基于UHPLC-QTRAP-MS_MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价.pdf

第42 卷 第 8 期2023 年8 月Vol.42 No.8907919分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）基于UHPLCQTRAPMS/MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价薛佳1，陈海杰1，周永逸1，石婧婧1，邹立思1，袁嘉欢1，蔡芷辰1，吴楠1，陈翠花1，刘训红1，2*，杨薇1，程建明1，2（1南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2江苏省经典名方工程研究中心，江苏 南京 210023）摘要：建立了超高效液相色谱三重四极杆线性离子阱串联质谱（UHPLCQTRAPMS/MS）同时测定淫羊藿中黄酮类、生物碱类、酚酸类、氨基酸类及核苷类共50种活性成分的分析方法，并对其多元活性成分的动态累积进行分析与评价。采用 Agilent ZORBAX ExtendC18（2.1 mm 100 mm，1.8 m）色谱柱，以水（含0.2%甲酸）乙腈为流动相梯度分离，流速0.3 mL/min，柱温40。质谱配备电喷雾离子源，在正、负离子模式下采用多反应监测模式（MRM）进行测定；采用单因素实验及响应面法优化样品制备条件，灰色关联度分析（GRA）对不同采收期淫羊藿样品进行分析与评价。结果显示，50种目标成分在一定范围内线性关系良好（r2 0.999 0），精密度、重复性和稳定性良好，平均加标回收率为94.5%107%，相对标准偏差（RSD）均小于5.0%。淫羊藿中多元活性成分累积量在7月中旬出现峰值，不同类别成分累积规律具有一定差异性。6月下旬至7月下旬所采收的淫羊藿药材综合质量较好，与当地传统采收期基本吻合。该研究所构建的方法准确、可靠，可为探究淫羊藿中多元活性成分动态累积规律及确定适宜采收期提供依据，同时也箭叶淫羊藿药材质量的综合评价和整体控制提供方法参考。关键词：淫羊藿；多元活性成分；动态累积；超高效液相色谱三重四极杆线性离子阱串联质谱（UHPLCQTRAPMS/MS）；灰色关联度分析（GRA）中图分类号：O657.63；TQ460.72 文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）08-0907-13Analysis and Evaluation on Dynamic Accumulation of Multiple Bioactive Constituents in Epimedii Folium Based on UHPLCQTRAPMS/MSXUE Jia1，CHEN Hai-jie1，ZHOU Yong-yi1，SHI Jing-jing1，ZOU Li-si1，YUAN Jia-huan1，CAI Zhi-chen1，WU Nan1，CHEN Cui-hua1，LIU Xun-hong1，2*，YANG Wei1，CHENG Jian-min1，2（1School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2Jiangsu Province Engineering Research Center of Classical Prescription，Nanjing 210023，China）Abstract：An ultra high performance liquid chromatographytriple quadrupole linear ion-trap mass spectrometry（UHPLCQTRAPMS/MS）was developed for the simultaneous determination of 50 active constituents including flavonoids，alkaloids，phenolic acids，amino acids，and nucleosides in Epimedii Folium harvested at different periods，and the dynamic accumulation of multiple active conctituents was analyzed and eveluatedThe samples were separated on an Agilent ZORBAX ExtendC18 column（2.1 mm 100 mm，1.8 m）by gradient elution，with 0.2%formic acid aqueous solutionacetonitrile as mobile phase at 40 and a flow rate of 0.3 mL/min，then determined by MS with electrospray ion source in positive and negative modes under the multiple reaction monitoring（MRM）modeMeanwhile，single factor experiment and response surface methodology were used to optimize the extraction conditionsGrey correlation analysis（GRA）was used to analyze and evaluate the samples harvested at different periodsThe results showed that there were good correlations between the mass concentrations of 50 constituents and the corresponding