纳米铜碳复合物对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响.pdf

动物营养学报，（）：纳米铜碳复合物对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响狄 斌 杨国峰 廖维连 贺佳仪 钟辛悦 郭娉婷 高玉云 金 灵（福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福州；福建省三明市将乐县农业农村局，三明；福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福州）摘 要：本试验旨在探究不同水平纳米铜碳复合物（）对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响。试验选取 日龄断奶伊拉兔 只，随机分为 组（每组 个重复，每个重复 只），分别为对照组（基础饲粮）、低剂量组（基础饲粮 ）、中剂量组（基础饲粮 ）、高剂量组（基础饲粮 ）和抗生素组（基础饲粮 盐霉素）。试验从仔兔 日龄开始，持续 。结果表明：）与对照组相比，饲粮中添加 可显著提高断奶伊拉兔的平均日增重（），饲粮中添加 和 可显著降低断奶伊拉兔的腹泻率（），但添加不同水平的 对断奶伊拉兔全净膛率、半净膛率均无显著影响（）。）与对照组相比，饲粮中添加、显著降低断奶伊拉兔蚓突指数（），添加不同水平的 显著降低了断奶伊拉兔胸腺指数（），而添加不同水平的 对断奶伊拉兔的脾脏指数和圆小囊指数无显著影响（）。）与对照组相比，添加不同水平 均可显著提高断奶伊拉兔空肠绒毛高度（），且添加 可显著提高断奶伊拉兔空肠绒毛高度 隐窝深度比值（）。在基因表达方面，饲粮中添加 可显著促进断奶伊拉兔空肠黏膜中闭合小环蛋白（）的基因相对表达量（），而饲粮中添加 可显著促进断奶伊拉兔空肠黏膜中闭锁蛋白（）的基因相对表达量（）。由此可见，在饲粮中添加 可通过提高断奶伊拉兔平均日增重、降低腹泻率、提高空肠绒毛高度和紧密连接蛋白的基因表达水平来修复断奶伊拉兔的空肠机械屏障损伤。关键词：纳米铜碳复合物；断奶伊拉兔；生长性能；肠道机械屏障中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；中央引导地方科技发展资金定向项目（）；福建省家禽产业体系岗位专家（，）；福建农林大学学科交叉融合专项（）作者简介：狄 斌（），男，江苏常州人，硕士研究生，从事动物营养与饲料、动物营养与免疫方向的研究。：通信作者：高玉云，副教授，硕士生导师，：；金 灵，助理研究员，：现代集约化养殖生产过程中，仔兔断奶时饲粮结构发生改变，失去母乳的保护作用，而此时其消化系统尚未发育完全，无法消化和吸收固体颗粒料中的营养物质，进而引发仔兔断奶应激。特别是断奶后 周，仔兔消化道还处于生长发育阶段，容易引发胃肠炎或腹泻，导致仔兔采食量降低、饲料转化率降低、生长速率缓慢、生产性能下降，严重甚至死亡。所以需要开发一种安全无害的新型饲料添加剂来减轻仔兔断奶应激，降低仔兔腹泻率。纳米铜碳复合物（，）是一种以植物纤维为模板，金属铜离子为原料，通过加温碳化还原方法制动 物 营 养 学 报 卷备而成的铜 碳核 壳结构的纳米颗粒。王慧等研究表明，具有抗双极霉属、木霉属真菌、白腐真菌、蓝变真菌、大肠杆菌、金色葡萄球菌及白色念珠菌等作用，具有广谱性抗菌能力。研究发现，可以通过供体氧原子来减少稳定的氧自由基，二苯基苦基苯肼（），并产生了还原型，证明了 具有清除自由基和抗氧化的能力。目前国内外对于利用铜碳复合材料作为饲料添加剂替代抗生素的研究较少。因此，本试验以断奶伊拉 兔 作 为 试 验 动 物，探 究对断奶伊拉兔生长性能、免疫功能、肝脏抗氧化和肠道机械屏障的影响，以期为其作为抗生素的替代品及饲料添加剂的研发应用提供理论依据和技术支持。