牛源鲍曼不动杆菌的分离鉴定及病原性分析.pdf

1F百间川学吊诞（19/4一）另（社肤）：业四降女八高级普庆川1502023 年 Vol.39(4)广西畜牧兽医调研查究牛源鲍曼不动杆菌的分离鉴定及病原性分析究李常挺，陶立，冯威巍？，梁靖，吴翠兰，彭昊1*,兰美益,李军1*，马春霞（1.广西壮族自治区兽医研究所斤广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁530 0 0 1；西都安大都华牛农业科技有限公司，广西都安530 7 0 0；3.钦州澳华进出口贸易有限公司，广西钦州5350 0 0）中图分类号：S858.235.1*2文献标识码：B文章编号：10 0 2-52 35(2 0 2 3)0 4-0 150-0 4doi:10.3969/j.issn.1002-5235.2023.04.002鲍曼不动杆菌，又称鲍氏不动杆菌，属于不动杆菌属，革兰氏阴性菌，广泛地存在于土壤和水等自然环境中，也存在于健康人的皮肤、咽、结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中,是一种条件致病菌,可引起菌血症和肺炎、脑膜炎、腹膜炎、心内膜炎、泌尿道以及皮肤感染 1.2 。黄志坚、顾天召等 3.4 人于19 9 6 年和19 9 7 年对鱼暴发性死亡的病原进行了调查并分离出鲍曼不动杆菌，除水产动物外，国内也有报道大熊猫、仔猪、鸡、鸭和山羊等动物感染鲍曼不动杆菌发病死亡的案例 5-9 。为确定南宁市某牛场病死牛的病因和查找病原,从病死牛的肺细支气管中分离到1株疑似鲍曼不动杆菌。该菌与牛源、人源鲍曼不动杆菌亲缘关系较近。经细菌分离、生化试验、致病性试验、药敏试验、16SrRNA基因鉴定和病理组织切片观察,证实该病牛感染鲍曼不动杆菌并确定有致病性。分离菌液浓度在410 CFU/mL时对小鼠的致死率为100%；分离菌仅对测定的恩诺沙星等4种药物高敏,对其他11药物耐药。本病例可为临床防治鲍曼不动杆菌提供参考。1材料1.1主要仪器设备和试剂Bio-RADT100 PCR 仪、Universal Hood I 凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司,SiGMA1-14离心机购自德国SiCMA公司，恒温培养箱购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司，生物显微镜购自日本尼康公司；血平板购自郑州安图生物工程股份有限收稿日期：2 0 2 2-0 6-0 6基金项目：广西重点研发计划（AB21238003），桂科专项（18-3，19-3）；南宁市重点研发计划（2 0 2 12 0 2 3）；良庆区重点研发计划(202109)。硕士,研究方向为动物疫病防控与兽医微生物学，E-mail：。*通讯作者。E-mail:；E-m a i l:j l e e 9 9 8 。公司，营养肉汤购自北京陆桥技术责任有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，细菌微量生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司，药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。1.2病料来源来自广西南宁市某牛场病死牛的病变脏器；健康小鼠购自广西医科大学实验动物中心。2方法2.1细菌分离无菌从肺细支气管、肝脏、脾脏等组织划线接种血平板,培养2 4h后挑取优势菌落进行纯化培养，染色镜检，挑取纯化的单个菌落接种肉汤,37 扩大培养。2.2细菌16 SrRNA基因鉴定及进化分析取分离菌液离心，提取其DNA进行16 rRNA基因扩增，将PCR阳性产物克隆送至生物公司测序，测序结果用BLAST比对核苷酸序列，以MEGA软件构建系统发育进化树。2.3生化试验取纯化分离菌液，接种于细菌微量生化反应管中，37 培养2 4h48h，观察结果。2.4致病性试验将小鼠随机分为实验组和对照组，5只/组，实验组腹腔注射分离菌液，菌液浓度为410 CFU/mL,0.5mL/只；对照组注射等量的灭菌生理盐水。实验过程中,若有小鼠死亡,剖检死亡小鼠并回收分离菌。2.5药敏试验采用K-B药敏纸片法测定分离菌对药物的敏感程度，将纯化分离菌液均匀涂布于血平板，盖上药敏纸片，37 培养2 4h后测量抑菌圈的直径大小。1512023年Vol.39(4)广西畜牧兽医2.6试验小鼠的病理组织切片观察解剖死亡小鼠、采集肺脏等新鲜组织，用10%福尔马林固定，按脱水、透明、石蜡包埋、HE染色等程序制作病理组织切片，光镜下观察组织病变情况。3结果和分析3.1细菌分离结果肺细支气管分离菌经纯化后在血平板上生长良好，形成中等大小，边缘整齐的菌落，圆形，灰白色，光滑湿润；其他脏器未分离到细菌。