peak areas，with correlation coefficients（r2）not less than 0.999 0.The method showed good precision，repeatability and stadoi：10.19969/j.fxcsxb.23040101收稿日期：20230401；修回日期：20230506基金项目：江苏高校品牌专业建设工程资助项目（PPZY2015A070）通讯作者：刘训红，教授，博士生导师，研究方向：中药鉴定与品质评价，E-mail：第 42 卷分析测试学报bility for all the target constituentsThe average recoveries ranged from 94.5%to 107%，with RSDs less than 5.0%The accumulation of multiple active constituents in Epimedii Folium reached its peak level in mid-July，and there were certain differences in the accumulation patterns for each category of constituents.The results of GRA showed that the top three quality samples are S9，S8，and S10，and the maximum ri difference value was 31.63%，indicating that the GRA model could distinguish the quality of Epimedii Folium in different harvesting periodsSamples collected from late June to late July had better quality，which were consistent with the traditional harvest period.With accuracy and reliability，the method established in this paper provides an experimental basis for exploring the dynamic accumulation patterns of multiple active constituents and further clarifying the appropriate harvest period of Epimedii Folium，and it also offers a new method reference for the comprehensive evaluation and overall control on the quality of Epimedii Folium.Key words：Epimedii Folium；multiple bioactive constituents；dynamic accumulation；ultra high performance liquid chromatographytriple quadrupole linear ion-trap mass spectrometry（UHPLCQTRAPMS/MS）；grey correlation analysis（GRA）淫羊藿（Epimedii Folium）又名“三枝九叶草”，始载于 神农本草经1，是临床常用药材，药用部位为叶，其味辛、甘、温，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之传统功效2。箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim）为淫羊藿药材的主要植物来源之一3。多项研究表明，淫羊藿药材中的活性成分种类丰富，包括黄酮4、多糖5、木脂素、生物碱6、有机酸7、挥发油、氨基酸及核苷8等。其中黄酮类成分含量最为丰富，以淫羊藿多苷（淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C）为代表的黄酮醇苷类成分在应对骨和骨关节、内分泌组织、心血管系统、免疫组织及肿瘤等疾病时均具有良好的功效910；多糖类成分有抗病毒、抗肿瘤11、延缓衰老12、调节免疫等药理作用5，13；生物碱可通过提高睾丸和附睾系数达到保护生殖系统作用14；同时，淫羊藿在治疗哮喘、低血糖、炎症等疾病时也有显著效果1516。中药材质量的优劣与采收环节密切相关，适时采收是中药产业实现质量标准的重要前提17，对确保药材临床疗效有着十分重要的意义。中药材化学成分组成复杂，且随着生长过程呈现动态变化18。2020版 中国药典 仅规定淫羊藿药材夏、秋季茎叶茂盛时采收2，但时间跨度较大，并未对采收期提供更加确切有效的指导19。目前对于淫羊藿适宜采收期相关研究报道尚少，考察其适宜采收期的成分指标仅限于药材中一种或几种黄酮醇苷类成分2022。因此，为保证淫羊藿药材质量的均衡和优良，有必要进一步探究淫羊藿中多元活性成分的动态累积规律，从而为确定淫羊藿药材适宜采收期提供理论依据。淫羊藿药材目前在质量评价中多选取单一或单黄酮类成分进行考察，分析方法有高效液相色谱法（HPLC）2226、快速分辨液相色谱法（RRLC）27和超高效液相色谱法（UPLC）28等。传统HPLC方法耗时较长，对极性相似的化合物分离效果较差2931。超高效液相色谱三重四极杆线性离子阱质谱（UHPLCQTRAPMS/MS）有效地解决了HPLC中不同类别化合物分离困难的问题，能在同一时间内完成对多个、多类成分的含量测定3233。中药遵循中医药理论的指导，具有系统性和整体性的特点34。中药质量控制与评价体系的建立应符合整体性观念、精准性理念及系统性思维，仅从单一或一类化学成分来评价淫羊藿药材质量，无法避免地存在局限性，需要建立更加完善的质量标准体系，才能符合中药“多成分、多靶点”起效的特点35。