人参炔三醇抑制氧化低密度脂蛋白诱导泡沫细胞形成的作用机制研究.pdf

1502摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 8基础研究基金项目:国家自然科学基金(82074050)作者单位:100029摇 北京中医药大学中医药研究院中药现代研究中心靳凤玉(硕士研究生)、赵一慕、高云、阴紫钰、马家乐、王凌潇、赵云芳、郑姣,中药学院靳凤玉(硕士研究生)、赵一慕、高云、阴紫钰、马家乐、王凌潇作者简介:靳凤玉(1996-),2020 级在读硕士研究生。研究方向:中药药理研究。E鄄mail:通信作者:郑姣(1980-),研究员,硕士生导师。研究方向:中药药理研究。Email:人参炔三醇抑制氧化低密度脂蛋白诱导泡沫细胞形成的作用机制研究靳凤玉摇 赵一慕摇 高云摇 阴紫钰摇 马家乐摇 王凌潇摇 赵云芳摇 郑姣揖摘要铱摇 目的摇 探讨人参炔三醇(panaxytriol,PXT)抑制氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,oxLDL)诱导单核巨噬细胞脂质沉积的作用机制。方法摇单核细胞 THP鄄1 经佛波酯(phorbol鄄12鄄myristate鄄13鄄acetate,PMA)诱导成巨噬细胞后,采用不同浓度(0、1、5、10、20 滋mol/L)PXT 处理单核巨噬细胞 24 小时,通过 MTT 法检测其对细胞存活率的影响。THP鄄1 单核巨噬细胞经PMA 刺激后,利用 oxLDL 诱导脂质蓄积,PXT 处理后利用流式细胞仪,荧光显微镜和油红 O 染色检测巨噬细胞对 oxLDL 的摄取。采用 Western blot 检测细胞内白细胞分化抗原 36(cluster ofdifferentiation,CD36)、三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(ATP鄄binding cassette transporter A1,ABCA1)、清道夫受体 B1(scavenger receptor class B type 1,SRB1)的蛋白表达水平变化。结果摇MTT 实验结果显示,与正常组比较,20 滋mol/L PXT 处理 THP鄄1 单核巨噬细胞 24 小时后显著抑制了细胞活力(P0.05),且其他浓度对细胞活力均无显著影响。流式细胞检测、细胞荧光成像和油红 O 染色结果显示,与模型组比较,PXT 浓度依赖地降低巨噬细胞内 DiI鄄oxLDL 荧光强度与细胞内脂质蓄积(P0.05)。Western blot 结果显示,与模型组比较,PXT 浓度依赖地降低了巨噬细胞中 CD36 蛋白的表达(P0.05),而对其他蛋白无显著影响。结论摇 PXT 通过抑制清道夫受体 CD36 的表达,抑制巨噬细胞对 oxLDL 的吞噬及泡沫细胞的形成,具有潜在的抗动脉粥样硬化活性。揖关键词铱摇 氧化低密度脂蛋白;摇 泡沫细胞;摇 人参炔三醇;摇 白细胞分化抗原 36;摇 三磷酸腺苷结合盒转运体 A1;摇 清道夫受体 B1揖中图分类号铱摇 R285.5摇 揖文献标识码铱摇 A摇 doi:10.3969/j.issn.1674鄄1749.2023.08.003Panaxytriol suppressed the OxLDL鄄induced lipid accumulation in macrophagesJIN Fengyu,ZHAO Yimu,GAO Yun,YIN Ziyu,MA Jiale,WANG Lingxiao,ZHAO Yunfang,ZHENG JiaoBeijing Research Institute of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,Chi鄄naCorresponding author:ZHENG Jiao,E鄄mail:揖Abstract铱摇Objective摇The aim of this study is to explore the effect and possible mechanism ofPanaxytriol(PXT)on inhibiting lipid deposition in the THP鄄1 macrophages induced by oxidized lowdensity lipoprotein(oxLDL).Methods摇 THP鄄1 monocytes were induced to differentiate into macrophagesby phorbol鄄12鄄myristate鄄13鄄acetate(PMA).Macrophages were then treated with different concentrations ofPXT(0,1,5,10,20 滋mol/L)for 24 hours,and the cell viability was detected by the MTT.THP鄄1macrophages was induced by DiI labeled oxLDL(DiI鄄oxLDL),then the effect of PXT on lipid deposition inthe macrophages was investigated by fluorescence microscope,flow cytometry,and oil red O staining.