材料与方法 试验材料 试验所用的 日龄伊拉兔购自福建省春龙农牧科技公司；购自厦门某有限公司，其纳米颗粒中核的直径为 ，碳壳的直径约为，碳化后的材料被粉碎成千分尺到亚千分尺大小的颗粒，颗粒一般呈球形，大部分颗粒的平均直径为 ，同时测得铜质量比为，石墨烯质量比为；饲料原料购自福建省某饲料有限公司。试验设计 本试验采用单因子试验设计，选取体重、日龄、遗传背景相近的健康断奶伊拉公兔 只，随机分为 组，分别为对照组（基础饲粮）、低剂量组（基础饲粮 ）、中剂量组（基础饲粮 ）、高剂量组（基础饲粮 ）和 抗 生 素 组（基 础 饲 粮 盐霉素），每组 个重复，每个重复 只。试验从 日龄开始，并在饲养 后屠宰取样。本次动物试验的所有操作严格按照福建农林大学实验动物福利和动物实验伦理管理规定执行。试验饲粮基 础 饲 粮 参 照 肉 兔 营 养 需 要 量 进行配制。各组饲粮营养水平保持一致，试验所用基础饲粮组成及营养水平如表 所示。饲养管理 本试验在春龙农牧科技公司试验场开展，试验前对兔舍内的兔笼、饮水器、料槽等物品进行彻底清洗，并于试验开始前 周对兔舍及所有物品进行甲醛熏蒸消毒。试验兔饲养于封闭式兔舍，采用 层笼养，严格控制舍内温度、光照和通风。仔兔的免疫程序严格按照常规方法操作，自由采食与饮水，每天观察兔群的生长状态，及时处理死兔。表 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）（）项目 含量 原料 苜蓿草粉 玉米 麸皮 小麦干酒糟及其可溶物 稻壳粉 豆粕 米糠粕 次粉 石粉 蛋氨酸 赖氨酸 氯化钠 预混料）合计 营养水平 ）消化能 （）粗蛋白质 粗纤维 中性洗涤纤维 酸性洗涤纤维 酸性洗涤木质素 钙 总磷 赖氨酸 蛋氨酸半胱氨酸 ）预混料为每千克饲粮提供 ：，烟酸 ，泛酸 ，叶酸 ，生物素 ，（），（），（），（），（），（），（），胆碱 。）营养水平均为计算值。期狄 斌等：纳米铜碳复合物对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响 样品采集及指标测定 生长性能测定 试验为期 ，每组每个重复选取 只断奶伊拉兔用于屠宰取样，共 只。以重复为单位记录每天采食量，试验结束前 天：断料不断水，统计每个重复饲粮消耗总量，次日：分别称取每个重复断奶伊拉兔总重，分别计算各组平均日采食量（）、平均日增重（）和料重比（），并记录腹泻个体数，最后按不同阶段计算腹泻率。平均阶段采食量 饲喂天数；（末重初重）饲喂天数；每个重复的平均阶段采食量平均阶段增重；腹泻率（）腹泻只数腹泻日数（试验只数试验期）。屠宰性能测定 从每个重复中随机选取 只断奶伊拉兔，称重和心脏采血完后宰杀，对半净膛和全净膛进行称重，并计算半净膛率和全净膛率。半净膛重：去除头、四肢、尾、气管、食管、移走肠道及内容物和泌尿生殖器官后仅保留心脏、肝脏、肾脏及周围脂肪后的重量。全净膛重：在半净膛的基础上去除心脏、肝脏、肾脏及周围脂肪后的重量。半净膛率（）半净膛重 宰前重；全净膛率（）全净膛重 宰前重。免疫器官指数测定 取脾脏、圆小囊、蚓突、胸腺免疫器官并用滤纸吸去器官上黏附的血液，用镊子剥离器官上多余的筋膜和脂肪组织，电子天平精确称重（精确至小数点后 位小数），记录免疫器官重并计算相应的免疫器官指数。空肠形态结构测定 屠宰后取空肠中段 ，用生理盐水洗去内容物，置于 多聚甲醛溶液中固定 ，用于苏木精伊红（）染色观察；另取 段 左右空肠中段组织，生理盐水轻轻冲洗其中内容物，后将组织装入 冻存管，置于液氮罐中冻存，后转移至 冰箱中保存，用于紧密连接蛋白基因相对表达量测定。使用 拍照显微镜选取小肠组织目的区域进行 倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景一致，成像完成后使用 分析软件，统一以微米为标准单位，分别测量每张切片中 根完整肠绒毛高度和对应隐窝深度，并计算绒毛高度和隐窝深度的比值（绒毛高度 隐窝深度）。