因此，针对淫羊藿多元活性成分的特点，建立多元活性成分同时测定的方法，对探讨多元指标成分的综合评价体系，具有科学性与实用性。为进一步建立淫羊藿药材质量评价综合体系，本文建立了UHPLCQTRAPMS/MS技术同时测定不同采收期箭叶淫羊藿中50种活性成分（黄酮类、生物碱类、酚酸类、氨基酸类和核苷类）含量的方法，综合考察不同采收期箭叶淫羊藿中多元活性成分的动态累积变化，并结合灰色关联度分析（GRA）对不同采收期箭叶淫羊藿样品进行综合评价，为揭示箭叶淫羊藿中多元活性成分的动态累积规律及确定其适宜采收期提供基础数据，同时为淫羊藿药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的参考方法。908第 8 期薛佳等：基于UHPLCQTRAPMS/MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价1 实验部分 1.1仪器ExionLC超高效液相色谱仪（美国AB SCIEX Instruments）；Triple Quad 6500+三重四极杆线性离子阱质谱仪，采用电喷雾离子源，配Analyst 1.7.3软件（美国AB SCIEX Instruments，USA）；DFYX300快速多功能粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；XC400C超声波清洗机（济宁鑫欣超声电子设备有限公司）；AvantiJ高速离心机（美国贝克曼库尔特公司）；ME36S电子分析天平（1/100万，德国赛多利斯公司）；FA2204N电子分析天平（1/1万，赛伦仪器）。1.2药品与试剂标准品：山奈酚（中国药品生物制品检定所）；紫云英苷（成都德斯特生物技术有限公司）；丝氨酸、朝藿定C、苏氨酸、谷氨酸、槲皮苷、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸（中国食品药品检定研究院）；组氨酸、脱水淫羊藿素、丙氨酸、胞苷、淫羊藿素、2-脱氧胞苷、酪氨酸、淫羊藿苷、尿苷、木犀草素、肌苷、槲皮素、鸟苷、金丝桃苷、2-脱氧鸟苷、腺苷、木兰花碱、2-脱氧腺苷、绿原酸、2-脱氧肌苷、异亮氨酸、苯丙氨酸（上海源叶生物科技有限公司）；新绿原酸、木犀草苷、隐绿原酸（南京景竹生物科技有限公司）；朝藿定A、三叶豆苷、朝藿定B、阿福豆苷、2-O-鼠李糖基淫羊藿次苷、淫羊藿新苷、朝藿定A1、箭藿苷A、淫羊藿次苷-、宝藿苷、箭藿苷B、宝藿苷（成都埃法生物科技有限公司）；赖氨酸（宝鸡市辰光生物科技有限公司）；异槲皮苷（江苏永健医药科技有限公司）；芦丁（中国生物制品检定所）；以上标准品纯度 98%。乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；乙醇（分析纯，南京化学试剂有限公司）；实验用水为屈臣氏纯净水。1.3样品不同采收期箭叶淫羊藿样品于2022年3月16日至2022年10月12日实地采集自贵州雷山县丹江镇（北纬N：2622 38.60，东经E：10805 6.56），采收后立即干燥。所有样品经南京中医药大学刘训红教授鉴定为小檗科植物箭叶淫羊藿（Epimedium Sagittatum（Sieb.et Zucc）Maxim）的干燥叶，样品信息见表1。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。1.4对照品溶液制备取50种目标成分对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶解并定容至刻度，配制成对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液适量于10 mL容量瓶，加60%甲醇定容成混合对照品溶液，用60%甲醇稀释后，得到一系列不同质量浓度的混合对照品溶液，用于后续生成标准曲线。所有混合对照品溶液密封保存于4 冰箱，进入液相系统前经0.22 m滤膜过滤。1.5供试品溶液制备不同采收期箭叶淫羊藿样品用粉碎机粉碎，过50目筛。称取样品粉末约0.5 g于锥形瓶中，加入50%乙醇5 mL，密塞，称定质量，超声提取60 min，冷却至室温后，用50%乙醇补足失重，过滤，滤液以12 000 r/min离心10 min，取上清液，以0.22 m微孔滤膜滤过后储存于4 冰箱中，待测。1.6分析条件1.6.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX ExtendC18（2.1 mm 100 mm，1.8 m）；以水（含0.2%甲酸）为流动相 A，乙腈为流动相 B，柱温 40；流速 0.3 mL/min；进样量 2 L。梯度洗脱：0 表1淫羊藿样品的信息表Table 1Sample information of Epimedii FoliumSampleS1S2S3S4S5S6S7S8Date of harvest2022.03.162022.03.312022.04.152022.04.302022.05.152022.05.302022.06.142022.06.29Batch number00202203160020220331002022041500202204300020220515002022053000202206140020220629SampleS9S10S11S12S13S14S15Date of harvest2022.07.142022.07.292022.08.132022.08.282022.09.122022.09.272022.10.12Batch number0020220714002022072900202208130020220828002022091200202209270020221012909第 42 卷分析测试学报1 min，5%B；1 7 min，5%55%B；7 8 min，55%95%B；8 9 min，95%B；9 9.5 min，95%5%B；9.5 10 min，5%B。