环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81503摇Moreover,the expressions of cluster of differentiation 36(CD36),ATP鄄binding cassette transporter A1(ABCA1),and scavenger receptor class B type 1(SRB1)were confirmed by Western blot.Results摇Compared with the control group,PXT displayed cell cytotoxicity when its concentration was more than20 滋mol/L(P0.05).Compared with the model group,the data of flow cytometry,cell fluorescenceimaging,and oil red O staining showed that PXT down鄄regulated the lipid accumulation concentration鄄de鄄pendently in the oxLDL鄄induced THP鄄1 macrophages(P0.05).Results of Western blot indicated thatPXT significantly reduced the expressions of CD36 protein in THP鄄1 macrophages(P98%。用二甲基亚砜溶解后,置于-20益冰箱储存,实验时用 1640培养基溶解为所需浓度。1.2摇 细胞急性单核细胞白血病细胞(THP鄄1)购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(资源编号:1101HUM鄄PUMC000057)。1.3摇 试剂与仪器RPMI鄄1640 培养基(Corning 公司);0.25%胰蛋白酶(Corning 公司);100 青霉素链霉素混合溶液(Corning 公司);胎牛血清(Corning 公司);氧化低密 度 脂 蛋 白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)(广州奕源生物科技有限公司);DiI鄄oxLDL(广州 奕 源 生 物 科 技 有 限 公 司);二 甲 基 亚 砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(Sigma 公司);佛波酯(PMA)(Sigma 公司);甲醇(天津市致远化学试剂有限 公 司);脱 脂 奶 粉(BD 公 司);PVDF 膜(Millipore 公司);ECL 化学发光液(Thermo FisherScientific 公司)。三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(ATP鄄bindingcassettetransporterA1,ABCA1)(NB400鄄105,Novus Biologicals);CD36(#14347,CellSignalingTechnology);GAPDH(60004鄄1鄄Ig,Proteintech);SRA1(ab183725,Abcam);SRB1(ab52629,Abcam);抗兔 IgG鄄HRP 二抗(#7074,CellSignaling Technology);抗鼠 IgG鄄HRP 二抗(sc鄄2005,SantaCruz)。1.4摇 细胞培养THP鄄1 细胞用含有 10%胎牛血清,1%青霉素和链霉素的 1640 完全培养基,于 37毅C,含 5%CO2体积分数的饱和湿度培养箱内培养,细胞密度达到80%90%时需要进行传代,传代比例为 1 颐 6,每3 4天传代一次。1.5摇 PMA 诱导 THP鄄1 细胞分化及细胞毒性试验处于对数生长期的 THP鄄1 细胞以 5伊104个/mL的密度接种到 96 孔板,以 100 nmol/L 的 PMA 刺激48 小时使其分化为巨噬细胞,设空白组(只含培养基)、正常组(含有细胞和培养基),给药组分别给予1504摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81 滋mol/L、5 滋mol/L、10 滋mol/L、20 滋mol/L PXT,每组设 6 个复孔,边缘用 PBS 填充,置于培养箱中培养 24 小时。