空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达测定 空肠黏膜组织总 利用 试剂盒（普洛麦格北京生物技术有限公司）进行提取，然后根据 反转录试剂盒（普洛麦格北京生物技术有限公司）进行反转录，然后根据 荧光定量试剂盒（普洛麦格北京生物技术有限公司）进行实时荧光定量（）检测空肠黏膜闭锁蛋白（）、闭合蛋白（）、闭合蛋白（）、闭合小环蛋白（）的基因相对表达量。体系反应条件为 预变性 ，变性 ，退火 ，延伸 ，重复变性至延伸步骤 个循环。试验所需全部基因引物均由福州尚亚生物技术有限公司设计合成，引物序列见表。以磷酸甘油醛脱氢酶（）为内参，采用 分析方法，计算基因相对表达量。表 引物序列 基因引物序列 （）登录号 磷酸甘油醛脱氢酶：闭锁蛋白：闭合蛋白 ：动 物 营 养 学 报 卷续表 基因引物序列 （）登录号 闭合小环蛋白：闭合蛋白 ：数据分析 使用 对试验数据进行整理和统计，经 统计分析，使用 进行方差分析，并用 氏法进行多重比较；腹泻率和死亡率使用卡方检验进行分析。除腹泻率和死亡率，其他试验结果皆用平均值标准差（）表示，以 为差异显著，为差异不显著。结 果 对断奶伊拉兔生长性能的影响 由表 可知，饲粮中添加不同水平 对断奶伊拉兔的、死亡率均无显著影响（），但仍能观察到随着 添加水平的提高，有上升的趋势，而死亡率有下降的趋势。与对照组相比，低、中、高剂量组断奶伊拉兔的 显著提高（）。高剂量组和抗生素组腹泻率较对照组显著降低（）。表 对断奶伊拉兔生长性能的影响 项目对照组低剂量组 中剂量组 高剂量组 抗生素组 值平均日采食（）平均日增重（）初重 末重 料重比 死亡率 腹泻率 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（），不同小写字母表示差异显著（）。下表同。，（），（）对断奶伊拉兔屠宰性能的影响 由表 可知，饲粮中添加不同水平的 对全净膛率、半净膛率均无显著影响（）。对断奶伊拉兔免疫器官指数的影响由 表 可 知，与 对 照 组 相 比，饲 粮 中 添 加对断奶伊拉兔脾脏和圆小囊指数无显著影响（）。低、中剂量组蚓突指数较对照组显著降低（）。添加不同水平 组胸腺指数较对照组显著降低（）。期狄 斌等：纳米铜碳复合物对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响表 对断奶伊拉兔屠宰性能的影响 项目对照组低剂量组 中剂量组 高剂量组 抗生素组 值全净膛率 半净膛率 表 对断奶伊拉兔免疫器官指数的影响 项目对照组低剂量组 中剂量组 高剂量组 抗生素组 值脾脏指数 圆小囊指数 蚓突指数 胸腺指数 对断奶伊拉兔空肠形态的影响 由表 可知，与对照组相比，饲粮中添加不同水平 和抗生素处理可显著提高断奶伊拉兔空肠绒毛高度（）；高剂量组断奶伊拉兔空肠绒毛高度 隐窝深度显著提高（），但饲粮中添加不同水平 对断奶伊拉兔空肠隐窝深度无显著影响（）。由图 可以看出，对照组空肠肠绒毛顶端微绒毛出现了部分脱落、断裂，肠绒毛排列相对最短，肠腺相对较少，隐窝深度最浅，肠道环形肌层最薄；低剂量组和抗生素组顶端也出现了部分脱落、断裂，但明显较对照组少，肠绒毛明显比对照组长，隐窝深度相对对照组较深，肠道环形肌相对对照组较厚；中、高剂量组肠绒毛整体结构完整，肠微绒毛未见明显脱落，肠绒毛排列相对整齐、紧密，肠绒毛最长，隐窝深度相对最深，肠道环形肌层相对最厚。对断奶伊拉兔空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达水平的影响 由表 可知，与对照组相比，饲粮中添加高剂量 可以显著提高断奶伊拉兔空肠黏膜中 基因相对表达量（）；低剂量组和抗生素组断奶伊拉兔空肠黏膜中 基因相对表达量显著提高（）；添加不同水平 对断奶伊拉兔空肠黏膜中 基因相对表达量无显著影响（）；添加中剂量 显著抑制了断奶伊拉兔空肠黏膜中的 基因相对表达量（）。