚为类群A，斯坦雷、蓝丰、泽西、先锋、伯克利、维口等为亲本的后代聚为类群B，以美国农业部US系列亲本及佛罗里达大学Florida系列亲本的杂交后代聚为类群C。综上，基于SNP的系统进化树和聚类分析能够较准确地反映供试材料的植物学分类和亲缘关系等遗传信息。表 4SLAF 标签和 SNP 标记数据统计Table 4Data statistics of SLAF and SNP值 Value最小值Min最大值Max平均值Min总和SumSLAF 标签信息 SLAF informationSLAF标签数SLAF number243977945239319 590平均测序深度/xAverage depth/x7.5720.0210.65SNP 标签信息 SNP informationSNP标签数SNP number534 1311 831 0061 230 63176 299 105完整度Integrity ration/%12.9244.3029.77杂合率Heterozygosity/%3.069.785.44注：x 表示基因组大小倍数；完整度，即每个样品 SNP 在全部样品中的信息比重；杂合率，即每个样品含两种或两种以上碱基类型的 SNP 所占比重。Note:x represents the multiple of genome size;Integrity ration,the information proportion of each sample SNP in all samples;Heterozygosity,theproportion of SNPs containing two or more base types in each sample.表 2根据酶切方案设计预测信息Table 2Information prediction according to the enzymedigestion method酶EnzymeHae Rsa+RsaRsa+Hae Rsa插入片段大小Insert fragment size/bp364414314344414444414416SLAF个数SLAF number110 704120 461127 672148 190表 3越橘及对照测序结果Table 3Sequencing result of blueberry and control样品Sample越橘Blueberry对照 Control最小值Min最大值Max平均值Min测序片段数Total reads1 722 2856 413 5362 570 1462 202 899GC含量GC content/%38.9140.9340.2440.30Q30值Q30value/%93.9295.5894.9993.961538，等：遗传变异和群体结构研究第8期2.4群体遗传结构分析2.4.1越橘群体结构分析基于筛选获得的4 133595个SNP位点，根据K-1数的Q值分布，设定类群数目（K 值）为 110 进行聚类，当交叉验证错误率（CV error）最低时为最优分群数，结果显示K=2时为最优结果，选择可以反映供试越橘主要群体结构变化的K值范围，即K=27的群体结构结果见图3。K=2时供试材料形成两个清晰完整的类群，类群包含笃斯越橘、蔓越橘、红豆越橘、云南越橘、乌饭树、Sparkleberry，归类为野生群簇，类群由南高丛越橘、北高丛越橘、半高丛越橘、兔眼越橘、矮丛越橘等组成，归类为栽培群簇，表明野生类型与栽培品种在遗传信息组成上存在明显差异，部分栽培品种中嵌合野生资源基因，即存在从野生种到栽培种的单向基因上图为 SLAF 标签在越橘染色体上的分布情况；下图为 SNP 标记在越橘染色体上的分布情况。每一个条带代表一条染色体，图中颜色越红的区域即 SLAF 标签和 SNP 标记分布越集中的区域。The top figure represents the distribution of total SLAFs on the reference genome;B:The bottom figure represents the distribution of SNPs on thereference genome.Each strip represents a chromosome,the deeper the red color area is SLAF label and SNPs distribution area.图 1SLAF 标签（上）和 SNP 标记（下）在染色体上的分布Fig.1Distribution of SLAFs(top)and SNPs(bottom)on chromosomesThe number of SLAF within 1Mb window sizeThe number of SNP within 1Mb window size04080120160200240280320320097319462919389248655838681177847784vaccDscaff1vaccDscaff2vaccDscaff3vaccDscaff4vaccDscaff5vaccDscaff6vaccDscaff7vaccDscaff8vaccDscaff9vaccDscaff10vaccDscaff11vaccDscaff12vaccDscaff1vaccDscaff2vaccDscaff3vaccDscaff4vaccDscaff5vaccDscaff6vaccDscaff7vaccDscaff8vaccDscaff9vaccDscaff10vaccDscaff11vaccDscaff125 Mb10 Mb15 Mb21 Mb26 Mb31 Mb36 Mb41 Mb46 Mb5 Mb10 Mb15 Mb21 Mb26 Mb31 Mb36 Mb41 Mb46 Mb刘有春，等：基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究1539果树学报第40卷表 5供试材料系谱Table 5Pedigree of tested materials编号No.12345678910111213141516171819202122232425262728材料Accession蔓越橘 1 Cranberry-1蔓越橘 2 Cranberry-2蔓越橘 3 Cranberry-3红豆 1 Lingonberry-1红豆 2 Lingonberry-2笃斯越橘 1 Bog bilberry-1笃斯越橘2Bog bilberry-2笃斯越橘3Lingonberry-3云南越橘 V.duclouxii乌饭树 Oriental BlueberrySparkleberry美登 Blomidon北村 Northcountry北极星 Polaris北蓝 Northblue北陆 Northland黑珍珠 Blackpearl齐佩瓦 Chippewa埃利奥特 Elliott奥罗拉Aurora伯克利 Berkeley布里吉塔