弃去培养基后,以 PBS 清洗一次,加入MTT 溶液继续于培养箱培养 4 小时,之后加入150 滋L DMSO,振荡 10 分钟,于 490 nm 波长下检测各孔的吸光度值,并计算各组细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(正常组孔吸光度值-空白孔吸光度值)伊100%1.6摇 流式细胞术、荧光显微成像检测脂质摄取处于对数生长期的 THP鄄1 细胞以 5伊105个/mL的密度接种到 96 孔板,以 100 nmol/L 的 PMA 刺激48 小时使其分化为巨噬细胞,每组设 3 个复孔,除正常组外,均加入 50 滋g/mL DiI 荧光标记氧化低密度脂蛋白(DiI鄄oxLDL)诱导泡沫细胞形成,加入不同浓度 PXT(0 滋mol/L、1 滋mol/L、5 滋mol/L、10 滋mol/L)共同孵育 24 小时,之后经过 PBS 洗涤 3 次,利用倒置荧光显微镜观察各组细胞内的 DiI鄄oxLDL 荧光,利用 Image J 软件对各组细胞内荧光强度进行定量分析。或各孔经清洗后胰酶消化,吹打成单细胞悬液,利用流式细胞仪分析细胞中的荧光强度。1.7摇 油红 O 染色测定细胞脂质沉积按照 1.6 所述方法铺板,PMA 刺激细胞分化,每组设置 3 个复孔,除正常组外,加入 50 滋g/mLoxLDL 诱 导 泡 沫 细 胞 形 成,不 同 浓 度 的 PXT(0 滋mol/L、1 滋mol/L、5 滋mol/L、10 滋mol/L)共同孵育 24 小时。弃去孔内培养基,用 PBS 清洗三次后,多聚甲醛固定 10 分钟,再用 PBS 清洗 3 次,加入60%异丙醇进行分化,最后用油红 O 染色 30 分钟,对细胞内脂质进行染色,洗去浮色后,在光学显微镜下观察各组细胞内的红色脂滴,确认细胞内脂质沉积情况,利用 Image J 软件对各组细胞内脂滴面积进行定量分析。1.8摇 Western blot 检测蛋白表达水平处于对数生长期的 THP鄄1 细胞以 1伊106个/mL的密度接种到 6 孔板,以 100 nmol/L 的 PMA 刺激48 小时使其分化为巨噬细胞,除正常组外,加入50 滋g/mL oxLDL 诱导泡沫细胞形成,同时采用不同浓度的 PXT(0 滋mol/L、1 滋mol/L、5 滋mol/L、10 滋mol/L)共同孵育 24 小时。加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,99益 加热变性 10 分钟。采用恒压 100 V 进行电泳,电转条件为恒流 400 mA,90分钟。电转结束后,用含 5%脱脂奶粉的 TBST 低温封闭 90 分钟。经 TBST 清洗后,进行抗体孵育,一抗 4益孵育过夜,TBST 洗涤条带,二抗孵育 4 小时,进行化学发光显影,实验重复 3 次。1.9摇 统计方法数据结果利用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计分析,所有数据均为计量资料,经检验均符合正态分布且方差齐,以均数依标准差(x依s)表示,各组间 数 据 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析(One鄄wayANOVA),P0.05 表示差异具有统计学意义。2摇 结果2.1摇 PXT 对 THP鄄1 单核巨噬细胞的毒性作用与正常组相比,PXT 低、中、高剂量组细胞活性均无明显的差异,而 PXT 最高剂量组细胞活性明显降低(P0.05)(表 1),因此后续实验的给药浓度均低于 10 滋mol/L。表 1摇 人参炔三醇对 THP鄄1 巨噬细胞存活率影响(x依s,n=6)组别给药浓度(滋mol/L)细胞存活率(%)正常组0100.00依13.34PXT 低剂量组197.74依6.00PXT 中剂量组5104.20依13.23PXT 高剂量组1091.67依7.86PXT 最高剂量组2071.90依6.24a注:与正常组相比,aP0.05。2.2摇 流式细胞仪检测细胞对 DiI鄄oxLDL 的摄取利用 DiI鄄oxLDL 孵育 PMA 诱导后的 THP鄄1 细胞,通过检测细胞内 DiI 荧光强度,确定细胞内脂质含量。流式细胞荧光检测发现,与正常组相比,模型组细胞中 DiI鄄oxLDL 含量显著增加(P0.05),与模型组比较,PXT 中、高剂量组细胞内的荧光强度显著降低(P0.05)(图 1,表 2),表明 PXT 可以剂量依赖地降低细胞中脂质含量,通过抑制巨噬细胞对脂质的吞噬,从而抑制泡沫细胞的形成。表 2摇 人参炔三醇对巨噬细胞 DiI鄄oxLDL 沉积的影响(x依s)组别nDiI 荧光强度(%)正常组30.00依0.00模型组3100.00依4.33aPXT 低剂量组3111.10依6.46PXT 中剂量组349.61依3.62bPXT 高剂量组310.52依7.30b注:与正常组相比,aP0.05;与模型组相比,bP0.05。环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81505摇注:A 正常组;B 模型组;C PXT 低剂量组;D PXT 中剂量组;E PXT 高剂量组。图 1摇 人参炔三醇对巨噬细胞 DiI鄄oxLDL 沉积的影响2.3摇 荧光显微镜观察细胞对 DiI鄄oxLDL 的摄取利用倒置荧光显微镜观测细胞内 DiI 荧光强度,确定细胞内脂质含量,之后利用 Image J 软件进行定量分析。细胞荧光成像结果与流式细胞检测结果一致,与正常组比较,模型组细胞中 DiI鄄oxLDL 含量显著增加(P0.05),与模型组比较,PXT 中、高剂量组细胞中荧光减少且具有显著性差异(P0.05)(图 2,表 3),证实 PXT 可以抑制泡沫细胞的形成。