分离菌为革兰氏染色阴性,球杆状，单个散在或成对排列。3.2PCR鉴定结果及遗传进化分析分离菌经16 SrRNA通用引物基因扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示在约140 0 bp处有一特异性条带（图1），经克隆片段进行测序，鉴定为鲍曼不动杆菌，将其命名为gxqingxiu01株；分离菌经BLAST比对核苷酸序列，使用MEGA软件绘制系统发育进化树分析结果表明，该菌与人源鲍曼不动杆菌（NCBI序列号：JN668402）、牛源鲍曼不动杆菌（NCBI序列号：JQ404488）亲缘关系较近，与昆虫源鲍曼不动杆菌（NCBI序列号：KX966428）遗传距离较远（图1）。M1500bpgxqingxiu01.seqJN668402.1.seqKX242271.1.seqJF313146.1.SeqJN668838.1.seqJQ404488.1.seqEU883589.seqNR117620.1.SeqKT964444.1.seqEU733247.seqKX966428.1.seq7.8.6420NucleotideSubstitutions(x100)图1分离菌16 SrRNA系统发育进化树3.3生化试验结果生化试验显示，乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、密二糖试验呈阳性，果糖、MR-VP试验MR、M R-VP试验VR、西蒙氏枸橡酸盐、枸橡酸盐、乙酰甲基甲醇、吲哚试验阴性，符合鲍曼不动杆菌生化特性（表1）。表1生化试验结果项目结果乳糖+葡萄糖+木糖+阿拉伯糖+果糖一麦芽糖+密二糖+MR-VP试验MR一MR-VP试验VR一枸橡酸盐一乙酰甲基甲醇一吲哚注：+：阳性；一：阴性3.4致病性试验结果对照组小鼠观察7 d未见异常；实验组小鼠48h全部死亡，死亡率10 0%。剖检死亡小鼠发现肺脏出血,肝脏、脾脏肿大等病变（图2）；从死亡小鼠分离细菌进行染色镜检、生化试验和测序鉴定，结果显示与接种菌相同图2实验组小鼠解剖病变3.5药敏试验结果分离菌仅对测定的恩诺沙星等4种药物高度敏感，对头孢噻钠等5种药物中度敏感，对青霉素、氨苄西林钠等11种药物耐药（表2）。3.6病理组织切片观察结果试验死亡小鼠的肺组织出现肺泡隔局部淋巴细胞增生，并伴随有多发性淋巴滤泡，滤泡多呈圆形或类圆形，主要由淋巴细胞组成，且生发中心较为明显；此外，还出现有支气管扩张，并有白细胞和单核细胞渗出等炎症反应。1522023年Vol.39(4)西畜牧兽医表2分离菌体外药敏试验结果抑菌圈结果药物抑菌圈结果药物名称直径/mm判断名称直径/mm判断青霉素0R强力霉素20S氨苄西林钠0R阿奇霉素8R头孢拉定钠0R复方新诺明0R头孢曲松钠8R诺氟沙星141头孢噻钠131环丙沙星20S链霉素10恩诺沙星24S卡那霉素111氧氟沙星22S大观霉素8R多粘菌素9R四环素141利福平0R罗红霉素9R替米考星8R注：抑菌圈直径(）10 mm为耐药（R）,10 mm15mm为中介(I),15 mm为敏感(S)。4分析和讨论鲍曼不动杆菌作为一种条件致病菌，可在环境中长期存活，通过直接接触受污染的水、食物等传播，鲍曼不动杆菌感染牛引起发病和死亡，国内仅有重庆、山西、四川等有相关报道10-12 。本次试验从广西本地死亡病牛脏器中分离到的鲍曼不动杆菌，核苷酸同源性比较和系统发育进化分析结果显示，分离菌和人源鲍曼不动杆菌菌株亲缘关系较近,属于同一进化分支；小鼠的致病性试验表明该菌致病性较强，提示着该菌或有可能成为人畜共患传染病的未来潜在威胁。当前细菌耐药性和超级细菌已经成为人类共同面临的严峻的公共卫生危机，鲍曼不动杆菌作为超级细菌之一 13.14，是目前我国医院获得性感染的主要致病菌之 15.16 ;2 0 16 年CARSS全国细菌耐药性监测报告显示，鲍曼不动杆菌的检出率高达10.8%17。本次分离到的牛源鲍曼不动杆菌，仅对测定的喹诺酮类、四环素类药物高敏,对氨基糖苷类药物中度敏感，对大部分药物耐药。该菌的耐药性应引起动物养殖业的警惕和重视，在生产中要正确使用和合理选择抗生素类药物，避免耐药性的产生和发展。鲍曼不动杆菌可引起肺炎、脑膜炎、菌血症及皮肤、软组织、尿路感染等多种感染及并发症 18.19 ,经伤口感染进行进人血液循环并产生毒素，导致微循环障碍和感染性休克。鲍曼不动杆菌的致病性与该菌对宿主细胞的黏附、侵袭和释放的毒力因子相关，鲍曼不动杆菌突破宿主免疫屏障后可激活免疫系统诱导产生炎性因子和炎症反应 2 0 。通过制作致病性试验小鼠的肺部病理切片，观察到典型的炎性细胞浸润和肺泡隔局部淋巴细胞增生，表明机体固有免疫系统在该菌的肺部感染发挥着重要防御作用。鲍曼不动杆菌感染具有非常重要的临床意义，但该菌与宿主机体免疫的相互作用机理和致病机制目前仍研究较少 2 1，急待深人、持续、全面地了解和研究。