动 物 营 养 学 报 卷表 对断奶伊拉兔空肠形态的影响 项目对照组低剂量组 中剂量组 高剂量组 抗生素组 值绒毛高度 隐窝深度 绒毛高度 隐窝深度 图 断奶伊拉兔空肠黏膜组织学观察（染色）（，）表 对断奶伊拉兔空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达水平的影响 项目对照组低剂量组 中剂量组 高剂量组 抗生素组 值闭合小环蛋白闭锁蛋白 闭合蛋白 闭合蛋白 讨 论 对断奶伊拉兔生长性能的影响 目前，关于 对动物生长性能的研究较少，而铜对动物机体生长性能的研究结果也不尽相同。常新耀等研究发现，在饲粮中添加、的硫酸铜对肉仔鸡的、无显著影响。而对于断奶应 期狄 斌等：纳米铜碳复合物对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响激动物而言，晏家友等研究发现，饲粮中添加柠檬酸铜、硫酸铜或碱式氯化铜对断奶仔猪、均无显著影响。杨清研究表明，饲粮中添加高水平铜（、）可以显著降低断奶小鼠的 。这可能是由于铜元素具有一定抑菌作用，维护了肠道微生物环境稳态，促进了肠道营养吸收，从而降低了 。另外，有研究表明，石墨烯纳米材料可影响干细胞的生物学行为，表现为促进干细胞生长、分化、增殖和黏附，并且认为这些纳米材料可能是通过调节 钙黏蛋白 信号通路而影响干细胞的生物学行为。本研究发现，添加高剂量 与对照组相比，显著提高了断奶仔兔的，降低了腹泻率。与上述试验的结果部分一致，这和一定量的铜可以刺激动物下丘脑神经肽，提高采食量有关，且随着日龄的增长，残留在动物体内的铜的浓度也会增加。本试验结果显示，饲粮中添加 可以促进断奶伊拉兔的生长发育，而减少腹泻率，提高其生产效益。对断奶伊拉兔屠宰性能的影响 关于饲粮中添加铜对断奶动物屠宰性能影响的研究结果也不尽相同。郭志强等研究表明，与对照组相比，饲粮中添加 柠檬酸铜显著提高了断奶肉兔的全净膛重和半净膛重。祁新梅研究发现，在饲粮中添加 硫酸铜显著提高了 日龄 扬 州 仔 鹅 的 屠 宰 性 能，其 中 硫酸铜组的屠宰率、腿肌率、腹脂率相对于空白组均有显著提高。张利环等研究表明，饲粮中添加 纳米铜显著提高了 日龄樱桃谷鸭的屠宰率和全净膛率。并且研究发现铜对于屠宰性能的影响主要是通过诱导生长激素（）和胰岛素样生长因子（）的合成和分泌，进而抑制蛋白质降解、刺激脂肪分解。虽然以上研究都表明不同形式的铜对动物的屠宰性能有提高的作用，但也有研究表明，添加不同水平的硫酸铜对育肥猪的屠宰率没有显著影响。而本试验研究结果也表明虽然添加 使得断奶伊拉兔末重显著高于对照组，但是对于全净膛率和半净膛率无显著影响。对断奶伊拉兔免疫器官指数的影响 免疫器官是动物机体免疫系统发育情况和评价机体抗病能力的重要基础，免疫器官能产生淋巴细胞，并通过其分泌产物参与动物机体内体液免疫和细胞免疫，因此，其发育程度可体现动物抵抗断奶应激的能力。何海建等研究表明，在饲粮中添加 和 氨基酸螯合铜显著提高了育成鸡的免疫器官指数。张亚丽研究表明，在饲粮中添加 壳聚糖铜可显著提高断奶仔猪的淋巴结指数。朱连勤等研究表明，在 饲 粮 中 以 纳 米 氧 化 铜 形 式 添 加 和 铜可以显著提高肉鸡免疫器官指数。但也有研究认为，饲粮中添加纳米铜使得肉仔鸡的免疫器官重量及其指数均无显著影响。更有研究显示，添加纳米铜使得小白鼠的胸腺指数、脾脏指数及肾脏指数下降。蚓突、圆小囊是肉兔特有的免疫器官，能够反映兔机体的免疫能力和抗应激能力，而铜的添加量过少和过多都会对免疫器官造成损伤，导致免疫器官指数下降。这可能是本试验饲粮中添加 不仅对于脾脏指数和圆小囊指数无显著影响，而且降低了蚓突指数和胸腺指数的原因。对断奶伊拉兔空肠形态的影响 小肠绒毛是肠道机械屏障的重要组成部分，这些绒毛主要富集于小肠黏膜的褶皱中，小肠中的隐窝细胞则可以发育形成新的小肠绒毛。绒毛高度可表征小肠的消化吸收能力，隐窝的深度则可反映肠道组织的增殖能力，绒毛高度 隐窝深度越高，其肠道的吸收能力越强。