1.6.2 质谱条件 使用配有电喷雾电离（ESI）源的Triple Quad 6500+三重四极杆线性离子阱串联质谱仪（AB SCIEX Instruments，USA）进行检测。操作参数如下：离子源温度（TEM）350，雾化器气体（GS1）压力3.79 105 kPa（55 psi）；辅助气体（GS2）压力3.79 105 kPa（55 psi）；帷幕气体压力3.10 105 kPa（45 psi）；正极模式下的喷雾电压（IS）为5 500 V、负极模式下为-4 500 V。分析物的检测在多反应监测（MRM）模式下进行。2 结果与讨论 2.1色谱条件的优化为使箭叶淫羊藿中多元活性成分的分离效率更高、峰形更好。本实验优化了色谱柱、流动相、柱温等 UHPLC 色谱条件，比较了 Agilent ZORBAXC18色谱柱（2.1 mm 100 mm，1.8 m）和 Ultimate XBC18色谱柱（4.6 mm 100 mm，3.5 m）对50种目标成分的分离效果，发现前者的分离度和灵敏度相对较高。同时对流动相系统（水甲醇，水乙腈，0.1%、0.2%、0.4%、0.6%甲酸水乙腈），流速（0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min）以及柱温（25、30、35、40）进行考察和优选。最终确定选用Agilent ZORBAX ExtendC18色谱柱（2.1 mm 100 mm，1.8 m）进行分离，流动相为 0.2%甲酸水溶液乙腈，流速0.3 mL/min，柱温40。2.2质谱条件的优化为得到灵敏、准确的定量方法，本实验将质量浓度约100 ng/mL的各标准品单个溶液均通过正、负离子扫描模式。结果显示，全部氨基酸、大部分核苷类化合物、木兰花碱和淫羊藿新苷A在正离子模式下具有良好的灵敏度和强度；酚酸、尿苷和多数黄酮在负离子模式下响应良好。因此本研究同时采用ESI+和ESI两种模式。50种成分的保留时间和质谱参数见表2，正、负离子模式下的总离子流图（TIC）见图1。表250种目标成分的质谱参数Table 2MS/MS parameters of 50 constituents123456789101112131415161718192021222324252627Lysine（赖氨酸）Histidine（组氨酸）Serine（丝氨酸）Alanine（丙氨酸）Threonine（苏氨酸）Glutamic acid（谷氨酸）Proline（脯氨酸）Cytidine（胞苷）2-Deoxycytidine（2-脱氧胞苷）Valine（缬氨酸）Tyrosine（酪氨酸）Uridine（尿苷）Inosine（肌苷）Guanosine（鸟苷）2-Deoxyguanosine（2-脱氧鸟苷）Adenosine（腺苷）2-Deoxyadenosine（2-脱氧腺苷）Leucine（亮氨酸）Isoleucine（异亮氨酸）2-Deoxyinosine（2-脱氧肌苷）Phenylalanine（苯丙氨酸）Neochlorogenic acid（新绿原酸）Chlorogenic acid（绿原酸）Magnoflorine（木兰花碱）Cryptochlorogenic acid（隐绿原酸）Rutin（芦丁）Isoquercitrin（异槲皮苷）C6H14N2O2C6H9N3O2C3H7NO3C3H7NO2C4H9NO3C5H9NO4C5H9NO2C9H13N3O5C9H13N3O4C5H11NO2C9H11NO3C9H12N2O6C10H12N4O5C10H13N5O5C10H13N5O4C10H13N5O4C10H13N5O3C6H13NO2C6H13NO2C10H12N4O4C9H11NO2C16H18O9C16H18O9C20H24NO4C16H18O9C27H30O16C21H20O210.700.700.730.750.750.760.800.820.830.860.930.930.940.950.950.960.960.970.970.992.403.043.493.903.974.514.65147.11156.08106.0590.06120.17148.10116.07244.09228.02118.09182.10243.01269.00284.30268.10268.10251.81132.10132.10253.02166.10353.02353.05343.10353.07609.06463.0083.91110.0359.9944.0274.0083.9070.02112.00112.0572.06136.00199.96137.07152.10152.10136.10136.0886.0586.05136.90120.05190.96191.03298.00191.01300.00300.001001001001001001268617610016-11546426131801006411100-90-120125-105-170-155141681020141010131016-1415161523916101114-24-2224-20-48-36ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI-ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI+ESI-ESI-ESI+ESI-ESI-ESI-No.ConstituentFormulatR/minPrecursor ion（m/z）Product ion（m/z）DP/VCE/eVIon mode910第 8 期薛佳等：基于UHPLCQTRAPMS/MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价2829303132333435363738394041424344454647484950Hyperoside（金丝桃苷）Cynaroside（木犀草苷）Astragalin（紫云英苷）Trifolin（三叶豆苷）Quercitrin（槲皮苷）Epimedoside