参考文献1陆承平.兽医微生物学M.第5版.中国农业出版社，2013:162-163.2JAYATHILAKA E,RAJAPAKSHA D C,NIKAPITIYA C,et al.Antimicrobial and Anti-Biofilm Peptide Octomininfor Controlling Multidrug-Resistant Acinetobacter bau-mannii.Int J Mol Sci.2021;22(10):5353.3陆文浩,陈辉,王习达.异育银鲫致病性鲍曼不动杆菌的鉴定和系统发育分析 J.中国兽医科学,2 0 0 9(39):303 309.4顾泽茂,柳阳，陈昌福.鲍曼不动杆菌斑点叉尾株的分离与鉴定 J.华中农业大学学报，2 0 10（2 9）：489 493.5陈永林,张成林,胥哲.大熊猫不动杆菌病的病原鉴定 J.中国兽药杂志，2 0 0 1,35（4）：35-36.6邱立，王兴龙,郝华芳，等.仔猪鲍曼不动杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 J.中国预防兽医学报,2 0 12,34(11):882-885.7张琰杰,唐宁,刘靖森,等.死胚中鲍曼不动杆菌的分离鉴定及其致病性和耐药性分析J.黑龙江畜牧兽医,2 0 2 0,(2 4):0 154.8吴白,刘丹丹,陈玉，等.麻鸭源性鲍氏不动杆菌的分离与鉴定 J.山东畜牧兽医,2 0 12,33（5）：11-12.9钟世勋,李兵,王迪，等.山羊鲍曼不动杆菌分离鉴定和病原性研究J.中国预防兽医学报，2 0 14，36(008):632 635.10李能章,邱荣蓉,牛娟，等.1株感染肉牛的鲍氏不动杆菌的分离与鉴定 J.安徽农业科学,2 0 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2)：224-228.探讨畜牧业基层生产统计工作存在问题和建议杨丽，何家宇，黄江鸿，黄钰英,陆之泽（1.广西南宁市武鸣区水产畜牧兽医技术推广站，广西武鸣530 19 9；2.广西南宁市武鸣区城厢镇水产畜牧兽医站，广西武鸣530 19 9)中图分类号：S8-05文献标识码：B文章编号：10 0 2-52 35(2 0 2 3)0 4-0 153-0 2doi:10.3969/j.issn.1002-5235.2023.04.003畜牧业生产统计是畜牧部门一项重要的基础性工作，是农林牧渔生产统计工作的重要组成部分，畜牧业生产基础统计数据一般来源于镇、村级统计员等基层信息员调查收集和上报，基础数据准确全面、客观，可以直观反应当地畜牧业生产水平，是当地政府和主管部门等制定科学合理决策管理的依据。基层畜牧业生产统计是制定当地畜牧业发展政策的重要依据，是帮助养殖户积极应对市场变化及时调整生产的指南针，对政府部门宏观指导当地畜牧业生产工作具有重大意义。长期以来基层畜牧统计工作受重视程度不够、统计任务重、基层统计员老龄化、机构改革、人员变动、补助资金不足等因素制约，出现了基层统计数据不实、质量不高、不及时上报等问题。本文分析了基层畜牧业生产统计工作存在的主要问题，提出几点工作建议，供畜牧业生产统计人员参考，以促当地畜牧业健康持续发展。1畜牧业生产统计工作的主要问题1.1对畜牧业生产统计不够重视个别领导未充分认识到畜牧业生产统计工作的重要性和复杂性，以为就是简单的核查上报，殊不知统计报表数量之多，养殖场（户）数量之众，只收稿日期：2 0 2 2-12-15安排少量人员负责统计业务。此外，基层统计员身兼多职，对各类生产统计报表工作不够重视，责任心不强，缺乏主动性和自觉性，往往无法主动及时统计上报生产数据，有时候只是随便报个数敷衍了事，严重影响数据的真实性。1.2统计报表数量多，统计工作任务重畜牧业生产报表分为日报、周报、月报、季报、年报等，样式繁多。统计信报表多，武鸣区各种畜牧兽医行业统计报表达18 种，每种报表统计口径要求又大不相同，这些报表信息大部分都需要从村级防治员调查收集信息，再加上武鸣区畜牧业规模养殖场（户）基数大，统计任务之繁重可想而知。1.3基层畜牧业生产统计队伍力量相对薄弱基层畜牧业生产统计的村级调查员多为村级防治员，据统计武鸣区现有村级防治员2 55名，其中6 0 岁以上的占比高达6 0%以上，老龄化严重，对新的统计要求、内容等掌握不到位，无法有效地开展统计工作，部分防治员已无法胜任统计工作重任。此外大部分防治员还要兼顾农活、外出务工等，无法抽出充足的时间深人养殖场（户）现场核查，上报数据容易出现逻辑性错误，严重影响基层数据的准确性。1.4统计工作经费缺乏，工作上主动积极性不高上级部门专门用于畜牧业生产统计工作的经费很少，只有县（区）的几万元补助经费，负责采集填报周报、月报、季报、年报等数据信息，根据工作