仔兔断奶后，因饲粮突然从母乳转变为固体饲粮而产生的断奶应激，会导致小肠绒毛萎缩、绒毛高度降低、隐窝加深，促使肠道机械屏障受损，小肠吸收能力减弱，造成仔兔生长性能降低，进而导致腹泻或者死亡。研究结果显示，饲粮中添加不同水平铜对动物肠道发育的影响并不相同。梅绍锋等研究表明，饲粮中添加、铜可以显著提高断奶仔猪空肠绒毛高度、绒毛高度 隐窝深度，显著降低空肠隐窝深度。刘德琴等研究表明，饲粮中添加 铜显著降低了肉鸡空肠绒毛高度 隐窝深度，修复了肠道屏障损伤。等研究发现，在饲粮中添加 铜可显著提高育肥猪空肠绒毛高度、绒毛高度 隐窝深度，降低隐窝深度，改善了育肥猪空肠形态和绒毛完整性。具有广谱抗菌能力，在进入胃肠道后，可以杀灭病原菌，吸附内毒素，从而保证肠绒毛和隐窝的正常生长。这与本试验在饲粮中添加中、高剂动 物 营 养 学 报 卷量 显著提高了断奶伊拉兔空肠绒毛高度和绒毛高度 隐窝深度的结果相证。这说明 的添加对于肉兔肠道发育具有一定促进作用。对断奶伊拉兔空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达水平的影响 在肠道机械屏障的结构中，肠上皮细胞之间的空隙由紧密连接填补封闭，紧密连接是阻止内毒素和致病菌侵入的重要防线。肠道紧密连接是动态变化的，在断奶仔兔受到应激时可增强细胞适应力，阻止有害菌侵入内循环。研究人员在 年第 次发现了紧密连接，并研究发现紧密连接是由蛋白复合物构成，主要包括、和连接黏附分子（）以及。上述 种蛋白构成了肠道上皮的第 道屏障，可控制肠上皮细胞之间空隙的通透性，筛除有害菌和致病菌。等研究表明，在饲粮中添加 氧化铜（）可以显著提高育肥猪空肠黏膜 的表达。等研究发现，感 染 伤 寒 沙 门 氏 菌 的 肉 鸡 饲 粮 中 添 加 醋酸铜，可以有效杀灭细菌，修复肠道黏膜损伤，提高、的表达。内源性和外源性因素会影响肠道紧密连接蛋白分泌量的高低，而在饲粮中添加铜可以减少外源性因素对于紧密连接蛋白的抑制。本试验结果表明，在饲粮中添加低、中剂量 可以显著提高断奶伊拉兔空肠、的基因相对表达量，与上述研究结果一致。但饲粮中添加中剂量 反而降低了断奶伊拉兔 的基因相对表达量，这与上述研究结果相矛盾，有待进一步研究。结 论 在本试验条件下，饲粮中添加纳米 可改善断奶伊拉兔空肠黏膜形态，提高断奶伊拉兔，降低腹泻率。综合本试验结果，添加 和 对于断奶伊拉兔以上指标都有改善；而添加 对于断奶伊拉兔 的提高和腹泻率的降低效果最为显著。参考文献：连崑，李维凤，王小鹏，等具有铜 碳核 壳结构的铜纳米材料在抗菌方面的应用：，：（）王慧，连崑，郑慧萍，等碳和铜的复合纳米粒子的应用：，：（），：，：，（）：中华人民共和国农业农村部肉兔营养需要量：北京：中国农业出版社，：，（）常新耀，王翠日粮中添加铜对肉仔鸡生产性能的影响饲料工业，（）：，（）：（）晏家友，刁慧，李书伟，等日粮中添加低铜对断奶仔猪生长性能、抗氧化功能及组织器官铜沉积量的影响中国饲料，（）：，（）：（）杨清日粮铜水平对猪和小鼠肠道形态和发育的影响研究硕士学位论文长沙：湖南师范大学，：，（）晏家友，杜亚楠，李书伟，等饲料级柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌作用中国畜牧杂志，（）：，（）：（）期狄 斌等：纳米铜碳复合物对断奶伊拉兔生长性能和空肠机械屏障的影响 王龙，廖业，孙虹霞，等胁迫对黑水虻幼虫抗菌肽组分及抑菌活性的影响 环境昆虫学报，（）：，（）：（）沈佳华，付勇基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用 中国组织工程研究，（）：，（）：（），（）：郭志强，胡海强，谢晓红，等柠檬酸铜对肉兔生产性能和肉品质的影响 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