A（淫羊藿新苷A）Afzelin（阿福豆苷）Epimedin A1（朝藿定A1）Sagittatoside A（箭藿苷A）Epimedin A（朝藿定A）Epimedin B（朝藿定B）Epimedin C（朝藿定C）Quercetin（槲皮素）Icariside-（淫羊藿次苷-）Luteolin（木犀草素）Icariin（淫羊藿苷）Kaempferol（山奈酚）Ikarisoside A（宝藿苷）Sagittatoside B（箭藿苷B）2-O-Rhamnosylicariside-（2-O-鼠李糖基淫羊藿次苷-）Baohuoside-（宝藿苷）Icaritin（淫羊藿素）Anhydroicaritin（脱水淫羊藿素）C21H20O12C21H20O11C21H20O11C21H20O11C21H20O11C32H38O15C21H20O10C39H50O20C33H40O15C39H50O20C38H48O19C39H50O19C15H10O7C27H30O11C15H10O6C33H40O15C15H10O6C26H28O10C32H38O14C33H40O14C27H30O10C21H20O6C21H20O64.654.724.834.924.965.175.295.545.615.625.665.725.835.845.865.986.486.767.257.327.698.928.93463.00447.00447.10447.08447.00663.23431.10837.25675.17837.24807.24821.26301.10529.20285.09677.21285.00499.09645.25659.19513.11367.15367.15300.00284.90283.90284.04301.00355.22285.00367.13366.14675.25645.21659.27151.00367.17132.98369.22116.90353.14366.16366.12366.11309.05352.11-160-193-100-195-165121-130-185-180-175-170-225-62-230-170181-120-185-250-300-300-240-60-36-35-36-34-3035-40-52-46-20-26-14-28-22-4037-36-36-44-42-36-34-28ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI+ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-ESI-（续表2）No.ConstituentFormulatR/minPrecursor ion（m/z）Product ion（m/z）DP/VCE/eVIon mode2.3供试品溶液制备方法的优化2.3.1 单因素实验法 提取溶剂、提取时间和固液比对箭叶淫羊藿中化合物的提取均有重要影响。图150种目标成分在正（A）、负（B）离子模式下的总离子流图Fig.1Total ion chromatograms（TIC）of 50 constituents under positive（A）and negative（B）modesthe peak numbers denoted are the same as those in Table 2911第 42 卷分析测试学报淫羊藿苷是淫羊藿药材的质量标志物，为获得淫羊藿苷的较高提取率，本实验对体积分数、液固比及提取时间分别进行单因素考察，以确定各因素的适宜水平。图 2显示了不同乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）乙醇、液固比（6 1、8 1、10 1、12 1、14 1、20 1、30 1、40 1、50 1）及提取时间（30、40、50、60、70 min）对淫羊藿苷提取率的影响。从图中可以看出，当乙醇体积分数为50%、液固比为10 1、提取时间为60 min时各淫羊藿苷的提取率最高。2.3.2 响应面实验法 以上述单因素实验结果为基础，本文应用BoxBehnken中心组合方法进行3因素3水平实验设计，以淫羊藿苷提取率为响应值，对淫羊藿的提取工艺进行优化。通过响应面法实验设计因素和水平（见表3），得到不同体积分数乙醇、不同液固比及不同提取时间下淫羊藿苷的提取率（见表4），获得淫羊藿苷的最佳提取条件。表5为方差分析及显著性检验结果，F及P值表明回归模型具有高度显著性，可作为筛选最佳提取条件的方法。进一步利用DesignExpert 8.0.6软件，将乙醇体积分数、提取时间、液固比对淫羊藿苷提取效率的影响进行可视化作图（结果见图3），同时求解回归方程。得出乙醇体积分数49.41%，液固比10 1，提取时间60.1 min为最优提取条件。对上述条件进行简化调整，确定乙醇体积分数为50%，液固比为10 1，提取时间为60 min，并进行3次平行实验，得平均提取率为3 841.22 g/g，略高于理论值，证明该优化条件可行性较高，可用作本实验的提取条件。