表 3摇 PXT 对 DiI鄄oxLDL 诱导的巨噬细胞脂质摄取的影响(x依s,n=6)组别细胞中 DiI 荧光强度(%)正常组0.00依0.00模型组100.00依6.17aPXT 低剂量组70.78依5.90PXT 中剂量组55.82依5.94bPXT 高剂量组44.56依4.29b注:与正常组比,aP0.05;与模型组比,bP0.05。2.4摇 油红 O 染色测定泡沫细胞脂质含量油红 O 可将细胞内的脂质染成红色,利用Image J 软件对红色脂滴进行定量分析,与正常组比较,模 型 组 巨 噬 细 胞 内 脂 滴 数 量 明 显 增 加(P0.05),而 PXT 能够剂量依赖性地降低 oxLDL诱导的巨噬细胞内脂质蓄积(见图 3,表 4)。图 2摇 PXT 对 DiI鄄oxLDL 诱导的巨噬细胞脂质摄取的影响1506摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 8图 3摇 油红 O 染色检测 PXT 对 THP鄄1 脂质沉积的影响表 4摇 油红 O 染色检测 PXT 对 THP鄄1脂质沉积的影响(x依s,n=3)组别细胞内脂质含量(%)正常组11.82依2.33模型组100.00依25.75aPXT 低剂量组67.17依4.76PXT 中剂量组47.62依5.60bPXT 高剂量组29.64依5.79b注:与正常组比,aP0.05;与模型组比,bP0.05。2.5摇 PXT 对 THP鄄1 单核巨噬细胞脂质转运相关蛋白表达的影响在泡沫细胞发生的过程中,巨噬细胞通过清道夫受体 CD36、SR鄄A1 和 LOX1 吞噬 oxLDL3鄄5,通过胆固醇逆向转运相关蛋白 ABCA1、ABCG1、SR鄄B1促进脂质的外排6鄄8。因此我们利用 Western blot 对脂质吞噬和外排两方面蛋白的表达进行研究,发现PXT 抑制泡沫细胞形成过程中的作用靶标。实验结果发现,与正常组相比,oxLDL 可显著上调清道夫受体蛋白 CD36 的表达水平(P0.05),与模型组比较,PXT 高剂量显著抑制了 CD36 的蛋白表达水平(P0.05)(见图 4,表 5),而 PXT 对 ABCA1、SRA1、SRB1 等蛋白的表达无明显影响。图 4摇 PXT 对巨噬细胞脂质转运蛋白表达的影响3摇 讨论近年来,动脉粥样硬化的发病率明显上升,由此引发的冠心病、脑卒中等心脑血管疾病成为死亡的首要原因。中医认为,动脉粥样硬化的发病机制与“脉痹冶相吻合9,10,故临床中多采取益气活血、化 痰 祛 瘀 为 主 要 治 法11,12。人 参 皂 苷Rb113、Rd14、Rg115以及化合物 K16均表现出良好的抗动脉粥样硬化活性,尤其在改善动脉粥样硬化的发生发展、抑制动脉粥样硬化斑块的形成、延缓心血管疾病的发病等方面具有重要作用,但是人参炔醇类成分对于动脉粥样硬化的治疗活性尚未见报道。表 5摇 PXT 对巨噬细胞脂质转运蛋白表达的影响(x依s,n=3)组别给药浓度(滋mol/L)CD36/GAPDHABCA1/GAPDHSRB1/GAPDHSRA1/GAPDH正常组00.54依0.130.29依0.121.20依0.130.92依0.18模型组00.97依0.09a1.01依0.101.07依0.180.93依0.06PXT 低剂量组10.92依0.070.69依0.101.01依0.110.82依0.07PXT 中剂量组50.81依0.080.68依0.030.89依0.140.78依0.07PXT 高剂量组100.72依0.08b0.72依0.050.95依0.150.62依0.10注:与正常组比,aP0.05;与模型组比,bP0.05。环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81507摇摇 摇 泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化斑块形成和发展的重要标志,在动脉粥样硬化病变中靶向干预泡沫细胞形成可能是预防和治疗动脉粥样硬化的一种有前景的方法17。当巨噬细胞胆固醇流入和酯化增加而流出减少时,会导致泡沫细胞的形成18,19,胆固醇稳态的破坏可能导致斑块坏死核心内的晶体积聚,导致机械损伤和斑块破裂。油红 O染色、流式细胞术均显示 oxLDL 能够诱导巨噬细胞分化成为泡沫细胞,致使脂质在泡沫细胞中大量蓄积,而 PXT 显示出抑制泡沫细胞中的脂质蓄积的药理活性。泡沫细胞中脂质含量的减少可能原因有两个方面,一是胆固醇摄取减少,二是通过胆固醇逆向转运,使细胞中胆固醇流出到细胞外20。为探讨PXT 如何影响泡沫细胞脂质转运过程,于是对参与胆固醇转运的受体进行研究,研究发现 PXT 能够抑制 CD36 的表达水平,而对其他脂质转运蛋白无显著影响。CD36 在巨噬细胞泡沫化过程中的发挥重要作用21,其能介导过量的 oxLDL 摄取、内化,从而促进动脉粥样硬化的发生和发展。上述结果表明PXT 是通过减少脂质摄取,而不是通过促进胆固醇逆向转运,抑制泡沫细胞内脂质蓄积。以上结果提示 PXT 具有抑制巨噬细胞脂质蓄积的药理活性,其机制可能与通过抑制 CD36 的表达,抑制巨噬细胞泡沫化有关,具体的调控机制还需进一步研究。参考文献1摇 Tabas 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