图2单因素实验结果Fig.2Results of single factor experimentA：ethanol volume fraction；B：liquidsolid ratio；C：extraction time表3响应面实验设计因素和水平Table 3Experimental design factors and levels of response surface experimentLevel-101FactorA（Ethanol volume fraction，%）405060B（Liquidsolid ratio，mL/g）1 81 101 12C（Time，min）506070表4实验设计与结果Table 4Experimental design and results of BoxBenhnkenSample1234567891011121314151617A（%）4040404050505050505050505060606060B（mL/g）10 18 112 110 18 112 110 110 110 110 110 18 112 110 18 112 110 1C（min）5060607050506060606060707050606070Y（g/g）1 3287502 3582 0879298442 7523 2643 1973 3213 3361 8002 1272 0001 1659052 474912第 8 期薛佳等：基于UHPLCQTRAPMS/MS的淫羊藿中多元活性成分动态累积的分析与评价2.4方法学考察2.4.1 线性范围、检出限与定量下限 精密量取不同浓度混合对照品溶液各2 L，按“1.6”条件进样，记录峰面积并进行线性回归。分别以信噪比（S/N）为 3和 10时各对照品的质量浓度作为检出限（LOD）和定量下限（LOQ），结果见表6。在一定质量浓度范围内，50种目标成分呈现良好的线性关系，其相关系数（r2）均不小于0.999 0。表650种目标成分的回归方程、相关系数（r2）、线性范围、检出限及定量下限Table 6Linear equations，correlation coefficients（r2），linear ranges，limits of detection（LOD），and limits of quantitation（LOQ）of 50 constituents1234567LysineHistidineSerineAlanineThreonineGlutamic acidProlineY=970X+4 750Y=18 200X+56 400Y=351X+12 300Y=549X+69 600Y=1 520X+133 000Y=2 970X-10 500Y=3 000X-9150.999 20.999 90.999 20.999 90.999 40.999 10.999 70.776 10210.1 23135.1 4486.77 2561.25 28012.5 39513.7 2120.110.070.150.170.170.100.120.360.230.490.560.580.350.39No.ConstituentRegression equationr2Linear range/（ng mL-1）LOD/（ng mL-1）LOQ/（ng mL-1）表5响应面实验方差分析及显著性检验Table 5Variance analysis and significance test of response surface experiment（*：P 0.05；*：P 0.01）Source of FangchaModelAABBCCABACBCA2B2C2ResidualMissing fitting termNet errorTotal deviationSum of squares1.287 10753.683.160 1051.434 1068.724 10520 26742 4361.868 1066.199 1061.208 1061.043 1068.085 1052.346 1051.391 107Degree of freedom911111111173416F9.603.60 1042.129.625.850.1400.28012.541.68.114.60P0.003 5*0.985 40.188 70.017 3*0.046 1*0.723 20.610 10.009 5*0.000 4*0.024 8*0.087 4图3乙醇体积分数、提取时间、液固比对淫羊藿苷峰面积的影响图Fig.3Impact charts of ethanol volume fraction，liquidsolid ratio and extraction time on extraction yield of icariinA，B：two-dimensional and three-dimensional impact charts of ethanol volume fraction and liquidsolid ratio on extraction yields of icariin；C，D：two-dimensional and three-dimensional impact charts of ethanol volume fraction and extraction time on extraction yields of icariin；E，F：two-dimensional and three-dimensional impact charts of liquidsolid ratio and extraction time ratio on extraction yields of icariin；the contour numbers in A，C and E represent the extraction rate of icariin（g/g）913第 42 卷分析测试学报891011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950Cytidine2-DeoxycytidineValineTyrosineUridineInosineGuanosine2-DeoxyguanosineAdenosine2-DeoxyadenosineLeucineIsoleucine2-DeoxyinosinePhenylalanineNeochlorogenic acidChlorogenic acidMagnoflorineCryptochlorogenic acidRutinIsoquercitrinHyperosideCynarosideAstragalinTrifolinQuercitrinEpimedoside AAfzelinEpimedin A1Sagittatoside AEpime